Revisiones

 

Estrategias genómicas y moleculares para el control de la babesiosis bovina

 

Genome and molecular strategies for bovine babesiosis control

 

Juan Joel Mosqueda Gualito^a, Alfonso Falcón Neri^b, Juan Alberto Ramos Aragón^b, Germinal Jorge Canto Alarcón^a, Minerva Camacho-Nuez^c

 

^a Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Avenida de las Ciencias S/N Col. Juriquilla Santiago de Querétaro CP. 76230, Querétaro, México. Tel: 442 1991200, ext. 5386. joel.mosqueda@uaq.mx. Correspondencia al primer autor.

^b CENID PAVET / INIFAP, Jiutepec, Morelos, México.

^c Universidad Autónoma de la Ciudad de México, México, D.F.

 

RESUMEN

El control de la babesiosis bovina en muchas partes del mundo está restringido al tratamiento quimioterapéutico y al control de la población de garrapatas con agentes acaricidas. No hay programas de control basados en estudios de inmunidad de hato, control integral de la garrapata y las enfermedades que transmite, ni vacunas contra la babesiosis disponibles comercialmente. Para poder desarrollar estas herramientas es necesario utilizar tecnologías que incluyan conocimientos de genómica, proteómica y bioinformática, apoyadas en la investigación de genes con potencial diagnóstico o vacunal. El estudio de la función de los genes, y de la conservación o variabilidad son indispensables para determinar su utilidad. Es necesario, primero identificar los genes con potencial a incluirse en el desarrollo de estas herramientas, y después, evaluar su variabilidad o conservación en distintas poblaciones de parásitos. En segundo término, es necesario seleccionar regiones específicas de estos genes, que cumplan la función deseada, ya sean regiones conservadas o diferentes entre cepas. Finalmente, es necesario utilizar el método adecuado de evaluación de estos candidatos para el desarrollo de métodos de control adecuados. A pesar de que hay ciertos avances en el estudio de genes de B. bovis, hay prácticamente nula información respecto a B. bigemina. Es necesario aprovechar las nuevas estrategias genómicas y de bioinformática para identificar nuevos genes con potencial diagnóstico y de vacunación. El desarrollo de la ganadería mexicana está supeditado al establecimiento e implementación de estas herramientas.

Palabras clave: Babesiosis bovina, Diagnóstico, Bioinformática.

 

ABSTRACT

The control of bovine babesiosis around the world is restricted to chemotherapeutic treatment and tick population reduction by acaricide agents. There are no control strategies based on herd immunity studies, programs on integral control of ticks and tick-transmitted diseases, neither are commercially available safe vaccines against babesiosis. In order to develop these tools it is necessary the use of genomics, proteomics, and bioinformatics together with research on genes with a potential use as diagnostics or vaccines. Studies on the function of those genes and, the degree of conservation of variation are mandatory to determine their usefulness. First, it is necessary to identify genes with a potential use in the development of these tools and then, evaluate their variation or conservation between different parasite populations. Second, specific domains of those genes must be selected in order for them to be used as desired, whether they are on conserved or variable regions of those genes in different strains. Finally, the best evaluation method for those genes must be employed to develop adequate control methods. Although there is some research in the study of Babesia bovis genes, there is practically no information about B. bigemina. Therefore it is necessary to take advantage of the genomics and bioinformatics strategies to identify new genes as diagnostics and vaccine potential. The development of the Mexican livestock depends upon the implementation of these tools.

Key words: Bovine babesiosis, diagnostics, bioinformatics.

 

INTRODUCCIÓN

En México como en muchos otros países con regiones ganaderas de clima tropical y subtropical, existe una enfermedad de los bovinos que es trasmitida por garrapatas. Esta enfermedad conocida como babesiosis bovina, es causada por protozoarios del género Babesia y se caracteriza por inducir procesos febriles en animales infectados, además de causar anemia de tipo hemolítico, hemoglobinemia, hemoglobinuria y en casos frecuentes, signos nerviosos y la muerte⁽¹⁾.

En México, la babesiosis bovina es causada por dos especies, Babesia bigemina y Babesia bovis, las cuales son trasmitidas por dos especies de garrapatas presentes en el país, Boophilus microplus y Boophilus annulatus (ahora pertenecientes al género Rhipicephalus)^(2,3). Se considera que el 75 % de la población bovina del país, estimada en 2004 en 31,760,962 cabezas, se encuentra en zonas infestadas de garrapatas, por lo tanto expuestas a la enfermedad⁽⁴⁾. Aunque el costo ocasionado por la presencia de la garrapata y las enfermedades que trasmite como la babesiosis y la anaplasmosis no ha sido estimado recientemente, en 1975 éstas fueron de alrededor de 186 millones de dólares, muchos de los cuales son atribuidos a las pérdidas en la producción de carne y leche⁽⁵⁾.

La incidencia de la enfermedad clínica está determinada por diferentes factores, por ejemplo, se ha demostrado que cuando la tasa de inoculación de Babesia por garrapatas infectadas es adecuada, de tal manera que se asegure que todos los becerros sean infectados durante el período cuando están protegidos por la inmunidad pasiva e innata (los animales jóvenes de hasta 8-9 meses de edad poseen una resistencia natural, la cual les permite tener una reacción de menor severidad a la enfermedad), entonces la presentación de la babesiosis clínica es mínima y se alcanza una estabilidad enzoótica^(6,7). Por otro lado, si la tasa de inoculación es baja, de tal manera que no todos los animales de un rancho se infectan cuando son jóvenes, algunos animales permanecen susceptibles a la enfermedad, y cuando estos se infectan en edad adulta, pueden sufrir una severa reacción clínica e incluso morir. Dado que la tasa de inoculación no es estable en las áreas enzoóticas, sino que varía con los cambios en las condiciones climáticas, o en las condiciones de manejo de los animales (por ejemplo, intenso tratamiento acaricida), un fenómeno denominado inestabilidad enzoótica puede aparecer dentro de una zona endémica y provocar brotes severos de babesiosis bovina⁽⁷⁾. La detección temprana del estado inmunológico de los animales en estas áreas de riesgo sería entonces un elemento esencial en el control de la babesiosis. Para detectar estos casos de riesgo se requieren métodos mejorados de diagnóstico que permitan evaluar la estabilidad enzoótica de forma eficiente, y así determinar si la vacunación es necesaria. Al mismo tiempo se requieren vacunas eficaces y seguras que induzcan respuestas inmunológicas protectoras en los bovinos inmunizados. A la fecha no existen métodos de diagnóstico sensibles, automatizados y confiables, ni vacunas seguras que confieran protección adecuada en México ni en la mayoría de los países donde esta enfermedad es endémica^(7,8).

Con la publicación de la secuencia del genoma completo de Babesia bovis⁽⁹⁾, y la casi terminada secuenciación del genoma de Babesia bigemina por el Instituto Sanger (http://www.sanger.ac.uk/), es posible ahora el estudio a nivel genómico de estos patógenos, y ha proporcionado a la fecha información valiosa sobre las características esenciales de la composición de su genoma y la comparación de éste con el de otros protozoarios apicomplexa de importancia en salud humana y animal, como aquéllos de los géneros Plasmodium y Theileria. Esta información ha permitido la incorporación de diversos análisis con programas de bioinformática que hacen posible la identificación de genes nuevos, o que son homólogos en otras especies, además del estudio de las proteínas predichas, su análisis comparativo y las características físico-químicas, antigénicas y filogenéticas que permiten un primer examen del potencial de estos genes putativos como candidatos para su uso como agentes de diagnóstico o vacunal. Análisis detallados son también posibles con la generación de etiquetas de secuencias expresadas (EST) para Babesia bovis⁽¹⁰⁾, que permiten analizar aquellos genes que se expresan de forma específica en los distintos estadios del ciclo de vida del parásito. Finalmente, la realización de métodos de análisis del genoma completo de forma masiva como los microarreglos que en breve estarán ya disponibles para su uso⁽¹¹⁾.

Las alternativas para desarrollar herramientas de control de la babesiosis bovina basadas en tecnología recombinante no han sido muy exitosas. La principal razón es, además de la variación de antígenos inmuno-dominantes, el amplio arsenal de proteínas que tienen estos protozoarios para invadir a sus células blanco. Por ejemplo, Babesia y Plasmodium spp., dos protozoarios Apicomplexa, utilizan un mecanismo de invasión que involucra antígenos de la cubierta superficial para adherirse a receptores en la membrana de los eritrocitos. Esto es seguido de la liberación de antígenos de organelos como las micronemas, que ayudan a la orientación del parásito para que la porción apical quede en contacto con la membrana del eritrocito. Acto seguido hay liberación de proteínas de las roptrías y de los cuerpos esféricos, que facilita la invaginación de la membrana del eritrocito y su penetración^(12,13,14). Aunque existen diferencias entre las distintas especies durante el proceso de invasión, lo cierto es que las vacunas basadas en un sólo antígeno tienen pocas posibilidades de conferir una protección adecuada, independientemente del tipo de antígeno usado^(15,16,17). Cuando dos o más antígenos se han usado en combinación, los resultados han mejorado notablemente, indicando que es necesaria una exposición a diferentes tipos de epítopes presentes en diversos antígenos, ya sea usando antígenos nativos o recombinantes^(18,19,20). De estos resultados podemos inferir que existen epítopes que inducen respuestas humorales y celulares protectoras.

Algunos de estos epítopes ya han sido mapeados por su capacidad de estimular respuestas protectoras de tipo TH1. Al mismo tiempo, los esfuerzos para generar antígenos recombinantes que induzcan respuestas humorales neutralizantes, se han visto opacados por la variabilidad de los epítopes expuestos, y por la presencia de epítopes inmunodominantes que inducen una gran cantidad de anticuerpos no protectores. Una estrategia para corregir estos problemas, es la selección de epítopes de las proteínas involucradas en los distintos pasos del proceso de invasión, con capacidad de inducir respuestas humorales y celulares protectoras. Esta estrategia puede hacerse en dos pasos; primero, seleccionar los epítopes conservados de proteínas que ya han sido probados por su capacidad de inducir respuestas celulares Th, y segundo, la selección de epítopes de proteínas de superficie que sean conservados y que induzcan respuestas humorales. Una vez que se tenga este panel de epítopes, estos pueden evaluarse como antígenos conservados que induzcan respuestas inmunológicas protectoras (tipo TH1) e induzcan anticuerpos que reconozcan epítopes conservados. Con estas dos características pueden generarse métodos de diagnóstico inmunológico o bien candidatos vacunales que ofrezcan nuevas alternativas para el control mejorado de la enfermedad. Aquí describiremos las estrategias que nosotros y otros grupos estamos realizando para desarrollar nuevos métodos para el control de la enfermedad, incluyendo métodos de diagnóstico y antígenos con potencial vacunal.

Búsqueda de nuevos genes con importancia en genomas de Babesia spp

Esta estrategia se ha utilizado previamente para encontrar genes nuevos en especies de patógenos que sean homólogos a genes previamente caracterizados en otros microorganismos filogenéticamente similares⁽²¹⁾. Genes homólogos en función, usualmente comparten cierto grado de identidad a nivel de secuencia, tanto nucleotídica como de aminoácidos, y esta característica permite asumir que un elevado grado de identidad entre estos genes en especies distintas permitirá resultados positivos al realizar búsquedas BLAST en genomas secuenciados. Genes que codifican proteínas con importancia en los procesos de invasión y escape de las células hospederas, son blancos potenciales de bloqueo mediante anticuerpos vacunales. Enzimas y otras proteínas metabólicas pueden ser usadas como blancos de fármacos nuevos. Finalmente, proteínas con funciones conservadas, y por lo tanto, secuencias conservadas, pueden usarse como blancos de métodos de diagnóstico inmunológico y molecular. En Babesia, hay un número elevado de genes homólogos en otras especies de protozoarios aplicomplexos mejor estudiadas como Plasmodium, Toxoplasma o Theileria. Por su parte Babesia bovis ha sido históricamente más estudiada que Babesia bigemina y por lo tanto hay más genes identificados. La reciente secuenciación de ambos genomas hace posible la aplicación de esta estrategia.

Análisis e identificación de epítopes conservados de proteínas de superficie y de organelos apicales de cepas de distintas regiones de México y el mundo de Babesia bigemina y Babesia bovis.

Se han utilizado genes que codifican antígenos de organelos y de la cubierta de superficie de Babesia spp, específicamente la proteína asociada a las roptrías 1a (RAP-1a), el antígeno de la superficie del merozoito 1 y 2 (MSA-1, MSA-2), la glicoproteína de superficie 45 (GP-45) y algunos citoplasmáticos como la proteína de choque térmico 20 (HSP-20). Estudios hechos por nosotros y otros han demostrado el potencial antigénico e inmunoprotector de estas proteínas^(22,23,24). Con las secuencias obtenidas de los alelos de esos genes de aislados de México y otras partes del mundo, se pueden realizar alineamientos múltiples de las proteínas predichas con programas computacionales específicos (vector NTI Advance) para evaluar la presencia de regiones conservadas⁽²⁵⁾. Los alineamientos de cada proteína permiten identificar aquellas regiones de las proteínas que son conservadas en todos los aislados y que estén expuestas en la superficie, esto mediante el análisis de cada péptido obtenido por análisis computacionales bioinformáticos como la antigenicidad (Antigenic), además de la hidrofilicidad y la presencia de estructuras secundarias (NNPREDICT), la ausencia de regiones transmembranales (TMHMM) y de péptido señal (SignalP), al igual que la presencia de epítopes B (BCEPred y ABCPred). Con la regiones obtenidas, entonces es posible generar péptidos sintéticos por cada antígeno y usarse estos para generar anticuerpos específicos contra cada péptido, como se ha hecho anteriormente para proteínas de B. bovis⁽²⁶⁾. Estos anticuerpos, después deben ser evaluados mediante western blot (WB) e inmunofluorescencia indirecta (IFI). El objetivo principal es verificar que los péptidos seleccionados generan respuestas inmunológicas que forman anticuerpos que son específicos, y que tienen la capacidad de bloquear la invasión de merozoitos. La meta de este objetivo es contar con un panel de péptidos que cumplan con estos requisitos y que sean evaluados posteriormente como candidatos de diagnóstico o vacunales.

Genes de Babesia spp., con importancia vacunal y de diagnóstico encontrados mediante estrategias genómicas y de bioinformática

Desde la secuenciación de los genomas de Babesia bovis y Babesia bigemina, se ha publicado la identificación de varios genes con potencial importancia como agentes vacunales y de diagnóstico. Entre los más sobresalientes están el antígeno de la membrana apical 1 de Babesia bovis, la proteína relacionada a trombospondina (TRAP), los cuales fueron identificados debido a la homología en su secuencia con los genes respectivos en Plasmodium falciparum^(21,27) Otros genes homólogos al antígeno principal de la superficie del esporozoito de Theileria annulata (SPAG-1), el antígeno más estudiado en esta especie por su capacidad como inmunógeno potencial, fueron identificados también en B. bovis⁽⁹⁾. Se ha identificado el gen homólogo en Babesia bigemina a TRAP (Petrig, R., comunicación personal). La caracterización de estos genes a nivel de proteína predicha y su conservación entre cepas de distintas zonas geográficas, permitirán su consideración como posibles candidatos, ya sea de diagnóstico o bien como integrantes de nuevas vacunas contra este patógeno.

Análisis de secuencias conservadas para la generación de péptidos sintéticos y su aplicación en el control de la enfermedad

Desde hace mucho se han estudiado antígenos que fueron identificados por su capacidad para inducir respuestas inmunológicas protectoras a bovinos inmunizados. Algunos de estos antígenos incluyen aquellos localizados en la membrana de la superficie del merozoito (MSA). Sin embargo, estos antígenos han mostrado una gran variabilidad antigénica, que se traduce en una ausencia de reconocimiento por anticuerpos contra cepas con MSA distintos^(28,29) y que compromete su uso como antígenos vacunales. Sin embargo, un análisis bioinformático más detallado de las secuencias de estos genes obtenidas de cepas de distintas zonas geográficas, pueden permitir identificar regiones conservadas que se han usado para generar péptidos sintéticos específicos. Estos péptidos pueden entonces usarse como agentes vacunales, y que al ser aplicados como inmunógenos en bovinos susceptibles, induzcan anticuerpos que neutralicen el proceso de invasión y por lo tanto eviten el establecimiento de la infección. Estudios recientes preliminares han mostrado resultados promisorios, y la aplicación de esta estrategia con otros antígenos está siendo evaluada actualmente⁽³⁰⁾.

De los genes nuevos a las proteínas predichas: aplicaciones y perspectivas

Una vez identificadas las secuencias que reúnen los requisitos de un marco abierto de lectura (ORF), un primer paso consiste en verificar si estos ORFs son genes verídicamente. Una forma de verificación es evaluar la trascripción de estos ORF's: esto es sencillo y rápido al diseñar primers o iniciadores directamente de las secuencias obtenidas (exones), estos primers son utilizados para comprobar la presencia de trascritos en muestras de ARN mensajero, indicador de que la secuencia seleccionada es un gen que se transcribe y con potencial. Asimismo puede obtenerse mediante informática la secuencia predicha de las proteínas codificadas por estos genes, e información adicional que permita saber si estas proteínas son de membrana y la presencia de epitopes accesibles al sistema inmunológico del hospedero. Con el alineamiento de varias de estas secuencias de cepas distintas, es posible evaluar el grado de conservación de los genes y sus proteínas, y conocer las regiones conservadas o variables. A nivel de secuencias nucleotídicas, las regiones variables pueden utilizarse para el desarrollo de marcadores que permitan discriminar cepas mediante técnicas moleculares, una técnica muy requerida en la actualidad por su importancia epidemiológica. Las secuencias conservadas a nivel de aminoácidos permitirán el desarrollo de péptidos conservados que pueden ser utilizados como herramientas de diagnóstico al ser incorporados en técnicas de diagnóstico inmunológicas como la ELISA. Los péptidos también pueden formar parte de vacunas que generen respuestas inmunológicas contra esas regiones conservadas de las proteínas, y al ser inmunizados a bovinos, protejan contra desafíos heterólogos. La meta es producir herramientas de control mejoradas contra la babesiosis bovina que, ayudadas por las tecnologías genómicas y de bioinformática, ayuden a prevenir y controlar esta enfermedad en regiones endémicas de México y el mundo.

 

CONCLUSIONES

La babesiosis bovina causa enormes pérdidas económicas a la ganadería en las regiones donde está presente.

Los métodos actuales de control no son suficientes ya que no hay vacunas disponibles que sean eficaces, y los métodos de diagnóstico actuales son poco sensibles.

La genómica y la bioinformática son herramientas que permiten analizar genomas completos ya secuenciados, y buscar nuevos genes con potencial diagnóstico y vacunal, e incorporarlos para generar nuevos métodos de diagnóstico, sensibles y automatizados, y vacunas eficaces que ayuden a controlar la enfermedad en México y el mundo.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo es financiado por los proyectos: INCO 003691 y PROMEP-PTC-108 .

 

LITERATURA CITADA

1. McCosker PJ, The global importance of babesiosis, in Babesiosis, Ristic M, Kreier JP editors. Academic Press: New York. 1981,         [ Links ]

2. Osorno M. Babesiosis en México. Vet Méx;1978(11):203- 218.         [ Links ]

3. Hoffman A, Lopez-Campos G. Biodiversidad de los acaros en Mexico. First ed. Mexico, DF: CONABIO; 2000.         [ Links ]

4. SIAP. Cattle population in Mexico 1999-2008. www.sagarpa.gob.mx, 2008.         [ Links ]

5. Beltran LG. National anti-Tick Campaign. In: Ectoparasites Seminar. CIAT. 1975.         [ Links ]

6. Mahoney DF, Ross DR. Epizootiological factors in the control of bovine babesiosis. Aust Vet J 1972;48(5):292-298.         [ Links ]

7. Bock R. et al. Babesiosis of cattle. Parasitology;2004(129 Suppl):S247-69.         [ Links ]

8. Mosqueda J. et al. Advances in the development of molecular tools for the control of bovine babesiosis in Mexico. Parasitology 2007;49(Suppl1):19-22.         [ Links ]

9. Brayton KA. et al. Genome sequence of Babesia bovis and comparative analysis of apicomplexan hemoprotozoa. PLoS Pathog 2007;3(10):1401-1413.         [ Links ]

10. de Vries E. et al. Expressed sequence tag (EST) analysis of the erythrocytic stages of Babesia bovis. Vet Parasitol 2006;138(1-2):61-74.         [ Links ]

11. Lau AO, Tibbals DL, McElwain TF. Babesia bovis: the development of an expression oligonucleotide microarray. Exp Parasitol 2007;117(1):93-98.         [ Links ]

12. Jack RM, Ward PA. The entry process of Babesia merozoites into red cells. Am J Pathol 1981;102(1):109- 113.         [ Links ]

13. Chitnis CE, Blackman MJ. Host cell invasion by malaria parasites. Parasitol Today 2000;16(10):411-415.         [ Links ]

14. Cowman AF, Crabb BS. Invasion of red blood cells by malaria parasites. Cell 2006;124(4):755-766.         [ Links ]

15. McElwain TF., et al. Molecular characterization and immunogenicity of neutralization-sensitive Babesia bigemina merozoite surface proteins. Mol Biochem Parasitol 1991;47(2):213-22.         [ Links ]

16. Hines SA. et al. Immunization of cattle with recombinant Babesia bovis merozoite surface antigen-1. Infect Immun 1995;63(1):349-352.         [ Links ]

17. Norimine J. et al. Stimulation of T-helper cell gamma interferon and immunoglobulin G responses specific for Babesia bovis rhoptry-associated protein 1 (RAP-1) or a RAP-1 protein lacking the carboxy-terminal repeat region is insufficient to provide protective immunity against virulent B. bovis challenge. Infect Immun 2003;71(9):5021-5032.         [ Links ]

18. Wright IG. et al. The development of a recombinant Babesia vaccine. Vet Parasitol 1992;44(1-2):3-13.         [ Links ]

19. Schetters TP. et al. Not peripheral parasitaemia but the level of soluble parasite antigen in plasma correlates with vaccine efficacy against Babesia canis. Parasite Immunol 1996;18(1):1-6.         [ Links ]

20. Alonso PL. et al. Duration of protection with RTS,S/AS02A malaria vaccine in prevention of Plasmodium falciparum disease in Mozambican children: single-blind extended follow-up of a randomised controlled trial. Lancet 2005;366(9502): 2012-2018.         [ Links ]

21. Gaffar FR. et al. A Babesia bovis merozoite protein with a domain architecture highly similar to the thrombospondin-related anonymous protein (TRAP) present in Plasmodium sporozoites. Mol Biochem Parasitol 2004;136(1):25-34.         [ Links ]

22. Mosqueda J. et al. Babesia bovis merozoite surface antigen 1 and rhoptry-associated protein 1 are expressed in sporozoites, and specific antibodies inhibit sporozoite attachment to erythrocytes. Infect Immun 2002;70(3):1599-1603.         [ Links ]

23. Mosqueda J, McElwain TF, Palmer GH. Babesia bovis merozoite surface antigen 2 proteins are expressed on the merozoite and sporozoite surface, and specific antibodies inhibit attachment and invasion of erythrocytes. Infect Immun 2002;70(11):6448-6455.         [ Links ]

24. Wilkowsky SE. et al. Babesia bovis merozoite surface protein-2c (MSA-2c) contains highly immunogenic, conserved B-cell epitopes that elicit neutralization-sensitive antibodies in cattle. Mol Biochem Parasitol 2003;127(2):133-141.         [ Links ]

25. Genis AD. et al. Phylogenetic analysis of Mexican Babesia bovis isolates using msa and ssrRNA gene sequences. Ann N Y Acad Sci 2008;1149:121-5.         [ Links ]

26. Norimine J. et al. Conservation of Babesia bovis small heat shock protein (Hsp20) among strains and definition of T helper cell epitopes recognized by cattle with diverse major histocompatibility complex class II haplotypes. Infect Immun 2004;72(2):1096-106.         [ Links ]

27. Gaffar FR. et al. Erythrocyte invasion by Babesia bovis merozoites is inhibited by polyclonal antisera directed against peptides derived from a homologue of Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1. Infect Immun 2004;72(5): 2947-2955.         [ Links ]

28. Hines SA. et al. Neutralization-sensitive merozoite surface antigens of Babesia bovis encoded by members of a polymorphic gene family. Mol Biochem Parasitol 1992;55(1-2):85-94.         [ Links ]

29. Leroith T. et al. Sequence variation and immunologic cross-reactivity among Babesia bovis merozoite surface antigen 1 proteins from vaccine strains and vaccine breakthrough isolates. Infect Immun 2005;73(9):5388- 5394.         [ Links ]

30. Florin-Christensen M. et al. Search for Babesia bovis vaccine candidates. Parassitologia;2007;49(Suppl 1):9-12.         [ Links ]