Sitios de muestreo, aislamiento e identificación de patógenos

En el año 2019, frutos de aguacate en madurez fisiológica, sin daños mecánicos, visiblemente sanos y sin daños aparentes (trips), se muestrearon en cinco huertos de Michoacán, uno en Jalisco y dos en Nayarit, México. 20 frutos por sitio de muestreo se almacenaron a 25 °C ±3 °C hasta que los síntomas de antracnosis se desarrollaran (lesiones circulares de color café en la cáscara que cambian a colores más oscuros durante el proceso de maduración).

Se tomaron muestras al aparecer los primeros síntomas, de 0.5 cm² de mesocarpio y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1.5% v/v por 2 min. Después se lavaron tres veces con agua destilada estéril, secadas con tela secante estéril y se sembraron en cajas de Petri con medio agar papa dextrosa (PDA, DIBICO, México). Se incubaron a 27 °C ±2 °C hasta que micelio y esporas se observaron. El cultivo se aisló por resiembras sucesivas y se purificó con la técnica de cultivo monospórico (^{Zhang et al., 2013}).

Identificación morfológica

Para cada patógenos aislado, se midió la velocidad de crecimiento en medio PDA incubados a 27 °C ±1 °C por 7 días. Cada 24 h se evaluó el diámetro de la colonia y se calculó la velocidad de crecimiento (mm día^-1). La descripción morfológica se realizó con base al color de la colonia (micelio), color de masas conoidales, presencia de acérvulos, tamaño y forma de espora.

Identificación molecular

Se usó la técnica de PCR para confirmar la identidad de las cepas aisladas (Colletrotrichum). El ADN genómico se extrajo del micelio de las colonias de 8 d de incubación a 27 °C para cada cepa de Colletotrichum aislada con el método CTAB (^{Doyle, 1990}). El ADN de todos los aislados se amplificaron mediante rDNA-ITS, donde se incluyó ITS1 (5’CAACTCCCAAACCCCTGTGA-3’) y ITS4 (5’GCGACGATTACCAGTAACGA-3’); y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa donde se usó GDF1 (5’-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3’) y GDR1 (5’-GGGT GGAG TCGT ACTT GAGC ATGT-3’).

Las condiciones de la amplificación y limpieza se realizaron como se indican los siguientes autores (^{Silva-Rojas y Ávila-Quezada, 2011}; ^{Fuentes-Aragón et al., 2018}; ^{Juárez-Vázquez et al., 2019}). El estudio se realizó en el Laboratorio de Diagnóstico Integral Fitosanitario en las instalaciones del Colegio de Postgraduados en el Estado de México, México.

Análisis filogenético

La historia evolutiva se infirió con el método Neighbor-Joining. Se tomó el árbol de consenso Bootstrap inferido de 100 repeticiones para representar la historia evolutiva de los taxones analizados. Las ramas correspondientes a particiones reproductivas en menos de 50% de réplicas de arranque colapsadas. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque (100 repeticiones) se mostró junto a las ramas.

Las distancias evolutivas se calcularon mediante el modelo de sustitución de Tamura-Nei como opciones de inferencia de árboles. El análisis involucró 22 secuencias de nucleótidos. Se eliminaron todas las posiciones que contenían lagunas y datos faltantes. Hubo un total de 442 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en el software molecules evalutionary genetics analysis (MEGA) 7.0 (^{Weir et al., 2012}; ^{Kumar et al., 2016}).

Pruebas de patogenicidad

Se utilizaron los postulados de Koch para corroborar el agente aislado como causante de los síntomas observados. Las pruebas de patogenicidad se realizaron en frutos completamente sanos sin daños visibles, con un contenido de materia seca en pulpa entre 23-25% (^{NMX-FF-016-SCFI-2016, 2016}). Se hicieron tres heridas (3 mm) en la zona longitudinal del fruto y se colocó suspensión de esporas (10⁶ esporas ml^-1) sobre las heridas. El experimento se repitió dos veces. Todos los frutos se incubaron a 27 °C y 90% de humedad relativa hasta que apareció la enfermedad de antracnosis. Se registró el desarrollo de antracnosis para cada aislamiento y se aisló nuevamente el patógeno para confirmar la identidad morfológica y las características culturales.

Crecimiento de micelio bajo estrés de fungicidas

La inhibición del crecimiento del micelio en presencia de dos fungicidas, sulfato de cobre y la mezcla de fludioxonil + azoxistrobin, se realizó en PDA con la concentración de cada fungicida, para sulfato de cobre fueron 20, 40, 60 y 80 ppm; para fludioxonil + azoxistrobin fueron 10, 20, 50 y 70 ppm. Como control se incluyó únicamente PDA. Se realizaron cinco repeticiones por aislado de C. siamense. A cada caja Petri se le agregó una muestra de micelio de 7 días de edad y se incubaron a 27 ºC ±1 °C durante 48 h (^{Han et al., 2021}). Después de este período de incubación, los tratamientos con fungicida se reinoculadas en PDA sin fungicida, para verificar el efecto fungicida o fungistático.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por medio de un diseño completamente al azar con tres repeticiones, al considerar el origen del aislamiento como factor de variación para el diámetro radial de la colonia, la velocidad de crecimiento, el área de la colonia a los siete días y la longitud y diámetro de espora. Las comparaciones de medias se realizaron con la prueba LSD Fisher (p≤ 0.05).

Identificación morfológica

Nueve cepas de hongos patógenos pertenecientes al complejo de especies de C. gloeosporioides se identificaron. De estos, seis patógenos correspondieron al estado de Michoacán, en cinco sitios de muestreo, un hongo patógeno en Jalisco y dos hongos patógenos de Nayarit. Los síntomas de las enfermedades en el fruto, las características de la colonia y la forma de la espora se muestran en la Figura 1 y se describen en el Cuadro 1. La mayoría de los aislamientos presentaron micelio aéreo y color blanco a gris oscuro a los 7 d de incubación, con masas anaranjadas en forma de cono y solo en dos casos negro.

Figura 1 A) Síntomas de antracnosis en frutos de aguacate de los que se aislaron las cepas de C. gloeosporioides sensu lato; B) características morfológicas de las colonias luego de siete días de incubación a 27 °C en agar papa dextrosa; y C) esporas. 

Todos presentaron acérvulos. La forma de las esporas fue de cilíndrica a elipsoidal. La velocidad de crecimiento estuvo entre 11.7 a 12.9 mm día^-1 con diferencias estadísticas entre ellos (p< 0.05). La longitud y el diámetro ecuatorial de la espora también mostraron diferencias significativas (p< 0.05). Las esporas tuvieron un rango de longitud de 40.3 a 46.1 µm y de 11 a 15.3 µm de diámetro ecuatorial.

El diámetro final de la colonia el día siete fue diferentes entre las cepas y osciló entre 69 y 83 mm. La concentración de esporas al final de la incubación fue diferente entre las cepas (p< 0.05) (Cuadro 2). Con base en estas características morfológicas y culturales, los aislamientos fueron identificados como C. gloeosporioides sensu lato. Bajo esta clasificación se agrupan diferentes especies causantes de antracnosis en de aguacate.

Pruebas de patogenicidad

En las pruebas de patogenicidad, las características típicas de la enfermedad de la antracnosis se desarrollaron después de cinco días de almacenamiento, como manchas negras en el pericarpio y pudrición blanda en el mesocarpio, que se extendió rápidamente por todo el fruto. No se observaron otros síntomas entre los aislados (Figura 2).

Figura 2 Pruebas de patogenicidad realizadas a nueve hongos patógenos aislados después de 5 días de incubación sobre aguacate ‘Hass’: A) 1. Up Cg M4; B) 2. Tin Cg M13; C) 4. Zira Cg M21; D) 5. Tan Cg M40; E) 6. LRe Cg M46; F) 7. LRe Cg M48; G) 8. Tpc Cg N8; H) 9. Xal Cg N22; y I) 10. CdG Cg J22. 

Identificación molecular y árbol filogenético

Con base en las secuencias de nucleótidos ITS y una búsqueda BLAST, los aislamientos obtenidos en este estudio se identificaron como complejo de especies de C. gloeosporioides. Los nueve aislamientos mostraron una cobertura porcentual entre 99 y 100% y una identidad de 98 a 100% con el género Colletotrichum y se clasificaron en el clado gloeosporioides con base en la secuencia de nucleótidos de ITS. Con la secuencia GAPDH mostraron un porcentaje de cobertura de 79 a 100% con C. siamense, así como una identidad de 98 a 100% con esta especie (Cuadro 3; Figura 3 y 4).

Figura 3 Alineación de secuencias. 

Figura 4 Árbol de máxima verosimilitud de la familia de toxinas aminérgicas. 

Crecimiento de micelio bajo estrés de fungicidas

En todas las cepas aisladas y evaluadas en ambos fungicidas lograron una inhibición del 100% en comparación al control (Figura 5). Cuando las muestras de micelio de los patógenos evaluados se resembraron solo en PDA, las cepas desarrollaron micelio en las 48 h de incubación. A mayor concentración del fungicida fludioxonil + azoxistrobin expuesto, el desarrollo del micelio fue menor en comparación al control (Figura 6). Las cepas Up Cg M4 y Tin Cg M13 presentaron mayor susceptibilidad a bajas concentraciones del fungicida, en comparación al resto de las cepas que, en concentraciones altas también desarrollaron micelio, aunque escaso y desordenado.

Figura 5 Inhibición del crecimiento micelial de C. siamense bajo estrés del fungicida. A) fludioxonil + azoxistrobin; y B) sulfato de cobre, después de 48 h de incubación a 27 ºC ±1 ºC. 

Figura 6 Crecimeinto de micelio in medio PDA después de 48 h expuestos a estrés de fungicidas. A) fludioxonil + azoxistrobin (10, 20, 50 y 70 ppm); y B) sulfato de cobre (20, 40, 60 y 80 ppm). 

Con el fungicida sulfato de cobre, todas las cepas desarrollaron micelio después de la reinoculación en PDA sin fungicida. Mayor desarrollo después de la exposición a bajas concentraciones de fungicidas y menor desarrollo de micelio después de la exposición a altas concentraciones de fungicidas. Una explicación a este fenómeno de inhibición bajo el estrés de ambos fungicidas es que las cepas evaluadas entraron a un estado de inactivación, como respuesta a la alta concentración del fungicida. Esto ya que, en campo, la concentración del fungicida disminuye conforme pasa el tiempo por la degradación de molécula, la exposición a luz ultravioleta o dilución por lluvia o ambiente (^{Arjona-López et al., 2020}; ^{Han et al., 2021}).

La identificación de C. siamense en la región del Pacífico Centro de México indicó que el hongo se ha dispersado dentro de las principales regiones productoras de aguacate en México. La investigación de ^{Weir et al. (2012}) mencionaron que C. siamense está representada por 30 aislamientos de una amplia gama de hospedantes de varias regiones tropicales y forma un clado monofilético que no puede subdividirse genéticamente sin ser considerado un complejo de especies de C. siamense. Las secuencias ITS no separan de manera confiable a C. siamense del resto de C. gloeosporioides sensu lato (C. alienum, C. fructicola y C. tropicale).

La secuencia del gen GAPDH fue más eficiente para distinguir C. siamense (^{Lee et al., 2020}). ^{Fuentes-Aragón et al. (2020}b) reportaron en precosecha por primera vez la presencia de C. siamense en frutos con síntomas visibles de antracnosis en la región Pacífico Centro de México. Los resultados de esta investigación coincidieron con los trabajos ya reportados, donde se indica que C. siamense es el patógeno más abundante en la región Pacífico Centro de México, la de mayor producción y exportación de aguacate ‘Hass’ en México.

La presencia de C. siamense, aislada de frutos de aguacate con síntomas visibles de antracnosis en la etapa de precosecha, fue reportada en Australia (^{Giblin y Coates 2007}); Nueva Zelanda (^{Hofer et al., 2021}); México (^{Trinidad-Ángel et al., 2017}; ^{Fuentes-Aragón et al., 2020}b); Ghana (^{Honger et al., 2016}) e Israel (^{Sharma et al., 2017}). A diferencia de estos estudios, en esta investigación se utilizaron frutos de aguacate sin síntomas visibles de antracnosis y cosechados en madurez fisiológica, lo cual confirma que C. siamense es un hongo patógeno endófito, capaz de existir en dos condiciones de vida del fruto (pre y poscosecha), además, puede ingresar al tejido inmaduro del fruta (lenticelas, pedicelos y penetración directa) y permanecer inactivo durante meses (latencia) (^{Prusky et al., 2013}) y colonizar aún más la fruta durante el almacenamiento cuando el fruto comienza a madurar, lo que lo convierte en un hongo necrotrófico.

Es evidente que, el control de la antracnosis en precosecha no elimina el problema de poscosecha; por lo que, se deben utilizar diferentes estrategias, una para el control de la antracnosis en precosecha y otra en postcosecha con frutos asintomáticos y así, mantener la calidad de los frutos por más tiempo de almacenamiento, para permitir alcanzar mercados internacionales.

Por otro lado, en postcosecha, debido a regulaciones existentes, el control químico se utiliza poco. Por lo tanto, es necesario utilizar métodos alternativos al uso de los compuestos químicos para controlar la antracnosis en el almacenamiento del aguacate con alta eficiencia y bajo costo y bajo riesgo para la salud y el medio ambiente (^{Herrera-González et al., 2021}).