Cepas de PGPR y medios de cultivo

Las cepas de PGPR se aislaron de la rizosfera del pasto halófito Distichlis spicata L. Las cepas bacterianas utilizadas fueron: LBEndo1, NFbEndo2M2, KBEndo3 y KBEcto4. Las cepas LBEndo1, KBEndo3 y KBEcto4 se caracterizaron como PGPR, estas cepas mejoraron el crecimiento en condiciones estándar y salinas, que se correlacionó con la producción de AIA y sideróforos, así como la solubilización de fosfato (^{Palacio-Rodríguez, 2015}; ^{Espinosa-Palomeque et al., 2017}; Palacio-Rodríguez et al., 2017; ^{González-Rodríguez et al., 2018}; ^{Espinosa-Palomeque et al., 2019}). El stock de cepas de PGPR se almacenó a -70 ºC en glicerol al 30% y antes de utilizarse se cultivaron a 30 ºC y 180 rpm durante la noche en caldo Luria. Las suspensiones bacterianas se ajustaron a 1x10⁸ UFC ml^-1 antes de realizar las inoculaciones a las plantas.

Experimentos en casa sombra

Los experimentos se realizaron en las casas sombra comerciales de la empresa ‘Agrícola Vigo’, Ejido El Pilar, Matamoros, Coahuila. El sitio está ubicado a 25º 72’ 38.33” latitud norte, 103º 32’ 73.08” longitud oeste. Se germinaron semillas de tomate (Solanum lycopersicum L. cv ‘Top1182’) en charolas de trasplante (200 celdas piramidales invertidas de 2.5 x 6.5 cm, longitud lateral x profundidad) llenas de peat moss (Lambert peat moss, Inc, Quebec, Canadá). 43 días después de la germinación, las plántulas se inocularon por inmersión con suspensión bacteriana de 1x10⁸ UFC ml^-1 una por una. Después de tres días de inoculación, las plantas se trasplantaron a casa sombra.

El diseño experimental en la casa sombra se dividió en dos condiciones según la preparación del suelo (caracterizado por ser un suelo arcilloso): la primera, el suelo plano se enriqueció con fibra de coco (15 kg m^-2) y estiércol de ganado compostado (12.5 kg m^-2), hubo cuatro repeticiones de 200 plantas de tomate por cada PGPR inoculada, más una hilera de control con 200 plantas de tomate sin inocular. Para la segunda condición se utilizaron camas de suelo (30 cm de altura), cuatro repeticiones de 200 plantas de tomate por cada PGPR inoculada, más una hilera de control con 200 plantas de tomate sin inocular. Cuadro 1

Todas las plantas de tomate se plantaron en hileras con 18 cm entre plantas de tomate y 1.8 m entre hileras. Las plantas de tomate se regaron por goteo con una solución de fertilizante que contenía (mg L^-1): N 2 311, Ca 626, Mg 1 158, K 723 y micronutrientes 15. Las plantas se reinocularon dos meses después de la primera inoculación al comienzo de la etapa de floración (63 días después del trasplante en casa sombra), la segunda inoculación se realizó utilizando una aspersora manual de mochila de 20 L con 40 ml de 1x10⁸ UFC ml^-1 de cada suspensión bacteriana por planta de tomate.

Parámetros biométricos y rendimientos de tomate

Durante el experimento se tomaron dos muestras, el efecto de PGPR en el crecimiento de la planta se determinó en el primer muestreo; se cosecharon tres plantas por tratamiento y se midió la longitud del brote, peso fresco de la raíz, diámetro del tallo, peso del fruto y número de frutos planta^-1 después de 59 días del trasplante a casa sombra (62 días después de la primera inoculación).

La evaluación del rendimiento y la calidad se determinó en el segundo muestreo, 87 días después del trasplante a la casa sombra (90 días después de la primera inoculación). Se muestrearon aleatoriamente 20 frutos rojos de tomate del total de la cosecha por tratamiento. El tamaño del fruto se determinó midiendo el peso fresco y el diámetro ecuatorial de 20 frutos rojos cosechados. El diámetro ecuatorial de los frutos de tomate se midió con un calibrador (Scala, Inox 222B, México) y se dividió en cuatro categorías de clasificación comercializable: extragrande (>67 mm), grande (54-67 mm), mediano (47-54 mm) y pequeño (<47 mm) según la escala de ^{Jones (1999}). Dos de 20 frutos se cortaron por el diámetro ecuatorial para examinar el tamaño y la apariencia interna. Cuadro 2

Análisis estadístico

Los datos se obtuvieron bajo un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Los datos de los parámetros medidos se analizaron mediante el análisis de varianza Anova con la ayuda del complemento XLSTAT del software Microsoft Excel. Las medias se analizaron mediante diferencia mínima significativa (DMS) a p≤ 0.05.

Identificación molecular de PGPR por ARNr 16S

Las cuatro rizobacterias se identificaron mediante análisis molecular, las rizobacterias LBEndo1 y KBEcto4 se reportaron en ^{Palacio-Rodríguez et al. (2017}). Las rizobacterias NFbEndo2M2 y KBEndo3 se sometieron a un análisis de secuencia del gen ARNr 16S. El ADN se extrajo mediante la técnica CTAB según el método de ^{Doyle y Doyle (1990}). La amplificación parcial del gen ARNr 16S se realizó mediante la técnica de PCR utilizando los oligonucleótidos 27F 5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’ y 1492R 5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’, el producto de PCR se purificó utilizando el kit AxyPrep DNA gel Extraction kit (Axygen) y luego se envió para ser secuenciado a McLAB en San Francisco, CA, EE. UU. Las secuencias obtenidas de la secuenciación se compararon utilizando Blast (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar la taxonomía de las cepas bacterianas (^{Weisburg et al., 1991}; ^{Altschul et al., 1997}).

Efectos en la promoción del crecimiento de plantas de tomate

En este trabajo se estudió el efecto de cuatro cepas de PGPR en el crecimiento de plantas de tomate en condiciones de casa sombra utilizando suelo plano adicionado con fibra de coco y composta y suelo de camas elevadas sin composta. Se observaron aumentos significativos en el peso fresco de la raíz con las inoculaciones de PGPR, en especial con las cepas LBEndo1 y KBEcto4. La inoculación de plantas de tomate con PGPR promovió el crecimiento vegetativo, se observó un aumento del crecimiento en la longitud del brote, el peso de la raíz y el diámetro del tallo.

Aunque no se observaron diferencias marcadas en el aumento de la longitud del brote y el peso de la raíz, el aumento del peso de la raíz por las cepas LBEndo1 y KBEcto4 en condiciones de suelo plano compostado, en un 119.3 y 81.9%, respectivamente, en comparación con las plantas de tomate de control no inoculadas (Cuadro 3 y Figura 1). La raíz de las plantas de tomate inoculadas con PGPR mostró que modificaron la arquitectura y aumentaron el crecimiento de las raíces de las plantas (Figura 1). El peso fresco de la raíz aumentó en las plantas de tomate inoculadas con LBEndo1, NFbEndo2M2 y KBEcto4 en comparación con los controles no inoculados (Figura 1).

Figura. 1 Sistemas radiculares de plantas de tomate: preparación de suelo plano (A-E) y preparación de suelo de camas elevadas (F-J); control no inoculado (A y F); LBEndo1 inoculado (B y G); NFbEndo2M2 (C y H); KBEndo3 (D e I); y KBEcto4 (E y J). 

Nuestros resultados concuerdan con ^{Gamalero et al. (2002}, 2004), quienes trabajaron con Pseudomonas fluorescens 92rk y P. fluorescens A6RI, incrementaron el peso fresco de la raíz y afectaron la arquitectura de la raíz cuando se inocularon en plantas de tomate. También concuerda con ^{Sharma et al. (2015}), reportó un aumento significativo de los parámetros de crecimiento de las plantas (longitud y peso del brote y la raíz) en las plántulas de tomate tratadas con Bacillus subtillis cepa S25, que es una cepa con actividad antagonista hacia Phytophthora capsici.

El diámetro del tallo de las plantas de tomate se incrementó en condiciones de suelo plano compostado por las cepas de PGPR LBEndo1 y KBEcto4 en un 22.17 y 22.42%, respectivamente, para las condiciones del suelo de las camas elevadas, la inoculación de las cepas de PGPR NFbEndo2M2 y KBEcto4 aumentó significativamente en un 24.71 y 11.11%, respectivamente, en relación con las plantas de control no inoculadas (Cuadro 3). El aumento del diámetro del tallo en las plantas de tomate debido a la inoculación de PGPR concuerda con lo informado por ^{Zulueta-Rodríguez et al. (2020}), quienes reportaron un aumento evidente de hasta el 15% en el diámetro del tallo en plántulas de tomate inoculadas con Bacillus subtilis en un invernadero tipo capilla en condiciones semihidropónicas.

Los tratamientos con PGPR también aumentaron el número de frutos por planta en ambas preparaciones de condición de suelo. KBEcto4 fue el tratamiento con el mayor número de frutos con 23 tomates por planta, en comparación con 18.6 frutos por planta del control no inoculado en condiciones de suelo plano compostado. Ya se ha reportado el aumento en el crecimiento de plantas de tomate por inoculaciones de PGPR (^{Gamalero et al., 2002}; ²⁰⁰⁴; ^{Kokalis-Burelle et al., 2002}; ^{Gravel et al., 2007}; ^{Mena-Violante y Olalde-Portugal, 2007}; ^{Felici et al., 2008}; ^{Pastor et al., 2014}; ^{Sharma et al., 2015}). Hay pocos reportes sobre la evaluación de cultivos en condiciones de casa sombra, ^{Yu et al. (2011}) informó que Pseudomonas chlororaphis y Pseudomonas fluorescens aumentaron la absorción de fósforo y nitrógeno, y la altura, el brote y el peso seco de la raíz de las plántulas de nuez en condiciones de casa sombra. Sin embargo, el presente estudio informa por primera vez el efecto de las rizobacterias LBEndo1, NFbEndo2M2, KBEndo3 y KBEcto4 en el crecimiento de plantas de tomate en condiciones comerciales de casa sombra. Además, la preparación del suelo y el fertilizante orgánico agregado también demostraron tener un efecto estimulante sobre el crecimiento en las plantas de tomate.

Rendimiento y fruto de tomate comercializable

Después de 12 semanas de los experimentos en casa sombra, se obtuvo el tamaño y el peso del fruto de tomate de 20 frutos rojos al azar de cada tratamiento y el respectivo control sin inocular de ambas variantes de preparaciones de suelo (suelo plano y camas elevadas). El rendimiento de las plantas de tomate aumentó significativamente en dos de las cuatro cepas de PGPR utilizadas. Como se muestra en el Cuadro 4, las cepas LBEndo1 y KBEcto4 tuvieron la capacidad de aumentar el peso del fruto y el diámetro ecuatorial en ambas preparaciones de suelo; camas elevadas y suelo plano suplementado con fertilizante orgánico, donde el aumento de tamaño es más evidente en los frutos de tomate.

El peso promedio de los frutos de tomate por planta tratados con las cepas LBEndo1 (236.27 y 225.8 g correspondientes a un 40.8% y un 48.4%, respectivamente, más que el control) y KBEcto4 (240.22 y 211.41 g correspondientes a 43.1% y 38.9%, respectivamente, más que el control) en ambas preparaciones de suelo fue superior a las de otras, incluyendo el control no inoculado (Cuadro 4). Los resultados del presente estudio superan los reportados por ^{Katsenios et al. (2021}), donde el aumento del peso medio de los frutos de tomate por planta en 30.7, 28.81, 27.52 y 26.78% por la inoculación con Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Priestia megaterium y Bacillus licheniformis, respectivamente, en comparación con el control en el cultivo de tomate industrial.

El diámetro ecuatorial del fruto de tomate en el tratamiento inoculado con LBEndo1 se incrementó 16.4% (7.623 cm) y 15.2% (7.423 cm) en comparación con el control no inoculado (6.545 y 6.445 cm) para suelos planos y camas elevadas, respectivamente (Cuadro 4; Figura 2). Los tratamientos con KBEcto4 aumentaron el diámetro ecuatorial en un 16.5% (7.625 cm) y un 11.1% (7.166 cm) en comparación con los controles de las condiciones de suelo plano compostado (6.545 cm) y de suelo de camas elevadas (6.445 cm), respectivamente (Cuadro 4 y Figura 2).

Figura. 2 Frutos de tomate cortados por la mitad: preparación de suelo plano (A-E) y preparación de suelo de camas elevadas (F-J); control no inoculado (A y F); LBEndo1 inoculado (B y G); NFbEndo2M2 (C y H); KBEndo3 (D e I); y KBEcto4 (E y J). 

Este efecto también se observa en el estudio realizado por ^{Espinosa-Palomeque et al. (2017}) con las mismas cepas que reportamos aquí en condiciones de invernadero, donde se reportan aumentos en el diámetro ecuatorial de frutos de tomate en el tratamiento con la cepa LBEndo1 correspondiente a Bacillus paranichelliformis. ^{Gül et al. (2008}) reportaron el efecto de dos cepas comerciales de Bacillus amyloliquefaciens (FZB24 y FZB42) en el rendimiento de tomate, la aplicación de cualquiera de las cepas aumentó el rendimiento en un 8-9%. De manera similar, se ha reportado un aumento del rendimiento en plantas de tomate inoculadas con PGPR Bacillus subtilis BEB-13bs, aumentando el rendimiento y el rendimiento de grado comercializable (21%) en comparación con el control (^{Mena-Violante y Olalde-Portugal, 2007}).

Los rendimientos de los frutos de tomate comercializables aumentaron significativamente en todos los tratamientos de las condiciones del suelo plano compostado en comparación con los frutos de tomate de control y para el suelo de camas elevadas, el LBEndo1 y KBEcto4 fueron mayores que los de control no inoculados. De la misma manera que en los parámetros anteriores, el LBEndo1 fue mayor con un 95% (condiciones de suelo plano compostado) y un 85% (condiciones de suelo de camas elevadas) de rendimiento del grado comercializable extragrande (Cuadro 4 y Figura 2). La Figura 2 muestra un fruto de tomate cortado por la mitad por el diámetro ecuatorial, en la que se observa el tamaño del fruto entre tratamientos, los frutos más grandes se observan para LbEndo1 y KBEcto4. Aunque no son suficientes los frutos de tomate cortados a la mitad, el número de lóculos es mayor en los tratamientos con PGPR en comparación con los frutos sin inocular; esto es importante en la textura y firmeza de los frutos. ^{Espinosa-Palomeque et al. (2017}) determinaron la firmeza de frutos de tomate mediante un penetrómetro, encontrando que los tomates de plantas inoculadas tienen mayor firmeza en comparación con los controles sin inoculación.

Identificación de la cepa seleccionada mediante secuenciación del ARNr 16S

Las rizobacterias seleccionadas fueron identificadas mediante amplificación por PCR y secuenciación del gen ARNr 16S. Las rizobacterias LBEndo1 y KBEcto4 se reportaron en ^{Palacio-Rodríguez et al. (2017}). Las rizobacterias NFbEndo2M2 y KBEndo3 se sometieron a análisis de secuencia del gen ARNr 16S. La secuencia parcial del gen ARNr 16S obtenida de la secuenciación fue sometida a análisis de homología en BLAST (NCBI Database), que recupera las posiciones taxonómicas de cepas de rizobacterias, LBEndo1 es como Bacillus paralicheniformis con una homología de 96%, NfbEndo2M2 fue de 98% como Acinetobacter guillouiae, KBEndo3 tuvo una similitud de 99% con Aeromonas caviae y KBEcto4 exhibió un 99% de homología con Pseudomonas lini (Cuadro 5).