Material vegetal

El manzano es comúnmente propagado a través de técnicas como enraizamiento de estacas o esquejes, injertos entre otras; sin embargo, se decidió implementar la técnica de cultivo de tejidos vegetales debido a la lejanía de los árboles donantes y la dificultad de dar seguimiento a cualquiera de las técnicas mencionadas. Con esta técnica se pueden emplear diferentes fuentes de material vegetal como yemas, explantes entre otras, no obstante, en la presente investigación se optó por el uso de embriones cigóticos maduros a partir de la semilla.

La obtención de material vegetal se realizó a partir de la selección de frutas de manzano (Malus domestica) con características fenotípicas deseadas, visiblemente sanas y sin plagas, recolectadas de árboles asilvestrados del municipio de Nuevo Ideal, Durango durante la época de cosecha del año 2015. Se extrajeron las semillas en laboratorio y se mantuvieron en refrigeración a una temperatura de 4 °C en frascos estériles cerrados herméticamente. Para su establecimiento en medio de cultivo, previamente la semilla fue desinfectada con etanol al 70%, hipoclorito de sodio al 20% y agua destilada estéril. El experimento se desarrolló en dos fases: a) germinación y producción de brotes; y b) enraizamiento.

Germinación y producción de brotes

Se efectuó un corte sobre la parte longitudinal de la testa de la semilla, para en seguida retirar el tegmen y dejar el embrión y cotiledones expuestos en contacto directo con el medio de cultivo. Se propusieron 14 tratamientos compuestos por 25 repeticiones cada uno, para evaluar la germinación y la producción de brotes adventicios, para lo cual se utilizaron los medios de cultivo ^{Murashige y Skoog, (1962}) (MS) y el woody plant medium (WPM) (^{Mc Cown y Lloyd, 1981}), complementados con reguladores de crecimiento como 6-Bencilaminopurina (BAP) como citocinina y ácido indol butírico (IBA) como auxina en diferentes dosis. Se consideraron dos tratamientos testigo, uno de cada medio de cultivo sin la adición de reguladores de crecimiento (T1 y T8) (Cuadro 1). Se añadió al medio de cultivo 25 g L^-1 de sacarosa y 5.5 g L^-1 de agente gelificante (agar) ajustando el pH a 5.7 antes de ser esterilizados en autoclave durante 20 min a 115 °C y 1.5 kg cm^-².

El establecimiento se realizó bajo condiciones asépticas utilizando una cámara de flujo laminar e instrumentos estériles. Los embriones se colocaron en frascos de vidrio con 25 ml de medio de cultivo correspondiente a los tratamientos. Posteriormente se trasladaron a la cámara de cultivo en condiciones de oscuridad durante los primeros siete días, a partir del día ocho, se sometieron a un fotoperiodo de 16 h luz y ocho h de oscuridad a una temperatura constante de 25 ±2 ºC. Las variables evaluadas en esta etapa fueron: porcentaje de germinación, número de brotes, altura de la plántula (mm), desarrollo foliar (número de hojas) y diámetro del tallo (mm) mediante análisis morfológico aplicando la técnica de análisis de imagen descrita por ^{González et al. (2005}).

Enraizamiento

A los 60 días, los brotes producidos en la etapa anterior fueron llevados a la fase de enraizamiento. Se establecieron en medio de cultivo MS y WPM reducido al 50% de sus nutrientes como describe Guadie (2011), adicionados con diferentes dosis de reguladores de crecimiento a base de auxinas y citoquininas como: ácido naftalenalacético (ANA), ácido indol acético (AIA) y ácido indol butírico (IBA), con o sin combinación con citoquininas: 6- bencil aminopurina (BAP) y kinetina (KIN). Se consideraron dos tratamientos testigo, uno de cada medio de cultivo sin la adición de reguladores de crecimiento (T1 y T8) (Cuadro 2). Las variables evaluadas fueron: porcentaje enraizamiento y longitud de raíz (mm) mediante análisis morfológico a los 30 días de iniciada esta fase.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 14 tratamientos y 25 réplicas cada uno, los resultados se evaluaron mediante el análisis estadístico de Kruskall Wallis. Los datos obtenidos se sometieron al análisis de varianza con la prueba de Wilcoxon, con el paquete estadístico R versión 3.2.2.

Germinación y formación de brotes

La germinación promedio obtenida en los tratamientos, fue de 32.3% a los 60 días del establecimiento de la semilla in vitro. No obstante, con el tratamiento compuesto por medio de cultivo MS suplementado con 0.5 mg L^-1 de BAP (T2) se obtuvo el mayor porcentaje de semillas germinadas (56%), lo cual concuerda con la investigación desarrollada por ^{Rustaei et al. (2009}), quienes trabajaron con Malus domestica. Debido a que en esta investigación se utilizaron plantas donantes silvestres las cuales carecían de condiciones rigurosas de sanidad, el protocolo de desinfección no resultó tan efectivo en algunos tratamientos debido a que se presentó un promedio de 31.7% de contaminación por hongo y bacteria sin identificar. Lo anterior coincide con lo establecido por ^{Da Câmara et al. (1991)}; ^{Keresa et al. (2012}), quienes argumentan que el establecimiento del material vegetal depende en gran medida al cuidado fitosanitario de las plantas donante de semillas (Figura 1).

Figura 1 Porcentaje de germinación, contaminación y semilla sin respuesta de M. domestica a los 60 días del establecimiento en medio de cultivo. 

La situación observada en este experimento coincide con lo argumentado por ^{Soni et al. (2011}), quienes señalan que es menos probable encontrar explantes contaminados recolectados en verano, mientras que los explantes recolectados en primavera, otoño e invierno muestran mayor porcentaje de contaminación, que va desde un 12 a 54%. Por lo anterior, es importante implementar tratamientos preventivos de desinfección de la planta donante, pues a pesar de la existencia abundante de protocolos de asepsia, hay microorganismos de difícil control que pueden llegar a albergarse en las partes internas del fruto y haces vasculares por la presencia de contaminantes endógenos adquiridos por la planta en su ambiente natural, lo que explica la incidencia de contaminantes en este experimento.

Los resultados indicaron buena inducción de brotes; sin embargo, se detectó variación en la cantidad de éstos según el tipo y dosis del regulador de crecimiento aplicado. La dosis de 1.5 mg L^-1 de BAP (T3 y T10), presentaron la mayor cantidad de brotes por explante (36 brotes cada uno respectivamente) (Figura 2 y 3) independientemente del medio de cultivo en el que se estableció.

Figura 2 Producción in vitro de brotes adventicios de M. domestica en dos medios de cultivo a los 60 días después al establecimiento: A) T3 (MS con 1.5 mg L ^-1 de BAP); B) T10 (WPM con 1.5 mg L ^-1 de BAP. 

Figura 3 Número de brotes por planta de M. domestica producida in vitro en dos medios de cultivo y diferentes dosis de reguladores de crecimiento. 

Aunque la respuesta fue la misma en ambos medios con la dosis señalada, se observó que el medio de cultivo influyó de forma importante en el desarrollo vegetativo, ya que, en las variables de altura de planta, diámetro del tallo y número de hojas, el medio de cultivo MS presentó los mejores resultados (Figuras 4, 5 y 6). Algunos autores han propuesto diferentes dosis de reguladores de crecimiento en los medios de cultivo aquí evaluados (^{Vilchez et al., 2014}; ^{Montes-Salazar et al., 2016}), donde se argumenta que el medio de cultivo WPM se utiliza para especies leñosas (^{Mc Cown y Lloyd, 1981}). Sin embargo, el medio de cultivo MS se considera un medio basal de amplio espectro que se puede utilizar en diferentes tipos de plantas con resultados favorables. A diferencia de otras investigaciones sobre propagación in vitro en especies, en este trabajo el medio de cultivo WPM se vio superado por el medio de cultivo MS en la mayoría de las variables evaluadas.

^{Hoyos et al. (2008}), reportaron que esta hormona estimula el desarrollo de los brotes laterales, la multiplicación celular en los meristemos apicales y expansión de las hojas. Asimismo, argumentan que, al no presentar raíces, el explante no tiene la capacidad de sintetizar BAP, por lo cual, es fundamental su adición en la etapa de multiplicación.

Por su parte ^{Dalal et al. (2006}), argumentan resultados similares en la multiplicación de portainjertos de manzana (M9), donde observaron un notable incremento de la formación de brotes múltiples por ramificación axilar en medio MS suplementado con BAP 2.22 μM, IBA 0.49 μM y Kn de 2.32 μM, logrando una tasa de multiplicación 4:1. Este comportamiento se debe a la presencia de citocinina BAP, la cual tiene un efecto directo sobre la generación de brotes.

Así mismo, ^{Murashige (1974}); ^{Chaturvedi et al. (2004}), enfatizan que la hormona BAP establece una superioridad en la inducción de brotes axilares en especies leñosas. Por su parte, ^{Kepenek y Karoǧlu (2011)}, aumentaron la tasa de multiplicación en el portainjerto M9 y las variedades ‘Starking Delicious’ y ‘Amasya’ cuando aplicaron retardadores de crecimiento (paclobutrazol y daminozida), pero estos se atrofiaron provocando un efecto nulo en el desarrollo de raíz.

Altura de planta

Los resultados del análisis de varianza indican que los valores de altura de planta y número de hojas obtenido a 60 días no mostraron diferencia significativa (p≥ 0.05) entre los medios de cultivo MS y WPM. La única variable que presentó significancia fue el diámetro de tallo (Cuadro 3).

Aunque el análisis no presentó diferencias significativas entre medios de cultivo, se observó que se produjeron plantas de diferentes tamaños, presentando mayor altura las plantas con el medio MS destacando el T3 (1.5 mg L^-1 de BAP), el cual obtuvo un promedio de 27.59 mm y el T4 (0.5 mg L^-1 de IBA) con 27.36 mm (Figura 4).

Figura 4 Altura de planta de a los 60 días del establecimiento in vitro de M. domestica en dos medios de cultivo adicionados con diferentes dosis de reguladores de crecimiento. 

Desarrollo foliar

El análisis estadístico no reportó diferencia significativa (p≥ 0.05) entre tratamientos respecto a esta variable según la prueba de Kruskall Wallis para datos no paramétricos. Sin embargo, se observó que el T3 (MS con 1.5 mg L^-1 BAP) destacó con la mejor respuesta de generación foliar al producir 21.07 hojas en promedio (Figura 5). Un buen desarrollo foliar incrementa la posibilidad de captar de mejor manera la luz solar, lo que hace más eficiente el proceso fisiológico de la elaboración de carbohidratos a través de la fotosíntesis, lo que permitirá su adaptación al medio abierto en su etapa de aclimatación en menor tiempo que las plantas que producen una cantidad escasa de hojas (^{Valladares y Niinemets, 2008}).

Figura 5 Número de hojas por planta de M. domestica en dos medios de cultivo adicionados con diferentes dosis de reguladores de crecimiento. 

Diámetro del tallo

Los valores de diámetro de tallo de las plantas obtenido a los 60 días se comportaron de manera significativa estadísticamente (p≥ 0.05) entre los medios de cultivo MS y WPM . El T2 (MS con 0.5 mg L^-1 de BAP), superó a los demás tratamientos en esta variable, con una media de 2.5 mm, mostrando heterogeneidad en diámetro de tallos (Figura 6).

Figura 6 Diámetro de tallo de M. domestica a los 60 días después del establecimiento in vitro en dos medios de cultivo con diferente dosis de reguladores de crecimiento. 

Enraizamiento y longitud de raíz

En esta etapa se logró 100% de generación de raíz en todos los tratamientos evaluados. Para evaluar su respuesta, se combinó auxina en mayor proporción respecto a la dosis de las citocininas (10:1) (Cuadro 2). El efecto de los tratamientos con medio de cultivo WPM sobresalieron de los tratamientos con medio de cultivo MS al momento de inducir el enraizamiento, siendo la dosis de 1.5 mg L^-1 de IBA y 0.15 mg L^-1 de KIN (T12) el que más raíces produjo, seguido del T11 cuya dosis fue de 0.5 mg L^-1 y 0.05 mg L^-1 de IBA y KIN respectivamente en el mismo medio de cultivo (Figura 7). Reducir al 50% la concentración de nutrientes de los medio MS y WPM fue fundamental en esta respuesta morfológica para la especie (^{Hartmann et al., 2004}; ^{Dalal et al., 2006}; ^{Gaudie, 2011}).

Figura 7 Número de raíces por planta de M. domestica producida in vitro con dos medios de cultivo y diferentes dosis de reguladores de crecimiento. 

Es bien conocido que la presencia de auxinas es necesaria para la formación de raíz; no obstante, su presencia en el medio de cultivo por tiempo prolongado puede inhibir el desarrollo de raíces adventicias (^{Dobránszki y Teixeira Da Silva, 2010}), situación que se asume pudo haber afectado a los demás tratamientos según el tipo y dosis del regulador de crecimiento.

De acuerdo con la prueba de Wilcoxon, se pueden diferenciar tres resultados relevantes de los 14 tratamientos evaluados, el T10 (WPM con 1.5 mg L^-1 de ANA y 0.15 mg L^-1 de BAP), mostró un alargamiento promedio de la raíz de 90.47 mm (Figura 8). Asimismo, esta prueba mostró que los T13 (WPM con 0.5 mg L^-1 de AIA y 0.05 mg L^-1 de KIN) y T12 (WPM con 1.5 mg L^-1 de IBA y 0.15 mg L^-1 de KIN) mostraron una longitud promedio de 68.35 y 63.93 mm respectivamente.

Figura 8 Longitud de raíz de plantas de M. domestica producida in vitro en dos medios de cultivo y diferentes dosis de reguladores de crecimiento. 

Malus domestica respondió de manera heterogénea a las dosis de hormonas (auxinas) dosificadas (ANA, IBA, AIA), el medio de cultivo suplementado con auxinas ANA mostró niveles superiores en la generación de raíz a los que registraron los tratamientos con IBA y AIA. Este resultado confirma lo reportado por ^{Soni et al. (2011}), quienes argumentan que bajas concentraciones de ANA inducen la formación de raíces en mayor cantidad y mejor desarrollo, que cuando los explantes son expuestos a los reguladores IBA y AIA. Según ^{Druart (1997}), la presencia de auxinas es esencial para promover el enraizamiento, pero que en combinación con citocininas puede potenciar el alargamiento de la raíz.

En contraste con lo anterior, informes sobre porta injertos de manzano ‘Topaz’ reportados por ^{Keresa et al. (2012}), registraron que la hormona IBA estimuló alta densidad de raíz. Por otra parte, ^{Modgil y Thakur (2017}) y ^{Modgil et al. (2017)}, afirman que puede obtenerse un enraizamiento superior al 80% cuando se utiliza IBA que cuando se utiliza ANA, donde este porcentaje es menor.

Asimismo, ^{Amiri y Elahinia (2011}), señalan que la presencia de IBA en el medio de cultivo es esencial para enraizar portainjertos de algunas especies de Malus; sin embargo, esto solo es posible cuando se disminuye el nivel de citoquinina y se aumenta el nivel de auxina. No obstante, en este experimento el T13 mostró menor longitud que los T10 y T12, sin embargo, se observó una raíz más densa (Figura 9), lo que favorece la absorción de nutrientes en la etapa de establecimiento en sustrato para la aclimatación. En contraste con lo anteriormente señalado, ^{Mehta et al. (2014}), aseguran que se puede obtener entre 92 y 98% de enraizamiento de portainjertos MM106 y B9 en medio de cultivo sin el uso de reguladores de crecimiento.

Figura 9 Respuesta de enraizamiento de plantas de M. domestica en medio de cultivo WPM. A) T10 (1.5 mg L ^-1 de ANA y 0.15 mg L ^-1 de BAP); B) T12 (1.5 mg L ^-1 de IBA y 0.15 mg L ^-1 de KIN); C) T13 (0.5 mg L ^-1 de AIA y 0.05 mg L ^-1 de KIN).