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Introducción
La cría de becerras para reemplazo presenta algunos problemas, como el mal suministro de calostro, alimentación con sustitutos de leche de baja calidad y cambios repentinos en la ración1. Estas malas prácticas provocan diarreas ocasionadas principalmente por enteropatógenos, provocando tasa de mortalidad en más de 10 %, durante las primeras semanas de vida2. Para reducir la mortalidad se recurre al uso de antibióticos, pero la resistencia a las cepas patógenas afecta negativamente la salud de los animales3,4. En consecuencia, diferentes laboratorios veterinarios promueven el uso de probióticos hechos de bacterias ácido lácticas (BAL), prometiendo beneficios en la prevención y disminución de diarreas, con mejora en la ganancia de peso. Sin embargo, los productos deben de cumplir con requisitos idóneos para ser probióticos eficientes. Por ejemplo, el número mínimo de microorganismos que se requiere en el intestino del becerro para generar una adecuada salud, es de 106 unidades formadoras de colonias (UFC) /ml1.
Los ensayos clínicos realizados en la década pasada, demostraron que el 45 % de probióticos comercializados, tienen nula eficiencia de las BAL en la prevención de diarreas en becerras, e incluso parece que estos en lugar de favorecer, incrementaron la incidencia y severidad de diarreas4,5, y no hay respuesta para mejorar la ganancia diaria de peso y la conversión alimenticia6,7. En la actualidad estos mismos parámetros son similares por los laboratorios que comercializan probióticos en las unidades de producción ganadera lechera. Las cepas usadas tienen baja viabilidad de microorganismos probióticos presentes en los productos comerciales; además se han encontrado especies de bacterias diferentes a las citadas en las etiquetas8. En cuanto a su origen, las bacterias probióticas provienen de diferentes regiones geográficas e incluso de otras especies animales, lo que ocasiona baja viabilidad y actividad probiótica4. El objetivo del estudio se enfocó en el aislamiento y la identificación de bacterias con potencial probiótico (resistencia a pH ácido y sales biliares (SB)) en ganado Holstein de la región del altiplano de México.
Material y métodos
Aislamiento de bacterias de mucosa oral y de calostro
Se utilizaron cinco becerros lactantes de 30 días de edad y cinco vacas adultas de segundo parto en lactancia, raza Holstein Friesan del rancho del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. También se tomaron muestras de calostro de cinco vacas Holstein recién paridas del Rancho privado Xalapango. Ambos sitios están ubicados en el valle de Texcoco, Estado de México, entre los paralelos 18° 21´y 20° 17´N y 98° 36´y 100° 36´O9.
Toma de muestras
Mucosa oral: se tomaron muestras duplicadas de exudado de la mucosa oral por becerro lactante, frotando por 3 seg el hisopo (3MTMSwab-Sampler), previo a la ingesta de alimento matutino. Cada hisopo se colocó dentro de un tubo estéril con 10 ml de agua peptonada buferada (RS96010BPW).
Calostro y leche: antes del muestreo se realizó la limpieza, desinfección y despunte de los pezones y se colectaron 5 ml de calostro y 10 ml de leche por grupo de vacas asignadas. Las muestras se depositaron en frascos estériles manteniéndose a 4 °C y trasladándose inmediatamente al laboratorio para su análisis, según lo descrito por la Norma Mexicana10.
Procesamiento de las muestras
Las muestras fueron pre-enriquecidas (para favorecer el crecimiento de las BAL) en medio de cultivo líquido11. Se tomó por duplicado 1 ml de la suspensión bacteriana de mucosa oral y se depositó en tubos con 5 ml de caldo mann rogosa sharp (MRS). Los tubos inoculados se dividieron en dos grupos aleatorios. El primero se mantuvo en condiciones aerobias y el segundo en condiciones anaerobias, ambos a 37 °C por 18 h. En el caso de las muestras de calostro y leche, se tomaron 200 μl por duplicado y también se depositaron en tubos con 5 ml de caldo MRS. Los tubos inoculados se mantuvieron en un desecador con ambiente anaerobio (inducido con una vela encendida) por 18 h a 37 °C. Al final del tiempo, a cada tubo se le extrajo una muestra con la asa bacteriológica y se sembraron en cajas Petri con medio sólido MRS12, incubando a 37 °C por 48 h, en condiciones anaerobias y aerobias. Como grupos testigo positivos y negativos, se incluyeron una cepa de Lactobacillus casei ATCC y una de E.coli O42, donadas por la Universidad Autónoma de Querétaro.
Selección de las bacterias
Los cultivos fueron seriados en el proceso de sembrado, por las duplicaciones en el medio solido MRS, se acumularon 54 colonias con características de BAL, de acuerdo al tamaño, forma, superficie, elevación, borde y color13. La caracterización de las cepas se realizó con las pruebas de tinción de Gram, morfología celular, tinción de esporas y la prueba de catalasa12. Adicionalmente, se efectuaron las pruebas de producción de indol y de motilidad, en medio de cultivo SIM (sulfhídrico, indol, motilidad), hidrólisis de la gelatina y reducción de nitratos14. Se realizó una segunda selección de las colonias aisladas, considerando los mejores puntajes y la morfología idónea de cocobacilos y bacilos. Entre éstas, se identificaron 27 colonias, las cuales se reprodujeron en 5 ml de caldo MRS por 18 h, para su evaluación como bacterias probióticas. De cada suspensión bacteriana obtenida se tomaron 800 µl por duplicado y se transfirieron a tubos Eppendorf con 800 µl de glicerol estéril al 50% como crioprotector, conservándose a -20 ºC por 3 h y posteriormente a -80 ºC por tiempo indefinido.
Determinación de la resistencia y supervivencia de las cepas seleccionadas a condiciones gastrointestinales
Resistencia a pH ácido
Preparación de inóculo: de las 27 colonias obtenidas, se hizo nueva selección. Se escogieron 16 de ellas por seguir manteniendo una morfología bien definida de cocobacilos y bacilos. El cepario final quedó integrado con 12 aislamientos de la mucosa oral, 2 de leche y 2 de calostro. Todas las colonias seleccionadas se reactivaron a -20 ºC y temperatura ambiente; luego se transfirió cada muestra en tubos con 5 ml de caldo MRS. Posteriormente se incubaron a 37 ºC en condiciones anaerobias por 24 h y nuevamente 1 ml de cada suspensión bacteriana (106 Log10 UFC/ml) se adicionó en tubos con 9 ml de caldo MRS, incubándose por 18 h. La suspensión bacteriana obtenida se centrifugó a 2,056 xg por 10 min; el paquete celular se resuspendió en 10 ml de leche semidescremada (Alpura® 2000®) esterilizada (110 °C por 15 min) para realizar la prueba de resistencia a pH 4.5 y 4.0. La leche se utilizó como medio protector y como vehículo de los microorganismos probióticos15, siguiendo el protocolo descrito por Fernández de Palencia et al16. La resistencia a condiciones de pH ácido se evaluó con la disminución con las células bacterianas. La reducción de pH se hizo con alícuotas controladas de HCl al IN. Cuando el pH se estabilizó a 4.5 y 4.0, las muestras se incubaron a 37 °C por 10 min. Posteriormente se tomó 1 ml de cada suspensión para hacer diluciones seriadas, y de cada dilución se tomaron 100 µl, sembrándose en agar MRS, para estimar la viabilidad de las células bacterianas. Las colonias evaluadas a pH de 4.5 y 4.0, se sembraron a diluciones10-6 y 10-7 en una suspensión de leche.
Resistencia a la exposición de sales biliares en placas de microtitulación
Las colonias seleccionadas se expusieron a SB en placas de microtitulación (BD PrimariaTM) con capacidad de 3.5 ml por pozo. Se utilizó una placa por cada concentración y previo al establecimiento de la prueba, se prepararon dos matraces con 100 ml caldo MRS; uno con 0.3 g y otro con 1.5 g de SB de bovino (Oxgall DifcoTM)17,18. En la prueba se incluyeron dos testigos negativos: solución MRS-con SB sin bacteria y un MRS-sin SB con bacteria. La prueba se estableció por triplicado y cada colonia ocupó seis pozos de la placa. Adicionalmente, se depositaron 2 ml de solución (MRS-con SB sin bacteria) y 20 μl (1:10 v/v) de suspensión bacteriana por 18 h de crecimiento. Después de 1 h de inoculación y previo a la incubación de las placas, se midió la densidad óptica (DO) de cada suspensión a 600 nm con un espectrofotómetro (GENESYS 10 UV/ Thermo Spectronic). Posteriormente, las placas con los tratamientos se incubaron a 37 ºC en condiciones anaerobias, a las 24 h se registró nuevamente la lectura de la DO.
Identificación bioquímica y colección de cepas con potencial probiótico
Las colonias con características de BAL se identificaron con el sistema APICHL (System; BioMerieux SA, France). En el procedimiento, se reactivaron las colonias en 5 ml de caldo MRS en condiciones anaerobias a 37 ºC por 18 h, adicionando el diluyente 50CH (suministrado con la galería: API50CH), de acuerdo a las indicaciones del producto. La suspensión preparada se usó para llenar 50 microtubos de la galería; las cúpulas de estos microtubos se llenaron con aceite mineral estéril, para generar condiciones anaerobias. Las galerías inoculadas (una por colonia) se mantuvieron a 37 ºC por 48 h para establecer el perfil bioquímico de cada colonia. La interpretación de los resultados se hizo con la identificación de cambio de color en el medio API50CHL de cada microtubo; el azul indicó un valor negativo, y el amarillo y negro indicaron valores positivos (hoja de seguridad placas). Los datos registrados se analizaron con el sistema computarizado Apiweb®. La Figura 1, resume en tres fases las secuencias metodológicas que se realizaron para identificar y asilar las BAL con potencial probiótico.
Análisis estadístico
Los datos que fueron analizados con pruebas estadísticas inicialmente, presentaron una distribución normal (Prueba de Kolmogorov-Smirnov) y homogeneidad de varianzas (prueba de Levene). Posteriormente se realizó el análisis de varianza y la prueba de Tukey para la comparación de medias. Se utilizó un nivel mínimo de significancia de 0.5%, utilizando el paquete estadístico SPSS Ver. 1519.
Resultados y discusión
Aislamiento y crecimiento de colonias
Las colonias seleccionadas en el medio anaerobio tuvieron mejor crecimiento que las cultivadas en condiciones aerobias. Las colonias por la morfología seleccionada fueron cocobacilos y bacilos, gram positivas, sin presencia de esporas, catalasa negativa, sin motilidad, sin producción de indol, gelatinasa y negativas a la reducción de nitratos.
Las muestras de la mucosa oral tuvieron un tamaño promedio de 2 a 4 mm de diámetro con características morfológicas homogéneas de forma circular, elevación convexa, borde entero, superficie lisa y color blanco sin pigmentos. Del total de las muestras de leche, solo el 20 % tuvo crecimiento de colonias bacterianas, el tamaño promedio fue de 2.5 mm de diámetro. Mientras las colonias aisladas de calostro presentaron un color beige y tamaño variable de entre 1 y 5 mm de diámetro. Generalmente, las bacterias probióticas se han aislado de las mucosas oral, vaginal e intestinal de becerros sanos y en muestras de leche11,20. En este estudio, las colonias de la mucosa oral y de leche, tuvieron la capacidad de los lactobacilos para adaptarse y sobrevivir13, debido a la presencia del grupo hemina, que les permite activar la cadena respiratoria con el oxígeno como aceptor de electrones21. Los diferentes géneros de las BAL comparten características morfológicas, metabólicas y fisiológicas como la forma, elevación, margen, color y reacciones bioquímicas13. Sus características morfológicas celulares y pruebas bioquímicas han sido reportadas como básicas, para la selección de cepas probióticas5,22, y se recomienda complementarlo con estudios moleculares23.
Viabilidad de las cepas seleccionadas con base en su resistencia a pH ácido
El Cuadro 1 muestra las poblaciones de las colonias evaluadas a diferentes pH. El crecimiento con el pH testigo de 6.5, promedió 9.07 Log10 UFC/ml. Mientras que a pH 4.0, el crecimiento disminuyó (P<0.001) a 5.09 Log10 UFC/ml. Las colonias que no crecieron con un pH de 4 fueron eliminadas y no se incluyeron en el cepario final; éstas fueron las dos colonias de leche. Específicamente las bacterias probióticas para poder llegar al sitio de acción y mantenerse viables, deben ser capaces de resistir el pH ácido y la presencia de SB en el duodeno24. Varios autores7,25 han desarrollado metodologías para evaluar la resistencia de cepas probióticas en condiciones gástricas. Por ejemplo, L.plantarum y L. acidophilus, crecieron y fueron viables a pH 5.0, mientras que a pH 4.0 y 3.0 se detuvieron estas actividades16; lo que coincide con la información obtenida en este estudio a un pH de 4.0. Esta sensibilidad de las cepas, puede estar relacionado con la respuesta ácido tolerante o resistencia adquirida. Broadbent et al26 compararon células de L. casei crecidas a pH 6.0 (testigo) contra grupos de células adaptadas pH 4.5 por 10 min y células adaptadas a pH 4.5 por 20 min, presentando disminución de viabilidad de hasta 4.0 Log10 y de 0.7 a 2.4 Log10 UFC/ml en 10 y 20 min de adaptación, respectivamente. Los autores mencionan que la adaptación de las células al ácido provocó cambios en la composición de lípidos de la membrana, mostrando un dramático incremento de ácidos grasos saturados e insaturados, así como la fermentación maloláctica y acumulación intracelular de histidina. Por otro lado, otros autores27,28,29 reportan habilidades de las bacterias probióticas para sobrevivir a la digestión acida del estómago; ésta es variable y depende de cada cepa, lo que explica las diferencias en resistencia, como ocurrió en el estudio a pH 4.0. Comúnmente, los lactobacilos tienen mejor crecimiento a pH 4.0 vs pH 3.030. Pocas colonias llegan a resistir el pH 3, comúnmente 4 de 200 cepas BAL sobreviven31.
Cuadro 1: Conteo de colonias recobradas en agar Man-Rogosa-Sharpe (MRS) inmediatamente después de la exposición a pH ácido y su identificación bioquímica
| Número de cepas | T1 pH 6.5 |
T2 pH 4.5 |
T3 pH 4.0 |
Identificación bioquímica de cepas ácido lácticas con sistema API (API 50CHL) |
|---|---|---|---|---|
| ~ | 9.40 | 9.21 | 5.74 | |
| Mucosa oral | ||||
| 1 | 8.77 | 8.40 | 5.08 | Leuconostoc mesenteroides |
| 2 | 9.46 | 8.43 | 5.49 | Leuconostoc mesenteroides |
| 3 | 9.02 | 9.36 | 5.09 | Pediococcus pentosaceus |
| 4 | 9.06 | 7.23 | 4.83 | Lactobacillus plantarum |
| 5 | 8.28 | 7.67 | 5.06 | Lactobacillus plantarum |
| 6 | 8.78 | 8.47 | 4.01 | Lactobacillus salivarius |
| 7 | 8.71 | 8.49 | 6.43 | Leuconostoc mesenteroides |
| 8 | 9.36 | 8.39 | 6.47 | Lactobacillus crispatus |
| 9 | 9.39 | 9.11 | 5.44 | Leuconostoc mesenterodes |
| 10 | 9.37 | 8.68 | NG | Lactobacillus brevis |
| 11 | 9.36 | 8.84 | NG | Lactobacillus brevis |
| 12 | 8.82 | 8.48 | 3.33 | Leuconostoc mesenteroides |
| Leche | ||||
| 13 | 9.02 | 8.14 | NG | Lactobacillus brevis |
| 14 | 9.15 | 8.31 | NG | Lactobacillus brevis |
| Calostro | ||||
| 15 | 9.32 | 9.14 | 5.34 | Lactococcus lactis |
| 16 | 9.32 | 8.95 | 4.52 | Leuconostoc mesenteroides |
| Media | 9.07±0.33a | 8.50±0.54b | 5.09±0.89c |
Treatment, ~ correspond to positive control strain L. casei. Data are mean values of three replicates and correspond to Log10 CFU/mL NG: No growth.
a,b Different letters in the mean value ± Std. deviation, indicate significant differences P<0.03.
Por otro lado, la resistencia y crecimiento a la exposición de SB se ha realizado con concentraciones desde 0.1 hasta 4.0 %32,33. En el presente estudio, las BAL continuaron creciendo a altas concentraciones de SB (1.5 g), siendo un parámetro importante para los microorganismos que componen los productos comerciales34,35, sin embargo no es comúnmente considerado. En un estudio similar36 se evaluó la resistencia de L. plantarum a la exposición de varias concentraciones de SB de origen porcino (0.01, 0.05, 0.10 y 0.15 g); el crecimiento de la cepa fue monitoreado por 24 h con mediciones de DO, y la mayor tasa de crecimiento se dio con la menor concentración de SB. De este modo, la densidad final alcanzada por esta cepa con 0.10 g SB fue tres veces más baja con respecto al testigo. Mientras que, en este estudio, las colonias tuvieron una DO final de 2.5 veces más baja, con una concentración de 0.3 g, a diferencia del grupo testigo. La resistencia a SB de bacterias productoras de ácido láctico (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Lactococcus lactis) y bacterias probióticas (L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus y Bifidobacterium) se ha reportado con dosis mayores de 0.3 a 1% de SB37,38. S. thermophilus fue la cepa más sensible a la concentración de 0.5 g SB y Lactococcus lactis fue resistente con 1 g de SB. Todas las cepas probióticas mostraron resistencia a 1.5 g SB, aunque la resistencia a la exposición de SB puede diferir entre los miembros del género Lactobacillus, debido a la habilidad de algunas cepas para colonizar y estabilizarse rápidamente en el intestino de las becerras7. Estudios in vivo, administrando L. acidophilus a becerras, fueron capaces de incrementar el número total de lactobacilos en el yeyuno de los animales de 13 a 39 % y por otro lado, cepas de L. plantarum y Lactococcus acidilactici presentaron mejor crecimiento con condiciones de pH 4.0 y 0.3g de SB5. En este estudio, las BAL mostraron mejor tolerancia a la exposición de SB que a pH 4.0; principalmente la resistencia a la exposición prolongada al pH ácido y a altas concentraciones de SB de las BAL seleccionadas, pueden ser buenos parámetros en capacidad de sobrevivencia y colonización durante el tránsito intestinal28,39.
Identificación bioquímica de las cepas con el sistema API50CHL y viabilidad a la exposición con sales biliares
El Cuadro 1 también muestra los resultados obtenidos en la identificación de las colonias con base al perfil de fermentación de carbohidratos (API50CHL-BioMerieux). Los resultados tuvieron un intervalo de 96 y 99 % de efectividad. De las colonias aisladas de la mucosa oral, 6 se identificaron como Lactobacillus, 5 como Leuconostoc y 1 como Pediococcus. Las muestras de calostro fueron Leuconostoc y Lactobacillus.
El promedio de la DO obtenida en cada una de las cepas evaluadas, incrementó 3.1 veces (P<0.05), después de 24 h de incubación, con la concentración de 0.3 g SB, respecto a la primera lectura. Por otra parte, cuando se aumentó la concentración de SB a 1.5 g, la DO incrementó 2.7 veces a las 24 h. Los efectos principales muestran disminución (P<0.023) de OD con el mayor valor de SB e incrementó (P<0.0001) la OD desde 1 a 24 h (Cuadro 2). Algunos estudios que han evaluado el beneficio de las bacterias probióticas en becerras reportan datos contradictorios, tal vez por la falta de diversidad en los probióticos por regiones geográficas y por comercializar cepas poco viables. Por tal motivo, es difícil encontrar secuencias de experimentos con una misma cepa40. En América Latina la comercialización de productos probióticos para becerras es limitada y dudosa; la mayoría de las empresas solo cuentan con cepas de L. acidophilus cepa KA1-A 8 con 3,000 billones de UFC/dosis y con L. casei con 3,000 millones de UFC/dosis, sin especificación para su uso en becerras. Otras empresas promueven productos con Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium lactis con 1 x 1011 UFC por unidad dosis o con 50 unidades para la aplicación directa en 1,000 L de leche; pero en el producto no se especifica el origen de las cepas, quizás son obtenidas de otras especies animales o alimentos, por lo que no se consideran buenas opciones. Por ejemplo, cuando se administra cepas probióticas de humanos al ganado, estos microorganismos no tienen una colonización duradera en el intestino, debido a las diferencias fisiológicas y alimentarias entre las especies41,42; razón por la cual en este estudio se realizó el aislamiento de colonias con potencial probiótico de una región ganadera de bovinos Holstein. Actualmente, para el ganado los géneros de bacterias probióticas más utilizadas, son Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Lactococcus y Leuconostoc43, Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. casei, L. salivarius y Lactococcus lactis5,44,45, L. fermentum VC3B-08, W. hellinica V1V-30 and L. farciminis B4F-0620.
Tabla 2: Promedios de densidad óptica (DO) en el crecimiento de cepas ácido lácticas con dos concentraciones de sales biliares (SB,%) por 1 y 24 horas
| Tratamiento | Efectos principales | |||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.3% SB | 1.5% SB | EEM | 0.3% SB | 1.5% SB | EEM | 1h | 24h | EEM | ||||||
| I | 1h | 24h | 1h | 24h | ||||||||||
| DO | 0.33 | 1.02 | 0.31 | 0.84 | 0.03 | 0.68 | 0.57 | 0.02 | 0.32 | 0.93 | 0.02 | |||
| P>F | 0.008 | 0.008 | 0.023 | 0.0001 | ||||||||||
EEM= Error estándar de la media.
Conclusiones e implicaciones
Se seleccionaron 16 colonias BAL de ganado Holstein. Lactobacillus brevis aislado en muestras de la mucosa oral y leche, no creció en pH ácido (4.0). Las colonias seleccionadas fueron Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum. Lactobacillus crispatus y Lactococcus lactis. Por las características evaluadas, se asume que las colonias identificadas, cuentan ampliamente con un potencial probiótico para ser evaluadas directamente en el tracto gastrointestinal de becerros.
