Factores en la infección de Mycobacterium bovis

Los factores que influyen en el desarrollo de infecciones son: el hospedero, el patógeno y el ambiente^9,10. Todos ellos interactúan e influyen en la manifestación de la misma⁹. En el caso de la TBb se ha determinado que existe una heredabilidad significativa para la resistencia del huésped a la enfermedad en el ganado; este parámetro es de gran importancia ya que es uno de los factores que determinarán el éxito potencial de los esquemas de selección en la producción ganadera^9,11,12. Potencialmente el seleccionar individuos genéticamente resistentes a la TBb, puede contribuir a reducir el problema¹².

Estudios de resistencia

Tanto en humanos como en animales se han realizado estudios tratando de diferenciar individuos genéticamente resistentes a la tuberculosis. Estudios en gemelos proporcionan una prueba definitiva de que los factores hereditarios son determinantes para el desarrollo de la enfermedad, es decir que existe una mayor tasa de concordancia entre gemelos monocigóticos versus dicigóticos, lo cual indica que la susceptibilidad hereditaria es un factor determinante para el desarrollo de la tuberculosis en los seres humanos¹¹.

En 1926, 251 infantes fueron accidentalmente “vacunados” con una cepa viva virulenta de M. tuberculosis, los cuales mostraron una amplia gama de respuestas a la infección, demostrando la existencia de factores innatos que influyen en el desarrollo de la infección¹³. En el caso específico de M. bovis, en los años 40s se encontró que dos cepas consanguíneas de conejos mostraron dos fenotipos, uno susceptible y otro resistente a la infección, lo que sugirió que el perfil de la enfermedad desarrollada por los conejos tiene un fuerte componente de herencia genética¹⁴. La diferencia de susceptibilidad de ratones a la cepa vacunal BCG (Bacillus de Calmette y Guérin, vacuna contra la tuberculosis a partir de extracto atenuado de Mycobacterium bovis) de M. bovis llevó a la identificación del primer locus de susceptibilidad a la TBb, conocido como el gen Nramp1¹⁵.

La resistencia genética a enfermedades se ha explorado en varios países^16-20, y la información generada se ha implementado ya en programas de mejora genética en el ganado, como ha ocurrido con mastitis²¹. En tuberculosis, algunos estudios han reportado razas de ganado con diferente nivel de susceptibilidad; la raza cebú demostró ser más resistente que la Holstein y las cruzas de Holstein con cebú, a diferencia de las razas europeas que mostraron un patrón de lesiones más severo^6,22.

Bermingham et al²³⁾ estimaron índices de heredabilidad entre 0.14 y 0.18 para la respuesta positiva a la prueba de la tuberculina y la infección confirmada de TBb en ganado Holstein-Friesian. Estudios en ciervo rojo han demostrado diferencias en susceptibilidad y transmisión de la especie, sugiriendo fuertes bases genéticas²⁴; la heredabilidad de resistencia en esta especie fue estimada en 0.48. En venado cola blanca se demostró que los animales con infección eran genéticamente más similares entre ellos que los no infectados²⁴.

En ganado cebú se han reportado dos alelos asociados significantemente con una baja incidencia de TBb en una región microsatélite del gen Nramp1 (25)¹⁹. De igual manera, en ganado europeo (Bos taurus) se encontraron dos microsatélites, BMS2753 y INRA111 fuertemente asociados con una respuesta positiva a la prueba de la tuberculina¹⁸; este último (INRA111), también ha sido asociado con la susceptibilidad de padecer mastitis²⁵.

El escaneo del genoma completo también ha sido utilizado con éxito en el ganado Holstein-Friesian²⁰. Un estudio reveló tres SNP (polimorfismos de un solo nucleótido) en el cromosoma 22 asociados con susceptibilidad a la TBb²⁰. También se ha encontrado asociación significativa entre el receptor TLR1 en el sitio TLR1-G1596A y la susceptibilidad a la TBb²⁶.

Un estudio reciente que incluye el análisis de diferentes fenotipos (animales reactores a tuberculina, lesiones visibles y aislamiento de M. bovis por cultivo) en la susceptibilidad a TBb, identificó 2 SNP, en los cromosomas 2 y 23, asociados significativamente con diferentes rasgos de susceptibilidad, los cuales proporcionan posibles marcadores para la selección de individuos susceptibles, diferenciándolos de aquéllos con el potencial de resistencia a la enfermedad²⁷.

Genes asociados a resistencia

En estudios de expresión génica se han identificado genes diferencialmente expresados entre animales infectados y no infectados con TBb. Los más frecuentes son: Adam17, Cxcr3, Ier5, Phb2, Cd84, Tbk1, Tlr2, Tlr3, Bcl2, Nfatc4, Ifng, Ifngr1, Tnfsf13b, Kiaa1971, Slamf1, Casp1, Defb10, Ifnar1, Kir3ds1, Myd88, Ptpn2, Stat1, Stat2, Trem1, Tyk2, Tyrobp, Cd83, Ctla4, IL1A, IL8, e IL15^28-31.

Se ha propuesto que algunos otros patógenos, tales como Brucella abortus, Mycobacterium avium y Mycobacterium paratuberculosis pueden activar genes similares³²; por lo tanto, al seleccionar animales con resistencia a la TBb, se podría beneficiar también el control de las enfermedades causadas por estos microorganismos. Varios de los genes mencionados, además del Vdr y el Tlr2, también se han asociado a respuesta inmune y a TBh³³.

Estrategias de estudio de marcadores asociados a resistencia

En general, los estudios de asociación genética a la TBb se dividen en dos grandes grupos: 1) de genes candidatos específicos y 2) de genoma completo²⁰. Los primeros estudian SNP u otras variaciones en genes de relevancia biológica. Por ejemplo, se han seleccionado genes relacionados con respuesta inmune o asociados a otras enfermedades. En este tipo de estudios se utiliza un número relativamente bajo de marcadores⁹. Los estudios de genoma completo, por su parte, incluyen la genotipificación de marcadores polimórficos en todo el genoma. Este último procedimiento posee la ventaja de que en el proceso se pueden identificar otros genes que confieran resistencia y no necesariamente estén asociados a respuesta inmune^37). No obstante, el procedimiento a seguir depende de la información disponible, y de si se conoce o no el genoma completo de la especie de interés. Aunque el mejor método de estudio es el de "genoma completo", en especies con poca información genómica, el método recomendable será el de identificación de genes específicos⁹.

Limitantes en el diseño de los estudios de resistencia

Los estudios de asociación genética en ganado no están libres de errores. Uno de los principales riesgos es el de encontrar asociación ficticia entre variación genética y resistencia o susceptibilidad a la tuberculosis, por lo que es necesario que toda asociación sea verificada por la replicación de los resultados³⁸. Varios son los factores a considerar en estudios genéticos de susceptibilidad y resistencia. Es vital la precisión del diagnóstico de la enfermedad utilizando las pruebas diagnósticas con la mejor sensibilidad y especificidad para definir casos y controles, es decir, animales verdaderamente enfermos y animales verdaderamente sanos. La identificación de fenotipos debe ser precisa de acuerdo a la pregunta de interés; por ejemplo, en el caso de TBb si se tiene interés en determinar la enfermedad activa, la prueba de la tuberculina no es la mejor opción debido a su baja sensibilidad; el grupo de casos (animales verdaderamente enfermos) debe estar conformado únicamente por animales que presenten lesiones sugestivas de tuberculosis en rastro, y que la enfermedad sea posteriormente confirmada por el aislamiento del Mycobacterium por cultivo (prueba de oro)³⁹. El grupo control, por su parte, debe estar conformado por animales que no presenten lesiones sugestivas en rastro y que sean negativos al cultivo. Ambos grupos, casos y controles deben tener exposiciones comparables al patógeno para clasificar correctamente a los fenotipos de susceptibilidad y resistencia, y ser ajustados por otros factores tales como edad, medio ambiente, etc.³⁹. Es muy recomendable que ambos grupos provengan de los mismos hatos, de los cuales se tenga la tasa de incidencia de la enfermedad³⁹.

El tamaño de la muestra es también importante, y debe ser lo suficientemente grande para asegurar potencia estadística en la detección de variantes con efectos pequeños. El poder estadístico es una función del tamaño de la población de estudio, así como de la frecuencia alélica del SNP y del tamaño de su efecto sobre el fenotipo evaluado. En este aspecto el tamaño de la muestra debe estar en el orden de los cientos y hasta de los miles. La falta de potencia estadística debido a tamaños de muestra inadecuadas es una de las causas más frecuentes de resultados de asociación no reproducibles³⁸.

Uso de SNP para asociar resistencia a tuberculosis

El ADN está compuesto por cuatro bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina. Cuando se detectan diferencias en una sola base se le conoce como polimorfismo de un solo nucleótido o SNP. La ubicación de los SNP puede estar asociada a genes relacionados con características importantes de los individuos para mejorar diferentes parámetros productivos, por ejemplo, producción y porcentaje de grasa y proteínas en leche, intervalo entre partos y peso al destete, entre otras⁴⁰. Estos marcadores se han utilizado también con éxito en la determinación de identidad genética y del parentesco de los animales³⁵. Incluso, existen estudios que utilizando esta herramienta han identificado ya fenotipos de resistencia y susceptibilidad a enfermedades en ganadería, como es el caso de la mastitis^8,41,42,43.

En estudios de asociación se comparan las frecuencias alélicas de marcadores específicos entre individuos infectados, enfermos, no infectados y no enfermos. Los estudios de asociación se dividen en aquéllos que tienen un gen como candidato y los que estudian todo el genoma⁹. Dentro de los genes candidatos se investigan los SNP considerados de importancia biológica. En el caso de tuberculosis, generalmente se seleccionan genes implicados en la respuesta inmune o que han demostrado asociación a otras enfermedades infecciosas⁹.

Como ya se mencionó, la estructura genética de los individuos juega un papel importante en el desarrollo de la tuberculosis, tanto para humanos como para animales. El estudiar el patrón de expresión génica de un fenotipo en particular, da lugar a la identificación de genes candidatos, como el Slc11a1 (Solute Carrier Family 11 Member 1), que modula la actividad de los macrófagos contra parásitos intracelulares durante las primeras etapas de la infección²⁰. En estudios de transcriptómica se identifican las diferencias en los perfiles de expresión génica entre los grupos de animales seleccionados para identificar los marcadores de infección que garanticen, en conjunto con datos poblacionales, la selección de animales resistentes o susceptibles a la enfermedad⁹.

Los SNP también se han utilizado para determinar asociación de genes con la resistencia a medicamentos utilizados en el tratamiento de la TBh; uno de los principales es la isoniazida (INH). Algunos estudios han indicado que la tasa media de resistencia primaria a INH es del 7.3 %⁴⁴. Con el análisis de 20 genes (FurA, KatG, MabA, InhA, AhpC, Rv0340, IniB, IniA, IniC, SrmR homolog, FabD, KasA, AccD6, FbpC, FadE24, EfpA, Rv1592c, Rv1772, Ndh, NhoA) implicados en la resistencia a INH y secuenciados para obtención de SNP, se encontraron 17 (44.7 %) aislados resistentes a INH, con mutaciones en los genes KatG, MabA y Rv1772. Setenta y seis (76) por ciento de todos los aislados resistentes a INH mostraban una mutación en el gen KatG, confirmando variabilidad genética de individuos resistentes y susceptibles al fármaco, igual que ocurre con las enfermedades⁴⁵.

Los estudios de resistencia a TBb son escasos pero muy informativos. Bermingham et al¹⁰, utilizando 592 casos y 559 controles, y marcadores de alta densidad (777,692 SNP), encontraron tres SNP significativamente asociados a resistencia a TBb en los cromosomas 2 y 13. Richardson et al³⁴, con 3,240 hatos lecheros irlandeses divididos en casos y controles, de acuerdo a resultados a la prueba de la tuberculina, y asumiendo el mismo nivel de exposición, obtuvieron un SNP (BovineHD0100019801) asociado a susceptibilidad a TBb, localizado en el cromosoma 1, y un SNP (Hapmap50596-BTA-121389) en el cromosoma 23 asociado con resistencia a TBb. Ello demuestra que existen SNP asociados con características de interés, y que pueden tener un efecto protector en las infecciones por M. bovis³⁶, o contra la infección de tuberculosis pulmonar causada por M. tuberculosis en humanos⁴⁵. Un ejemplo claro es el gen NOS2, esencial en la regulación de óxido nítrico, que puede matar o limitar el crecimiento de M. tuberculosis³⁵.

M. bovis posee una amplia gama de huéspedes, incluyendo especies de vida silvestre⁴, por lo que estudios en estas especies también son relevantes. En un estudio relativamente reciente donde se estudiaron 198 casos y 670 controles de búfalo africano (Syncerus caffer), definidos como positivos o negativos, respectivamente a la prueba de ELISA (Bovigam) y la prueba de la tuberculina, se buscaron marcadores SNP situados en genes relacionados con el sistema inmunológico y el estado de la infección de la tuberculosis. Como resultado, se encontraron los polimorfismos SNP41, SNP137 y SNP144, en los genes Slc7a13, Dmbt1 e IL1A, respectivamente, asociados a la susceptibilidad a TBb⁹.

Variaciones en el número de copias (CNV)

La secuenciación del genoma completo está abriendo una nueva era en la gestión de los recursos genéticos en las poblaciones de ganado. El genoma bovino está constituido por 29 autosomas y los cromosomas sexuales, con un tamaño estimado de 3,600 mpb y al menos 22 mil genes⁴⁶. La variación en el número de copias (CNV, por sus siglas en inglés) son segmentos de ADN que miden desde una kilobase hasta varias megabases. Los CNV representan otra fuente de variación genética que puede complementar al SNP en la selección de animales. Los resultados de la genotipificación con SNP están disponibles y pueden ser utilizados para la identificación de CNV⁴⁷. Las variaciones en estas regiones pueden ser por eliminación o duplicación, lo que produce ganancias o pérdidas específicas de ADN genómico, que a su vez resulta en un número anormal de copias de una o más secciones de ADN. Los CNV son segmentos de repeticiones en tándem, que incluyen genes y otros elementos conservados con funciones potenciales, además de la alta tasa de mutación⁴⁸.

Se ha encontrado que los CNV pueden proporcionar una mayor cobertura al SNP del genoma. Esto ayuda en estudios de asociación para la identificación de variabilidad fenotípica⁴⁸. De acuerdo con resultados recientes en humanos, las variaciones estructurales que incluyen a los CNV afectan la expresión génica y están relacionados con la aparición de varias enfermedades; cerca del 12 % del genoma humano está afectado o cubierto por CNV⁴⁹.

Actualmente se cuenta con varios métodos para identificar CNV; uno de ellos es el método aCGH (array comparative genome hybridization), que necesita la secuenciación de todo el genoma para diseñar matrices de mosaicos con oligonucleótidos regularmente espaciados⁵⁰. Dos muestras de ADN genómico se hibridan en la misma matriz de oligonucleótidos y la información de los CNV es relativa a una muestra de referencia. Los paneles de alta densidad de SNP actuales permiten obtener fácilmente información relativa de los CNV⁵¹.

Liu et al⁵² realizaron un análisis sistemático de CNV de 539 bovinos con el chip BovineSNP50, donde identificaron 682 candidatos de CNV con 139.8 megabases, asociados significativamente a inmunidad, producción láctea y reproducción. En ganado Holstein chino se han identificado 367 regiones de CNV, 1.61 % del genoma bovino, con 218 CNV conteniendo 610 genes, considerados de alta función molecular⁵³.

La mayor parte de los reportes sobre CNV y su asociación con susceptibilidad o resistencia a TB son de estudios en genoma humano; los estudios en ganado productor de leche son escasos⁵³; sin embargo, algunos autores reportan que los CNV en ganado son comunes. Algunos estudios de asociación han sido realizados usando aCGH (array comparative genome hybridization)^52,54, otros con información de genotipos provenientes del BovineSNP50 BeadChip^40,55. Dos estudios han identificado 855 nuevos CNV en 256 muestras en Bos taurus coreanae⁵⁵. En bovinos, con marcadores de mediana densidad (50K SNP), sólo se ha podido identificar una fracción de los CNV, y se espera que con el uso de marcadores de alta densidad (770K SNP) se logre identificar un mayor número de CNV en el genoma bovino⁴⁰.

Ventajas de los estudios de asociación genética y TBb en México

Exceptuando a los países africanos y algunos sudamericanos, una de las ventajas de México sobre los países que han realizado estudios de asociación genética de resistencia a la TBb, es la alta prevalencia de la enfermedad en el ganado para leche (~16 %)³, con tasas de exposición al patógeno muy uniformes y la facilidad de identificar fenotipos de manera precisa. Mientras que en la mayoría de los países la identificación de los casos (animales infectados) y los controles (animales no infectados) se hace a través de diferentes pruebas indirectas, lo que resta precisión al diseño⁵⁶, en México se pueden hacer estudios de resistencia a la TBb con un alto grado de precisión. Dada la prevalencia de la enfermedad en algunas regiones del país se puede identificar perfectamente a los casos por la presencia de lesiones visibles en canales en rastro confirmados por aislamiento del patógeno en el laboratorio, y entonces identificar a los controles, animales provenientes de los mismos hatos que los casos, pero sin lesiones visibles y negativos al aislamiento en el laboratorio. La información sobre tiempo de exposición se puede obtener de los registros de producción de las unidades de producción⁵.

Uno de los problemas fuertes en estudios de asociación entre estructura genética y susceptibilidad o resistencia a la TBb actuales es precisamente la identificación confiable de los fenotipos, algo que en México puede lograrse sin dificultad como se explica en el párrafo anterior, y así poder realizar estudios donde se comparen los genomas de casos y controles para encontrar variantes alélicas que pudieran asociarse con fenotipos de interés¹².