Notas de investigación

 

Prevalencia y resistencia a antibióticos de Escherichia coli O157:H7 aislada de canales de bovinos sacrificados en rastros del altiplano central Mexicano

 

Prevalence and antibiotic resistance of Escherichia coli O157:H7 isolated from bovine carcasses at slaughterhouses of the Central Mexican Plateau

 

Nydia Edith Reyes-Rodríguez^a, Martín Talavera-Rojas^a, Jorge Antonio Varela-Guerrero^a, Jeannette Barba-León^b, Adriana del Carmen Gutiérrez-Castillo^a, Uxúa Alonso-Fresán^a

 

^a Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México,. Carretera Panamericana Toluca-Atlacomulco km 15.5, Toluca, México. CP. 50200, Teléfono/Fax: 722 2965555. mtr0035@yahoo.com.mx. Correspondencia al segundo autor.

^b Departamento de Salud Pública, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, Zapopan, Jalisco, México.

 

Recibido el 6 de junio de 2011.
Aceptado el 22 de noviembre de 2011.

Resumen

La carne es el principal vehículo de toxiinfecciones alimentarias como consecuencia de una higiene deficiente en el sacrificio de los animales o durante el manejo de las canales. En este estudio se analizaron tres rastros municipales del Altiplano Central Mexicano, de los cuales se obtuvieron 228 muestras pareadas de canal (n=114) y contenido de colon (n=114) de bovinos que fueron sacrificados en estos rastros; se obtuvieron 2 (0.8 %) cepas de E. coli O157:NM a partir de contenido de colon y 6 (2.6 %) cepas de E. coli O157:H7 (5 de canales y 1 de contenido de colon). El porcentaje de aislamiento de cada rastro fue variable, encontrando diferencias significativas (P<0.05). En las cepas de E. coli O157:NM y O157:H7 se observa que la resistencia más alta fue para cefalotina con un 75 %, carbencilina con 62.5 %, amikacina con 50 % y gentamicina con 50 %, el 16.7 % de las cepas de E. coli O157:H7 presentaron los genes eae, stx1 y stx2 y el 66.7 % los gen eae y stx2. En conclusión los resultados obtenidos muestra la presencia E. coli O157:H7 con factores de virulencia y resistencia a antibióticos, en canales de bovinos de rastros del altiplano central Mexicano, considerándose una fuente de contaminación importante y un riesgo para la salud pública.

Palabras clave: Escherichia coli, O157:H7, Toxinas Shiga, Multiresistencia.

 

Abstract

Meat is the main vehicle for food poisoning as a result of poor hygiene in the slaughtering of animals or during the handling of carcasses. This study analyzes three municipal slaughterhouses of the Central Mexican Plateau. Two hundred and twenty eight paired samples were obtained from carcasses (n= 114) and colon content (n= 114) of cattle slaughtered at these abattoirs. Two (0.8 %) E. coli O157: NM strains from colon content and 6 (2.6 %) E. coli O157: H7 strains (5 carcasses and 1 colon content) were found. The percentage of isolation from each slaughterhouse was variable, finding significant differences (P<0.05). In E. coli O157: NM and O157: H7 strains, it was observed that the highest resistance to cephalothin was 75 %, 62.5 % carbenicillin, 50 % amikacin and 50 % gentamicin. E. coli O157: H7 strains presented 16.7 % of the eae gene, 16.7 % eae, stx1 and stx2 genes and 66.7 % eae and stx2 genes. In conclusion the results obtained show the presence of E. coli O157: H7 virulence factors and antibiotic resistance in cattle carcasses of the Central Mexican Plateau, which is considered a major source of contamination and a public health risk.

Key words: Escherichia coli O157:H7, Shiga toxins, Multiresistance.

 

Las infecciones ocasionadas por E. coli O157:H7 suelen ser a través del consumo de agua o alimentos contaminados con excremento de animales portadores. Varios brotes de enfermedades se han asociado con el consumo de carne de bovino, lo que sugiere que el ganado es una importante fuente de contaminación que provoca infecciones en humanos^(1,2). En la patogenia de este agente, existen genes que codifican para la adherencia y esfacelamiento (A/E) de las microvellosidades del epitelio intestinal, los cuales se localizan en la isla de patogenicidad LEE (locus for enterocyte effacement); el principal gen que produce esta acción es el eae, que produce una proteína de 94 a 97 kDa llamada intimina. Se ha demostrado experimentalmente que la intimina estimula la inflamación e hiperplasia del intestino, lo que favorece la colonización^(3,4), otros autores reportan una adherencia localizada en íleon terminal, colon y ciego⁽⁵⁾. Las manifestaciones clínicas por E. coli O157:H7 están asociadas a las toxinas Stx1, Stx2 o ambas⁽³⁾. La toxina shiga (Stx) pertenece a una familia de proteínas estructurales y funcionalmente relacionadas con la toxina shiga sintetizada por SRigella dysenteriad^3,6\ Algunas variantes de Stx2 son más virulentas en humanos, sin embargo la capacidad toxica de E. coliO157:H7 es necesaria para el desarrollo de colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico y púrpura trombocitopénica, ya que éste es el principal mecanismo de patogenicidad⁽⁷⁾. El objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de E. coli O157.H7 en canales y contenido de colon de bovinos sacrificados en rastros del altiplano central Mexicano, detectar la resistencia a antibióticos, las toxinas Stx1, Stx2 y el gen eae mediante la técnica de PCR múltiple.

Se realizó un muestreo por conveniencia en tres rastros municipales del altiplano central Mexicano; (A, B y C); de estos, se tomó el número de animales sacrificados semanalmente, teniendo un total de 575 bovinos. El tamaño de muestra se obtuvo considerando una prevalencia del 2.7 %⁽⁸⁾ y un nivel de confianza del 95 % mediante la fórmula de tamaño de muestra de poblaciones finitas⁽⁹⁾. Una vez que se determinó el tamaño total de la muestra (38) se ponderaron en los tres rastros de forma proporcional al número de animales sacrificados, obteniendo el siguiente tamaño de muestra, en el rastro A= 8, rastro B=5 y rastro C= 25; se realizaron tres repeticiones en cada rastro teniendo un total de 114 muestras pareadas, 114 de canal y 114 de contenido de colon.

Las muestras de contenido de colon se tomaron después de la evisceración del animal; se tomó aproximadamente 1 g de excremento directamente del colon y se depositó en un tubo de ensaye con 9 ml de agua peptonada al 1 %^(7,10). La muestra de la canal se tomó después del lavado y antes de ser sometidas a refrigeración, se utilizó el método no destructivo con un hisopo en peptona al 0.1%+NaCI al 0.85 % descrito por la Unión Europea⁽¹¹⁾. Posteriormente cada hisopo se depositó en un tubo tipo Falcón con 25 ml de agua peptonada al 1 %.

Las muestras se transportaron en refrigeración al Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. Las muestras de contenido de colon y canales se incubaron 24 ± 2 h a 37 °C. Posteriormente se tomó una porción con el asa bacteriológica y se sembraron por estría en Agar MacConkey y Agar MacConkey Sorbitol (SMAC Becton Dickinson) y en Agar Gelosa Sangre e incubadas durante 24 ± 2 h a 37 °C^(10,12).

Las colonias sospechosas se diferenciaron por pruebas bioquímicas (TSI, LIA, SIM y MIO) por 24 h a 37 °C; una vez identificadas, fueron inoculadas en Agar base sangre durante 24 ± 2 h a 37 °C^(10,12) para la identificación serológica con antisueros monovalentes anti somático (Difco ^TM E. coli. O Antiserum O157) y anti flagelar (Difco ^TM E. coli H Antiserum H7).

La resistencia a los agentes antimicrobianos se determinó mediante la técnica de Kirby-Bauer estandarizada por el National Committee for Clinical Laboratory Standars^(13,14) utilizando como control E. coli ATCC 25922. Se evaluaron los siguientes antibióticos: amikacina (30 μg), ampicilina (10 μg), cefalotina (30 μg), cefotaxima (30 μg), ceftriazona (30 μg), cloranfenicol (30 μg), gentamicina (10 μg), netilmicina (30 μg), nitrofurantoina (300 μg), pefloxacina (5 μg) y trimetropim-sulfametoxasol (25 μg) (Sensidiscos, Gram Negativos BIO-RAD). Las lecturas se compararon con las tablas de interpretación de acuerdo al NCCLS^(13,14). La extracción de ADN se realizó mediante el kit comercial DNA Purification Wizard Genomic (Promega). La cepa de referencia utilizada fue E. coli EDL993 como testigo positivo; la base de secuencias y el tamaño previsto de la amplificación para los oligonucleótidos específicos a utilizar fueron los reportados por Blanco et al⁽¹⁵⁾ bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 95 °C por 5 min, seguido de 30 ciclos de 95 °C por 5 min de desnaturalización, 58 °C por 1 min de alineación y 72 °C durante 1 min de síntesis de ADN. Con el producto final se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se corrió 1:30 h a 85 voltios. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se colocó en un transluminador de luz ultravioleta (UV) para su observación. Los resultados se evaluaron con la prueba de Ji cuadrada con un intervalo de confianza del 95%⁽¹⁰⁾.

De un total de 228 muestras analizadas se aislaron 2 (0.8 %) cepas de E. coli que correspondieron al serotipo O157:NM el cual se obtuvo a partir de contenido de colon y 6 (2.6 %) a E. coli O157:H7 (5 de canales y 1 de contenido de colon). El porcentaje de aislamiento de cada rastro fue variable, en el rastro B no se obtuvieron aislamientos, en el rastro A 0.43 % y en el C 2.2 % (P<0.05). Las cepas de E. coli O157:NM y O157:H7 fueron resistentes a cefalotina con 75 %, carbencilina 62.5 %, amikacina 50 % y gentamicina 50%. Mediante la técnica de PCR se observó que de las cepas de E. coli O157:H7, el 16.7 % presentó gen eae, 16.7 % los genes eae, stx1 y stx2 y el 66.7 % el gen eae y stx2; además que una cepa presentó una banda para stx2 A1 (Figura 1), (Cuadro 1).

En este trabajo se demuestra la importancia y riesgo significativo para la salud pública que los bovinos portadores de E. coli O157:H7 representan, ya que cuando el manejo en rastros es inadecuado, puede resultar contaminada la canal. En este estudio se obtuvo una prevalencia de 2.6 %, similar a lo reportado por Varela et al⁽⁸⁾, quienes encontraron 2.7 % en el estado de Jalisco; México. En comparación con otros estudios podemos encontrar prevalencias variables en canales como en Estambul con un 2.4 %⁽¹⁶⁾, Egipto con 6 %⁽¹⁷⁾, 0.2 % en Francia⁽¹⁸⁾. En un estudio realizado⁽¹⁹⁾ en plantas empacadoras en Estados Unidos, encontraron una prevalencia de 4.9 %, aunque también han reportado prevalencias que van de 0.1 a 54 %, por lo que podemos considerar que hay diferentes factores que intervienen para su aislamiento. En excremento se han encontrado 2.6 % en Canadá⁽²⁰⁾, 1 % Brasil⁽²¹⁾, 0.19 % en Noruega⁽²²⁾, y posibles factores responsables de la variabilidad entre los porcentajes de aislamiento incluyen el lugar geográfico, manejo en rastro, protocolo de muestreo y aislamiento, además de la época del año.

La posibilidad de que E. coli O157:H7 se encuentre presente en alimentos y utensilios lavados con agua contaminada también debe ser considerado⁽²³⁾. Los resultados obtenidos por Abdul-Raouf et al⁽¹⁷⁾, indican que los alimentos de origen animal con frecuencia están contaminados con E. coli O157:H7 y señala la necesidad de mejorar el proceso de la carne; indicando que la contaminación de la canal es por el mal manejo que se le da al contenido intestinal de bovinos portadores, por lo tanto una estrategia para reducir el riesgo de infecciones por E. coli O157:H7 en los humanos es reducir la prevalencia en el ganado, además de mejorar el manejo en los rastros. En cuanto a las toxinas Shiga Stx1 y Stx2, éstas son las desencadenantes principales de la trombosis microvascular del síndrome urémico hemolítico⁽²⁴⁾. Se menciona⁽²¹⁾, que de los aislamientos de E. coli O157:H7 sólo el 40 % fueron positivos para ambas toxinas. Yilmaz et al⁽²⁵⁾, reportaron 27 aislamientos, y de estos uno fue positivo al gen de adherencia y las toxinas, lo que se considera de gran importancia clínica. Irino et al⁽²⁰⁾, obtuvieron dos aislamientos positivos al gen eae y la toxina Stx2, mientras que otros autores⁽²²⁾, encontraron una cepa con el gen eae y las dos toxinas, además de dos cepas con el gen eae y la toxina Stx2, por lo que se puede observar que las cepas presentan mayor frecuencia del gen eae y Stx2, resultados similares a los de este estudio.

Los resultados obtenidos sobre la resistencia de E. coli O157:H7 han sido variados; en este estudio se encontró la resistencia a cinco antibióticos, amikacina, ampicilina, carbencilina, cefalotina y gentamicina. Alali et al⁽²⁶⁾, encontraron que la E. coli O157:H7 fue resistente a la neomicina y oxitetraciclina. También han reportado resistencia a la tetraciclina en aislamientos de bovinos^(26,27). Ratnam et al⁽²⁷⁾, mencionaron que de las 174 cepas estudiadas de E. coli O157:H7, una fue resistente a la ampicilina, carbencilina y tetraciclina, y otras cuatro cepas fueron resistentes sólo a tetraciclina. Byrne et al⁽¹⁸⁾, encontraron 6 aislamientos resistente sólo a sulfametoxazol, tetraciclina y estreptomicina. Galland et al⁽²⁸⁾, reportaron 4 cepas resistentes a trimetropim-sulfametoxazol, 10 a ampicilina, 23 a tetraciclina, 27 a amoxicilina-Ac. Clavulónico, 57 a penicilina, eritromicina y clindamicina, de un total de 57 aislamientos. La aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos en las canales pone en riesgo la salud humana; la carne de vacuno contaminada con bacterias resistentes a los antimicrobianos al no ser debidamente manipulados y cocinados, podrían transferir sus genes de resistencia además de sus toxinas, lo que podría conducir a una enfermedad difícil de tratar^(3,20).

Se demostró la presencia de E. coli O157:H7, sus genes de toxinas y adherencia, así como la resistencia múltiple a antibióticos en canales y contenido de colon de bovinos sacrificados en rastros del altiplano central Mexicano; lo cual se considera como un riesgo alto para la salud pública, y hace necesario evaluar cada una de las etapas del proceso de carnización, para identificar dónde ocurre la contaminación; además de realizar la vigilancia permanente del uso de los antibióticos en la ganadería.

 

LITERATURA CITADA

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