Anteriormente Pasteurella haemolytica se clasificaba en dos biotipos, A y T de acuerdo a su habilidad para fermentar la arabinosa o latrehalosa, respectivamente. El complejo P. haemolytica negativo a la trehalosa fue reclasificado hace más de dos décadas dentro del género Mannheimia que incluye al menos seis especies: M. haemolytica, M. granulomatis, M. varigena, M. ruminalis, M. caviae y M. glucosida. Conforme a la clasificación actual, M. haemolytica incluye los serotipos capsulares 1, 2, 5-9, 12-14, 16 y 17 de P. haemolytica^1,2.

M. haemolytica (Mh) es la bacteria más patógena dentro del género, y frecuentemente asociada con enfermedades del aparato respiratorio de los bovinos, particularmente con la aún definida pasteurelosis neumónica bovina, también conocida como fiebre de embarque³. Mh reside en las tonsilas y la nasofaringe de animales aparentemente sanos^4,5, pero en animales inmunocomprometidos por infecciones virales preexistentes o estresados por el manejo, principalmente menores de un año o recientemente transportados, puede descender a los pulmones y desarrollar una neumonía^3,6. La morbilidad y la mortalidad asociada con esta enfermedad producen grandes pérdidas, por lo que se considera la causa más relevante en cuanto a las pérdidas económicas en la industria bovina^3,5.

Los estudios sobre caracterización epidemiológica requieren del uso tanto de métodos fenotípicos como genotípicos. Los métodos fenotípicos para la caracterización de las especies de Mannheimia se han utilizado durante mucho tiempo y aunque se acepta que su reproducibilidad es alta, sus limitaciones han sido reconocidas ampliamente^7,8. En estudios realizados para evaluar la especificidad de la serotipificación como una herramienta diagnóstica, se ha demostrado que no es un método confiable para la correcta identificación de Mh, y se hace énfasis sobre la necesidad de una amplia caracterización fenotípica y genotípica para la adecuada identificación de este microorganismo, considerando las dificultades que han presentado otros estudios para su clasificación basado solamente en la fenotipificación y la serotipificación^2,8, teniendo en cuenta que el género Mannheimia abarca taxones de una gran heterogeneidad fenotípica y genotípica⁸.

Entre los métodos de tipificación molecular se cuenta con diversas técnicas, entre las cuales se pueden destacar la hibridación de ADN-ADN, electroforesis de enzimas multilocus (EEML), amplificación al azar del polimorfismo del ADN (RAPD), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), y el análisis de restricción para la detección de los genes del ARNr o ribotipificación. Esta última es una herramienta que ha demostrado ser de gran utilidad en estudios de epidemiología molecular de diferentes especies bacterianas^9,10 y estudios que involucran a Pasteurella^6-8.

En México no se han realizado estudios de caracterización genómica de aislamientos de Mannheimia obtenidas de bovinos. Los estudios realizados desde la década de los 80 se han enfocado en la caracterización fenotípica del microorganismo, los cuales reportan a los serotipos A1 y A2 como los más frecuentes en bovinos^11,12. En este estudio, se utilizó la ribotipificación con el propósito de determinar las características y las diferencias genotípicas de aislamientos de Mannheimia haemolytica serotipo 1 (S1), obtenidos de exudado nasal de bovinos clínicamente sanos (BCS) y clínicamente enfermos (BCE) de neumonía, de granjas lecheras ubicadas en dos zonas ganaderas de gran importancia en el país.

Se emplearon 106 aislamientos de Mannheimia haemolytica serotipo 1 (S1) obtenidos de exudado nasal de bovinos clínicamente sanos (BCS) (n= 80) y clínicamente enfermos de neumonía (BCE) (n= 26) de dos complejos lecheros; uno ubicado en el valle central de Tizayuca (TZY) (BCS= 29; BCE= 18), estado de Hidalgo y otro en la Región Lagunera de Torreón (TOR) (BCS= 51; BCE= 8) en el estado de Coahuila, México. El aislamiento, identificación y serotipificación se realizaron en estudios previos mediante métodos convencionales de cultivo in vitro y pruebas bioquímicas e inmunológicas^13,14. Además, se incluyeron las cepas de referencia de Mh de lo serotipos 1, 2, 5-9, 11, 12 (donadas por el Dr. GH Frank y el Dr. B Briggs, NADC, USDA).

Los aislamientos se crecieron en caldo infusión cerebro corazón (BHI) durante 18 h a 37 °C con agitación orbital a 250 rpm. La extracción del ADN cromosómico se realizó según el método descrito por Pitcher et al¹⁵. La digestión del DNA se realizó utilizando la enzima de restricción HindIII (Invitrogen^®) a 37 °C durante toda la noche, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los productos de las digestiones se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio a 20 V por 19 h. El DNA se transfirió a membranas de nylon (0.45 µm) mediante el método de transferencia capilar (Figura 1).

Figura 1. Perfil electroforético del ADN cromosómico de cepas de M. haemolytica de referencia y de aislamientos de campo digerido con HindIII en gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X, teñido con bromuro de etidio. Líneas 1 a 7 cepas de referencia serotipos 1, 2, 5-9, líneas 8 y 9 aislamientos de campo. 

La sonda que contiene el operón rrnB rRNA de E. coli se obtuvo del plásmido pKK3535¹⁶. Brevemente, la extracción del ADN plasmídico pKK3535 se realizó utilizando el sistema comercial QIAprep (Qiagen^®), el ADN obtenido se digirió con la enzima de restricción BclI (New England BioLabs^®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de 5.9 kb que contiene el operón rrnB se purificó utilizando el sistema comercial QiaEX II (Qiagen^®) y posteriormente se marcó con digoxigenina utilizando el sistema DIG- High Prime (Roche^®).

Las membranas de nylon se colocaron en una solución de prehibridación a 42 °C por 2 h. Posteriormente se depositaron en una solución de hibridación que contenía la sonda marcada a 42 °C por 16 h (durante la noche). Las membranas se bloquearon durante 1 h y posteriormente se agregó el conjugado anti DIG-AP diluido 1:20,000 en buffer maléico y las membranas se incubaron por 30 min. Para la detección de las bandas las membranas se cubrieron con 1 ml de reactivo iniciador (CDP Starter-CSPD, Roche^®) y se expusieron a películas auto-radiográficas (Hyperfilm, Amersham Biosciences).

Los patrones de los ribotipos se analizaron mediante el programa BioNumerics versión 7.0 (Applied Maths). Se elaboraron dendrogramas para analizar la similitud entre los aislamientos y las cepas de referencia de M. haemolytica mediante el coeficiente de Dice con máxima similitud. El análisis de los cluster se realizó mediante el uso del “Unweighted Pair Group Method of Arithmetic Averages” (UPGMA).

En los 106 aislamientos se identificaron dos patrones de ribotipos: Rt1 y Rt2; el Rt1 con 11 bandas de hibridación y el Rt2 con 13 bandas, en ambos casos con tamaños aproximados de 0.78 a 19.70 kb (Figura 2). El 96 % (102/106) de los aislamientos fue Rt1 (BCS= 77; BCE= 25), el cual presentó bandas de hibridación con tamaños aproximados de 0.78, 1.53, 1.92, 2.03, 2.9, 3.27, 4.77, 8.05, 11.80, 14.90 y 19.70 kb; cuatro aislamientos fueron Rt2 (BCS= 3; BCE= 1). Los dos Rt compartieron las bandas de 0.78, 1.53, 2.9, 3.27, 4.77, 8.05, 11.8, 14.9 y 19.7 kb; las bandas de 1.92 y 2.03 kb presentes en el Rt1 estaban ausentes en el RT2; y las bandas de 1.0, 1.02, 1.7, 3.7 y 4.2 kb del Rt2 estaban ausentes en el Rt1. En comparación con las cepas de referencia ambos Rt (1 y 2) sólo compartieron nueve bandas de 0.78, 1.53, 2.9, 3.27, 4.77, 8.05, 11.8, 14.9 y 19.7 kb. Por su parte el Rt2 compartió las bandas de 1.0, 1.02 y 3.7 kb.

Figura 2. Principales ribotipos presentes en cepas de M. haemolytica A1 usando la enzima de restricción HindIII. Ref= cepas de referencia de diferentes serotipos de M. haemolytica; Rt1= perfil del ribotipo R1; Rt2= perfil del ribotipo R2; TZY= Tizayuca; TOR= Torreón 

La relación genética entre los 2 Rt se presenta en el dendrograma de la Figura 1, donde se muestran las estimaciones del grado de similitud entre los aislamientos de campo y las cepas de referencia de Mh. No se identificaron diferencias entre los Rt de los aislamientos de animales BCS o BCE.

En el dendrograma se observan los tres cluster que se conformaron, cada uno con 100 % de similitud. En el primero se agrupan lo serotipos de la cepa de referencia de Mh, y todos ellos presentaron el mismo patrón de bandas de hibridación. En el segundo cluster se agrupan los aislamientos del Rt2, tres aislamientos de TZY y uno de TOR, y en el tercer cluster una muestra conformada por 12 aislamientos del Rt1, seis de TZY y seis de TOR. Se observaron los siguientes porcentajes de similitud: 91 % entre el Rt2 y la cepa de referencia y entre el Rt1 y la cepa de referencia 70 % (Figura 2).

La mayoría de los estudios sobre Mh realizados en México se han enfocado en la caracterización fenotípica del microorganismo; en el presente estudio la caracterización de aislamientos de Mannheimia haemolytica obtenidos de exudado nasal de bovinos, se confirmó mediante la ribotipificación con base en resultados de estudios taxonómicos previos^13,14.

En este estudio la ribotipificación con la enzima HindIII pudo diferenciar el S1 de M. haemolytica en dos grupos genéticos diferentes (Rt1 y Rt2), y demostró ser de gran utilidad en la caracterización de aislamientos de Mannheimia spp., esto coincide con lo reportado por otros estudios^8,17,18 pero contrasta con los hallazgos de Murphy et al⁶, quienes reportaron que la enzima fue incapaz de distinguir ribotipos entre aislamientos de P. haemolytica S1.

Tanto en TZY como en TOR la mayoría de los aislamientos S1 se agruparon en el Rt1 en un cluster totalmente homogéneo, lo cual coincide con lo reportado por Kodjo et al¹⁷ quienes caracterizaron cepas de P. haemolytica (M. haemolytica) utilizando la enzima de restricción HindIII. Estos hallazgos evidencian que la mayoría de los aislamientos de Mh S1, de TZY y de TOR, fueron genéticamente indistinguibles, ya que dentro de los cluster correspondientes compartieron el mismo ribotipo con el mismo número de bandas, además no hubo diferencias entre los Rt aislados de los BCS y BCE. Desde el punto de vista epidemiológico se puede considerar que estos aislamientos corresponden a una misma cepa dentro de cada uno de los cluster que agrupan el S1. Los aislamientos del Rt2 presentaron una estrecha relación genética con las cepas de referencia de Mh (91 %); sin embargo, el Rt1 mostró una similitud del 70 % con dichas cepas. Estas diferencias en el patrón de bandas entre las cepas de referencia y las correspondientes a los Rt 1 y 2 podrían deberse a mutaciones en el genoma de estas últimas, como lo señala Snipes et al¹⁹, quizá como consecuencia de influencias del medio ambiente, muchas de las cuales son desconocidas; un ejemplo de ello es la variación fenotípica por influencia del ambiente externo de las proteínas de membrana externa reguladas por hierro en P. multocida. Asimismo, es posible que dicha diferencia tenga como base la ausencia o presencia de sitios de corte de la enzima de restricción utilizada. Un solo cambio de nucleótido puede cambiar un sitio y generar un cluster diferente. En este trabajo se utilizaron cepas de referencia de los años 1970-1980, que al compararlas con los aislamientos obtenidos (2003) se observaron estos cambios. El encontrar un grupo homogéneo nos demuestra que estos aislamientos están sometidos a una presión de selección constante, donde se observa un patrón de ribotipos altamente homogéneo. Asimismo, el encontrar un grupo homogéneo demuestra que los aislamientos analizados en este trabajo forman un núcleo genéticamente estable en nuestro país, al menos de los aislamientos analizados.

En este estudio se encontraron dos Rt que correspondieron a un solo serotipo, lo cual coincide con lo reportado por Snipes et al²⁰. Estos aislamientos del mismo serotipo, pero de diferente Rt pueden ser cepas con diferente genotipo que posean porciones de sus genomas que codifiquen en la producción de ciertos antígenos similares que les permiten compartir el serotipo, pero no el genotipo, ya que poseen otras porciones significativas del genoma que son diferentes, por ejemplo, genes rRNA que son altamente conservados y no son sujetos de mutaciones frecuentes¹⁹.

No obstante que se ha cuestionado el valor de la ribotipificación para calcular las distancias taxonómicas entre cepas o para la diferenciación de aislamientos²¹, esta herramienta ha demostrado su validez para la clasificación y agrupación de diversos grupos de bacterias, incluyendo la familia Pasteurellaceae¹⁸. Se ha podido demostrar la correlación entre los clusters obtenidos por ribotipos y mediante electroforesis de enzimas multilocus (MLEE) tanto de P. multocida como de M. haemolytica^22,23, así como con el análisis por endonucleasas de restricción (REA) de P. multocida¹⁹.

De acuerdo con los hallazgos de este trabajo, la ribotipificación fue útil para distinguir aislamientos del mismo género y especie, en coincidencia con los resultados de otros estudios con Mannheimia^7,20,24, o con otras bacterias de la familia Pasteurellaceae^19,24,25, concluyendo que la mayoría de los aislamientos se agrupan dentro un mismo Rt (Rt1) conformando un solo cluster, independientemente del origen de las mismas y del estado de salud de los animales.