Localización del experimento

Los cultivares de albahaca se establecieron el mes de marzo del año 2020 en un invernadero con cubiertas corredizas de plástico y malla anti-áfidos de control semiautomático ubicado en la Universidad Politécnica de Gómez Palacio, Durango 25^° 38’19.83’’ latitud norte, 103^° 31’ 52.12’’ longitud oeste. Los valores de temperatura y humedad relativa del invernadero se mantuvieron entre 25 a 30 °C y 70-80%, respectivamente.

Establecimiento de los cultivares

Se sembraron tres cultivares de albahaca cuya semilla fue proveniente de donaciones de siembras de albahaca orgánica de Baja California Sur (Lemon, Cinnamon y Red Rubin). La siembra se realizó en bandejas de germinación de poliestireno de 250 cavidades y se utilizó peat moss como sustrato. Las bandejas se regaron dos veces al día con agua hasta el día del trasplante. Cuando las plántulas presentaron tres a cuatro hojas verdaderas y una altura de 10 a 15 cm se trasplantaron en macetas de plástico negro de un galón de capacidad, las cuales contenían una mezcla de arena:perlita (80:20).

Preparación de las muestras y obtención de extractos

A 35 días después trasplante se tomaron muestras de hoja de las tres variedades de albahaca hasta obtener muestras de todas las plantas del experimento. Todas las muestras fueron lavadas con agua destilada y se retiró el exceso sobre papel canela. El proceso de secado se realizó a temperatura ambiente (25 ±2 °C) durante 15 días. Después de la deshidratación las muestras pasaron a proceso de molienda hasta obtención de polvo. Este proceso se realizó en licuadora (Hamilton Beach).

Después de ello, las muestras pulverizadas fueron almacenadas a 5 °C para la posterior obtención de extractos (^{Abkhoo y Jhani, 2016}). La obtención de extractos se llevó a cabo mediante la técnica de extracción sólido-líquido mediante la adición de 1 g de cada una de las muestras pulverizadas colocadas en tubos de ensayo. Se añadieron 10 ml de cada uno de los solventes utilizados (hexano, metanol, éter de petróleo, etanol marca Jalmek⁽). Se utilizó un agitador automatizado durante 24 h (Stuart⁽) para mantener la mezcla bajo agitación a temperatura ambiente (25 ±2 °C).

Después del tiempo de agitación se dejaron reposar las muestras en gradilla para el desfase y precipitado de cada muestra. Al observarse la separación se obtuvo el extracto dejando en los tubos la muestra precipitada. Los extractos fueron concentrados para obtener los compuestos de interes con rotavapor (Buchí, modelo-210) y un baño de agua (RIOSA, México) a 35-40 °C. Los extractos obtenidos se almacenaron en ultracongelación a -20 ^oC hasta su análisis (^{Ramírez et al., 2019}).

Cuantificación de fenólicos totales (CFT)

La determinación de compuestos fenólicos totales se realizó por espectrofotometría (equipo Genesys USA 10 UV), basándose en la reacción colorimétrica de óxido-reducción según ^{Zamora (2016}) con algunas modificaciones. A 30 μl de extracto se le agregaron 2 ml de agua destilada, 250 μl de reactivo Folin-Ciocalteu (grado analítico, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA), posteriormente se agregó 1 ml de Na₂CO₃ al 10% p/v y se aforó a 5 ml con agua destilada. Las muestras se leyeron a una longitud de onda de 765 nm después de permanecer 1 h a temperatura ambiente y ausencia de luz. Para el cálculo de fenólicos totales se realizó una curva de calibración con ácido gálico grado analítico (Sigma-Aldrich St. Louis MO, USA). El contenido de fenólicos se expresó en mg AGE g^-1 de PS (mg equivalentes de ácido gálico por gramo de peso seco).

Cuantificación de flavonoides (FVT)

Los flavonoides se cuantificaron mediante un análisis espectrofotométrico (equipo Genesys USA 10 UV) basado en la formación de un complejo entre los iones de Al (III) y los grupos carbonilo e hidroxilo del flavonoide, según lo descrito por ^{Zamora (2016}) con algunas modificaciones. Se mezclaron 50 μl de extracto con 100 μl de AlCl₃ al 5% p/v en etanol, 100 μl de acetato de sodio 1M y se aforó a 5 ml con metanol grado analítico (JT Baker). Los compuestos flavonoides se midieron a una longitud de onda de 425 nm después de 30 minutos de permanecer en ausencia de luz. Previo a la lectura se realizó una curva de calibración con quercetina grado analítico (Sigma-Aldrich St. Louis MO, USA). El contenido de flavonoides se expresa en mg QE g^-1 de PS (mg equivalentes de quercetina por gramo de peso seco).

Determinación de la capacidad antioxidante (AA)

La capacidad antioxidante se midió según la metodología propuesta por ^{Chaves et al. (2016}) con modificaciones. El radical ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid se obtuvo mediante la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato de potasio (K₂S₂O₈) 2,45 mM, posteriormente se aforó con agua a un volumen de 10 ml y se incubó a temperatura ambiente (±25 °C) y en la oscuridad durante 18 h. El radical ABTS se diluyó en etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0.7 (±0.1) a una longitud de onda de 754 nm.

Los extractos se disolvieron en etanol a una concentración de 200 mg L^-1. Después de ello se colocaron en un tubo de ensayo 50 μl de muestra y 1 950 μl de ABTS. Se agitaron durante 1 min y mantuvieron en obscuridad durante 10 min. Posterior a la reacción se leyó la absorbancia a 754 nm (espectrofotometro Genesys USA 10UV). Los resultados se expresan en porcentaje de inhibición en micromoles base Trolox por cada gramo de muestra en peso seco (μmol Trolox g^-1 PS).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo mediante un análisis de varianza utilizando el programa Statistical Release Software 7.0 y la comparación de medias se realizó usando la prueba de Tukey con un valor de significancia de p≤ 0.05. Se utilizó un arreglo factorial 3 x 4 en un diseño completamente al azar, donde los factores fueron: genotipo y solvente de extracción. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento.

Flavonoides totales

Los resultados del contenido de FVT, se muestran en la Figura 1. El contenido de flavonoides en este experimento osciló entre 2.4 y 10.8 mg QE g^-1 PS obteniendo que el solvente con mayor eficiencia para la extracción de estos compuestos fue el metanol para los tres cultivares de albahaca utilizadas, seguido por el solvente éter de petróleo y registrando los solventes etanol y hexano con los menores porcentajes de extracción (38 y 22% respectivamente) con respecto al valor mayor de FVT. Este estudio coincide con los resultados obtenidos por ^{Do et al. (2014}) quienes reportaron que la extracción de flavonoides de plantas estuvo fuertemente influenciada por los distintos solventes utilizados.

Figura 1 Concentración de flavonoides totales en extractos obtenidos por cuatro diferentes solventes de tres variedades de albahaca. Las laterales indican la diferencia significativa entre los distintos solventes de extracción para cada variedad de albahaca estudiada. 

El contenido de FVT en extractos acuosos de flor de M. acuminata (159 45 mg QE 100 g^-1) y P. tetragonolobus (172 44 mg QE 100 g^-1) fue consistente con lo reportado por ^{Ng y See (2019}) (196 3 mg QE 100 g^-1) y ^{Gan et al. (2017}) (185 mg QE 100 g^-1). En comparación con los extractos de agua, el metanol aumentó significativamente el rendimiento de FVT de la flor de M. acuminata (24%) y P. tetragonolobus (73%), mientras que el n-hexano proporcionó el contenido de FVT más bajo en ambas plantas. Los resultados son similares a los obtenidos en este experimento donde el solvente con mayor capacidad de extracción fue el metanol y el de menor eficiencia el hexano.

Los flavonoides son los polifenoles más abundantes con varios grupos hidroxilo fenólicos reactivos en los anillos de benceno (^{Altemimi et al., 2017}), pero también se hace referencia a que las diferencias obtenidas en las diferentes extracciones por cada solvente podrían atribuirse a la variación en la composición bioquímica de la planta donde los fenólicos; en particular, los flavonoides son los principales fitoquímicos extraíbles (^{Joseph et al., 2014}). Haciendo referencia al solvente con mayor capacidad de extracción (metanol) se conoce que tanto en los complejos tanino-proteína, la mayoría de los flavonoides existen en los glucósidos y el metanol favorece la extracción de estos complejos polares de azúcar-flavonoides (^{Ng et al., 2020}).

Compuestos fenólicos totales

Los compuestos fenólicos son ubicuos en la mayoría de las plantas medicinales y constituyen una parte esencial de la dieta humana debido a sus propiedades antioxidantes y muchas otras propiedades beneficiosas para la salud (^{Balasundram et al., 2006}). Los CFT varían entre los valores de 0.2 17.9 mg AGE g^-1 PS, mostrando el rango tan amplio de extracción entre los distintos solventes utilizados para las tres variedades de albahaca analizada. En la Figura 2 se muestra la eficiencia de extracción de cada solvente utilizado para cada variedad de albahaca analizada.

El solvente metanol fue el agente de extracción más eficiente para CFT; los valores de extracción con este solvente oscilaron entre 15.8, 16.7 y 17.9 mg AGE g^-1 PS para las variedades Lemon Cinnamon y Red Rubin respectivamente, seguido por hexano, etanol y éter de petróleo. De acuerdo con la estructura química del hexano se conoce que es un solvente con menor polaridad que el éter de petróleo (^{Nawaz et al., 2020}), lo cual explica porque funciono de manera más eficiente en la extracción de CFT que en la extracción de FVT, ya que de acuerdo con la clasificación de compuestos fenólicos los Flavonoides son un subgrupo de fenoles que no siempre tienen afinidad con los solventes poco polares (^{Nawaz et al., 2020}).

Figura 2 Concentración de compuestos fenólicos totales en extractos obtenidos por cuatro diferentes solventes de tres variedades de albahaca. Las laterales indican la diferencia significativa entre los distintos solventes de extracción para cada variedad de albahaca estudiada. 

Autores como ^{Orlando et al. (2019}), indicaron que los rendimientos de extracción de polifenoles variaron considerablemente entre las diferentes variedades de planta. ^{Salih et al. (2020}) no obtuvieron una buena extracción de polifenoles a partir de muestras maceradas o cocidas al utilizar agua como extractante, en comparación con el uso de metanol y etanol. Sin embargo, el uso de otros solventes conlleva a una extracción óptima de compuestos bioactivos (^{Lezoul et al., 2020}).

En este sentido, la polaridad del metanol es mayor que la del etanol; por este motivo, los ácidos fenólicos muy polares, como el cinámico o el benzoico, podrían extraerse fácilmente, aumentando el contenido de polifenoles totales en los extractos obtenidos (^{Stalikas, 2007}). Lo anterior explica los resultados del presente estudio, ya que cuando se utilizó metanol, la extracción de CFT fue mayor en comparación al resto de los solventes utilizados en las distintas variedades de albahaca.

Actividad antioxidante

En el presente estudio se mostraron propiedades de eliminación de radicales libres y los valores obtenidos mostraron indicadores de capacidades antioxidantes en base a la eliminación del radical libre utilizado en la técnica de ABTS. Se observó que los valores para la actividad de eliminación de radicales libres son mayores cuando el solvente utilizado fue metanol para las variedades de Lemon y Cinnamon, no fue el mismo caso para la variedad Red Rubin ya que estos extractos la mayor eficiencia de actividad antioxidante fue cuando el solvente utilizado fue etanol (Figura 3).

En el Cuadro 1 se menciona que la variedad de albahaca con mayor actividad antioxidante de acuerdo con los promedios arrojados en el análisis estadístico señala que es Cinnamon (249.5(mol Trolox g^-1 PS); sin embargo, cuando se analizan los factores en la interacción se observó que la AA es mayor en la variedad de albahaca Red Rubin cuando el solvente utilizado es etanol con un valor de 409.4 (mol TROLOX g^-1 PS). Cabe destacar que la variedad de albahaca Red Rubin posee características distintas con relación a las otras dos variedades tales como su pigmentación, y la cantidad de metabolitos secundarios que posee (^{Ramírez et al., 2019}).

Figura 3 Concentración micromolar de actividad antioxidante por técnica de ABTS en extractos obtenidos por distintos solventes para tres variedades de albahaca. Las laterales indican la diferencia significativa entre los distintos solventes de extracción para cada variedad de albahaca estudiada. 

En el estudio realizado por ^{Dowlath et al. (2020}) se reportó que no encontraron diferencias significativas entre los solventes de extracción éter de petróleo y cloroformo cuando analizaron los compuestos antioxidantes (CFT y AA) de Cardiospermum halicacabum: sin embargo, estos solventes tuvieron una diferencia significativa con respecto al solvente etanol en la medición de capacidad antioxidante por el método de DPPH. Los anteriores hallazgos coinciden con los obtenidos en este experimento ya que el solvente con mayor eficiencia para eliminación de radicales libres fue el etanol y metanol (^{Dowlath et al., 2020}).

Debido a que el solvente utilizado para la extracción presenta variaciones en la capacidad de eliminación de radicales de los extractos (^{Dhanani et al., 2017}) demuestra la influencia del solvente sobre la actividad antioxidante de los extractos crudos (^{Bhebhe et al., 2016}). Lo que se encuentra respaldado en estudios sobre cáscaras de Macademia tetraphylla, infusiones de hierbas de Limnophila aromatic y Withnaia somnifera (L.), donde existe una fuerte influencia del solvente en la actividad antioxidante de los extractos de plantas (^{Do et al., 2014}; ^{Dailey y Vuong, 2015}). Esta variación de la actividad antioxidante posiblemente puede estar asociada con los compuestos de la planta como constituyentes fenólicos que son solubles en función de la polaridad de los solventes utilizados para la extracción u otros metabolitos secundarios presentes en cada una de las variedades estudiadas (^{Dowlath et al., 2020}).