El uso de líneas celulares tiene una amplia gama de aplicaciones, de las que se pueden identificar estudios de fisiología celular, desarrollo de microorganismos intracelulares, identificación de vías metabólicas, entre otros. La investigación en la resolución de la enfermedad conocida como anaplasmosis bovina, se ha basado en el uso de animales para reproducir la rickettsia Anaplasma marginale. Los eritrocitos son aparentemente la célula huésped de esta rickettsia¹, pero adicionalmente se ha sugerido que células de carácter endotelial puedan jugar un papel en la infección del huésped bovino².

Por un lado, se han realizado múltiples intentos para tratar de mantener la rickettsia en condiciones de laboratorio en México³. Por otro lado, la línea celular BUVEC E₆E₇ fue desarrollada para estudios de fisiología celular⁴, y con la intención de seguir utilizándola para realizar estudios de invasión por la rickettsia entre otros, se necesita información relativa a su desarrollo en condiciones in vitro no clarificadas anteriormente, para su manipulación en el laboratorio. El objetivo consistió en determinar el tiempo de duplicación de la línea celular BUVEC E₆E₇ en las condiciones de laboratorio.

La línea celular BUVEC E₆E₇ se obtuvo del Instituto de Neurobiología de la UNAM. Las condiciones para su mantenimiento en el laboratorio incluyen el uso del medio F-12 (HAM) suplementado con 1.5 g/L NaHCO₃, y 10% de suero bovino fetal (v/v), esterilizado por ultrafiltración, esto es, tamaño del poro de 0.22 µm. Los contenedores utilizados, se incubaron a 37 °C en una atmósfera de 5.0% CO₂ en aire saturado de humedad. Los protocolos de los ensayos se aplicaron siguiendo lo previamente publicado por Machuca et al⁵, con ligeras modificaciones. Los valores promedio, el error estándar y los intervalos de confianza al 95%, se determinaron utilizando el programa Microsoft® Office Excel 2007⁶.

El primer experimento consistió en ensayar por cuadruplicado la dosis de siembra mínima en placas de 24 pozos al hacer diluciones dobles, a partir de 2.0 x 10⁴ células totales por pozo, hasta obtener los valores de 1.0 x 10⁴, 5.0 x 10³ y 2.5 x 10³, células totales por pozo suspendidas en 350 µl. El criterio de cosecha fue que cuando alguno de los pozos alcanzara ≥95 % confluencia a la observación microscópica, se cosecharían todos ellos, mediante la aplicación de una solución de tripsina-EDTA para desprender el monoestrato y contar en el hemocitómetro.

En el segundo ensayo, se siguió un procedimiento semejante pero a la inversa; los cultivos se iniciaron con dosis crecientes, partiendo de 1, 3, 9 y 27 células/mm², cosechando cada tratamiento de manera individual, al alcanzar ≥95 % confluencia.

Con base en los resultados del segundo experimento, se eligió una densidad de siembra para el tercer ensayo, llevado al cabo por triplicado en cajas de Petri de 35 mm Ø, con dos series, A y B. En la serie A se hizo cambio de medio cada 48 h, mientras que en la serie B no hubo cambio de medio; cosechando las muestras a intervalos de 8 h en ambas. Con los resultados de estos ensayos, se aplicó el modelo de tiempo de duplicación, DT= T ln2 / ln(Xe/Xb)⁷; donde: T= es el tiempo de incubación= intervalo [T _final - T _inicial] en horas; Xb= es el valor inicial; Xe= es el valor final del número promedio de células por caja, de la fase de crecimiento logarítmico.

Del experimento 1 se observó el primer pozo con ≥95 % confluencia a las 120 h de su inicio, realizándose la cosecha en todos ellos. El rendimiento promedio obtenido fue de 2.35 x 10⁵, 1.92 x 10⁵, 9.44 x 10⁴ y 5.62 x10⁴ con una desviación estándar de ± 2.17 x 10⁵, 1.87 x 10⁵, 8.64 x 10⁴ y 5.21 x 10⁴. Ello representó un crecimiento promedio de 2.15 x 10⁵, 1.82 x10⁵, 8.94 x 10⁴ y 5.37 x 10⁴ células totales por pozo y un incremento de 10.8, 18.2, 17.9 y 21.5 veces la concentración inicial, respectivamente (Cuadro 1).

Para el experimento 2 los rendimientos celulares observados fueron, 8.0 x 10⁴, 9.3 x 10⁴, 6.3 x 10⁴ y 6.5 x 10⁴ células totales promedio por pozo, lo que arrojó índices de crecimiento de 451.7, 171.0, 38.3 y12.5 veces, al cosechar a las 154.5, 130.5, 106.5 y 82.5 h de iniciado el ensayo, respectivamente (Cuadro 2).

La morfología sin alteraciones aparentes se muestra en la Figura 1. El máximo crecimiento observado para las series A y B del experimento 3, fue a las 152 h, con valores de 2.41 x 10⁶ y 7.67 x 10⁵ células totales en promedio, respectivamente (Figura 2). La diferencia en promedio fue de 7.67 x 10⁵ células totales. El rendimiento celular de la serie A, con cambio de medio, fue 864 veces; mientras que en la serie B, sin cambio de medio, fue menor, 568.5 veces. En el Cuadro 3 se resume la información numérica utilizada para aplicación de la fórmula de determinación del tiempo de duplicación derivados del tercer experimento, así como sus valores de R² con base en su línea de tendencia exponencial en congruencia con la fórmula indicada, mostrando un alto grado de paralelismo.

Figura 1: Micro fotografía de la línea celular BUVEC E₆E₇ de origen bovino. A: morfología típica natural y B: morfología post cosecha con una solución de tripsina-EDTA 

*Cultivos iniciados con una densidad de 3 células /mm². Mantenidos en Medio F-12 (HAM), suplementado con 1.5 g/l de NaHCO₃ y 10 % (v/v) suero fetal bovino inactivado a 56 °C. A: con cambio de medio cada 48 h, B: sin cambio de medio. El intervalo del crecimiento logarítmico ocurre entre las 80 y las 152 h en cultivo, para la serie A y entre las 88 y 152 h, para la serie B.

Figura 2 Crecimiento comparativo de la línea celular BUVEC E₆E₇ de origen bovino, con (A) o sin (B) cambio de medio de cultivo, habiendo iniciado el día 0*  

Los experimentos en conjunto permiten aseverar que la línea celular se comporta con un vigor de crecimiento inusual, y que aun cuando su característica sea de una célula epitelial, aparentemente no requiere la cercanía o contacto con otras células para proliferar o formar el monoestrato. El rendimiento obtenido en tan corto plazo, representa una gran velocidad de crecimiento que posiblemente no sea compatible en un co-cultivo con la rickettsia A. marginale, cuyo desarrollo podría ser aparentemente más lento, y ello en parte explicaría los magros resultados obtenidos en ensayos anteriores⁸. En contraste, en células embrionarias de garrapata Ixodes scapularis, cuya velocidad de crecimiento es más lenta, se ha logrado el cultivo de esta rickettsia con aislados de Estados Unidos y Brasil⁹. Por otra parte, en otros estudios en los que utilizaron muestras purificadas del microorganismo proveniente de células endoteliales infectadas con A. marginale, no fueron capaces de infectar bovinos susceptibles, ni inducir una respuesta inmune detectable¹⁰, concluyendo que aparentemente las células endoteliales no participan en el ciclo de infección en el mamífero; en oposición a lo previamente descrito por Carreño et al².

La línea celular BUVEC E₆E₇ puede proliferar de manera continua hasta formar el monoestrato sin adición de medio fresco, hasta por 152 h, equivalente a 6.3 días en cultivo, bajo condiciones estables de atmósfera y temperatura ambiente, lo que la hace candidata para eventuales estudios comparativos de metabolismo de nutrientes para otras especies del género Anaplasma de importancia también en la salud pública¹¹.