Bacterias

En 1944²⁰ se habían cultivado unas 200 especies de bacterias. Informes recientes que utilizan la secuenciación de ADN de alto rendimiento han revelado la presencia de 13 principales filos en el rumen, que incluyen 40 órdenes bacterianos, alrededor de 80 clases de bacterias, y por lo menos 180 familias bacterianas, unos 320 géneros de bacterias y más de 2,000 unidades taxonómicas bacterianas operativas^21,14. La densidad bacteriana en el rumen se encuentra en el rango de 10⁷ a 10¹⁰ células/ml de líquido ruminal. Los filos bacterianos más abundantes son Bacteroidetes y Firmicutes, que incluyen por lo menos el 75 % de la población bacteriana total. El género de bacterias ruminales más abundante es Prevotella, que representa aproximadamente el 20 % de la comunidad bacteriana^14,22,23.

Protozoarios

Se han identificado más de 20 especies de protozoarios²⁰, cuya concentración en el rumen es de aproximadamente 10⁶ células/ml. Si bien el número de géneros de protozoarios es menor que el de los de las bacterias, los protozoarios son físicamente más grandes que las bacterias y pueden constituir aproximadamente la mitad de la biomasa microbiana ruminal total¹⁹. El nitrógeno protozoario oscila entre 4.8 y 12.7 % en el rumen, y entre 5.9 y 11.9 % en el duodeno^3,7. Nuevos reportes que utilizan la secuenciación del ADN de alto rendimiento han demostrado que los géneros protozoarios predominantes son Entodinium, Epidinium, Metadinium, Diploplastron, Polyplastron y Diplodinium²⁴. Más del 90 % de la población de protozoarios en el rumen pertenece a la clase Litostomatea, que incluye dos grupos: Haptoria y Trichostomatia. La subclase Trichostomatia comprende al género Entodinium, uno de los más estudiados, que constituye entre el 89 y el 91 % de la población protozoaria²⁴.

Hongos

Se han encontrado asociaciones de los hongos con las fracciones más lentamente digeridas de las plantas, y los hongos actúan como colonizadores iniciales de la lignocelulosa e incrementan la velocidad a la cual las bacterias digieren la fibra dietaria al alterar las paredes lignificadas de las células de las plantas¹⁹. Son pequeños organismos flagelados. En un principio se los clasificó erróneamente como protozoarios flagelados; no obstante, después se observó que esos flagelados eran zoosporas fúngicas que llegaron a colonizar las superficies de las plantas para producir un micelio. El micelio da origen a esporangias que liberan más zoosporas, y el ciclo continúa. Los hongos incrementan su tiempo de residencia adhiriéndose a partículas de alimento. Por este motivo ha sido difícil calcular su biomasa en el contenido ruminal²⁰. Recientemente, la secuenciación del ADN ha revelado la presencia de 5 principales filos fúngicos, que incluyen 55 géneros de hongos. Los géneros predominantes son Ascomycota (27 %), Basidiomycota (3 %) y Neocallimastigomycota (1 %)²⁵.

Arqueas

La población de arquea incluye microorganismos que se creía eran bacterias. Sin embargo el análisis molecular de su ADN ha revelado que pertenecen a un dominio diferente²⁶. La densidad de las arqueas en el rumen no ha sido determinada con precisón. Estos microorganismos desempeñan un papel especial en la eficiencia alimenticia porque participan en la formación de metano, la cual utiliza dióxido de carbono e hidrógeno²⁷. Debido a que el metano emitido al medio ambiente contribuye al calentamiento global, uno de los principales objetivos de las prácticas para reducir los gases de efecto invernadero en el ámbito de la ganadería es disminuir la producción de este gas por los rumiantes²⁸. Los recientes hallazgos respecto a la secuenciación de ADN de alto rendimiento han revelado que el filo arqueal más abundante en el rumen es Euryarchaeota, que constituye el 99 % de la población de arqueas ruminales. Se han detectado diez géneros de arqueas en el rumen, y el género más abundante es Methanobrevibacter, que representa aproximadamente el 91 %²⁶.

Desde hace mucho tiempo se ha reconocido la importancia de la proteína microbiana sobre el estado nutricional de los rumiantes por ser una de las principales fuentes de proteína metabolizable¹⁹. Las bacterias ruminales y los protozoarios aportan la mayoría de la proteína metabolizable que llega al duodeno. La proteína microbiana sintetizada en el rumen satisface por lo menos el 50 % de los requerimientos de proteina metabolizable de los rumiantes en diversos estados de producción ^1,29,30. Bajo la mayoría de las condiciones alimentarias, la proteína microbiana equivale a entre el 50 y el 85 % del nitrógeno total de aminoácidos que entra en el intestino delgado⁵. Otros estudios sugieren que la proteína microbiana sintetizada en el rumen aporta entre le 40 y el 90 % de la proteína que llegua al intestino delgado, a pesar de que hasta un 50 % de la proteína microbiana sintetizada podría degradarse a nitrógeno de amoniaco en el rumen³⁰. Además, la aportación relativa de proteínas microbianas que llegan al intestino delgado depende principalmente de la calidad y solubilidad del nitrógeno ingerido. Esta aportación puede oscilar entre 1,262 y 2,137 g/d en la vaca lechera adulta, y entre 473 y 1,300 g/d en el ganado de carne; adicionalmente, se ha encontrado que la concentración de proteínas microbianas en la digesta duodenal del ganado ovino varía de 130 a 162 mg/g MS (Cuadro 1).

Además, los microbios ruminales son una importante fuente de otros nutrientes para los rumiantes³¹. Los principales componentes químicos de los microorganismos ruminales son el nitrógeno, los carbohidratos, los lípidos y la ceniza³² (Cuadro 2). El contenido de materia orgánica, nitrógeno y aminoácidos de las diversas bacterias mezcladas en el rumen se incrementa reduciendo la proporción de forraje en la dieta¹⁹. Estas variaciones podrían deberse a la diferencia en la especie de bacterias resultantes de diferentes dietas³³. Recientemente la secuenciación del ADN de alto rendimiento ha confirmado esta hipótesis²¹. Se ha observado un incremento de la materia orgánica y de las concentraciones de nitrógeno de la población protozoaria en respuesta a un aumento de la cantidad de almidones en la dieta¹⁹, el cual puede obedecer a cambios en la comunidad protozoaria, recientemente confirmada utilizando métodos moleculares³⁴.

Factores que influyen en la síntesis de la proteína microbiana ruminal

El crecimiento microbiano ruminal depende de su capacidad de degrader y fermentar los ingredients del alimento. Las células bacterianas tienen diversos sistemas de transporte para absorber los nutrientes de bajo peso molecular y solubles como los azúcares³⁵. Debido a que los ingredientes del pienso están compuestos principalmente de polímeros complejos tales como almidón, proteína y celulosa, estos polímeros son primero degradados por enzimas extracelulares a sustancias de bajo peso molecular que son utilizadas luego por las bacterias. La cantidad de rendimiento bacteriano in vivo oscila entre 1.9 y 3.0 mg por cada 100 mg de materia orgánica verdaderamente digerida³⁶. Algunos de los principales factores que influyen en la síntesis de proteína mocrobiana ruminal incluyen la disponibilidad de carbohidrato alimentario, de proteína degradableen el rumen, de grasa alimentaria, del pH ruminal y de la ingesta de pienso³⁷. El modelo utilizado para predecir el flujo de proteína microbiana (g/d) al intestino delgado se relaciona con los nutrientes digeribles totales, MN= 0.0166TNDkg³⁸, o con la ingesta de MCP= 0.087TDN+42.73¹⁸.

Efectos de los carbohidratos del alimento

La utilización eficiente de los nutrientes alimenticios degradados requiere que la materia orgánica alimentaria se fermente a un ritmo que corresponda con las capacidades de síntesis de los microbios ruminales. Los carbohidratos fácilmente disponibles, como el almidón, son eficaces para incrementar la utilización de los nutrientes degradados y el crecimiento microbiano³⁹. Además, existe un incremento del crecimiento microbiano en los cultivos continuos (15.0 a 19.5 g de proteína microbiana/100 g MS digeridos) en respuesta a los crecientes niveles de carbohidratos no estructurales (32 a 49 % de MS)³⁹. Así, el tipo de carbohidratos alimenticios puede influir en el metabolismo bacteriano. El ganado de engorda alimentado con una dieta alta en carbohidratos está prácticamente libre de protozoarios. Sin embargo, otras investigaciones en las que se han utilizado dietas a base de trigo⁴⁰ y de maíz y sorgo⁴¹ han mostrado altas concentraciones de protozoarios en el rumen con dietas altas en granos. Se considera que los cambios en la población bacteriana y de protozoarios debidos al drástico aumento de los almidones alimentarios²¹ pueden deberse a la disminución del pH ruminal³⁸.

Efecto de la proteína degradable en el rumen

En general, los microorganismos del rumen no pueden satisfacer por sí solos los requerimientos de aminoácidos de los rumiantes de alta producción. Por ende, la inclusión de proteínas no degradables en el rumen puede incrementar el suministro total de aminoácidos al intestino delgado y modificar el perfil de aminoácidos del duodeno. No obstante, el hecho de alimentar al ganado con fuentes de proteína de baja degradación también puede limitar la fermentación microbiana, lo que da como resultado una disminución del suministro de energía y de aminoácido microbiano al animal huésped. La degradación ruminal de la proteína alimentaria es un proceso que depende del tiempo, y la tasa de la degradación en relación con la tasa de paso es una propiedad dinámica crucial que afecta a la cantidad de proteína que escapa del rumen sin haber sido degradada por éste⁴³. Una dieta con 5.3 % de proteína degradable en el rumen incrementa el flujo de nitrógeno bacteriano (415 g/d en contraste con 365 g/d cuando se proporciona una alimentación con 4.8 % de proteína degradable en el rumen)⁴². Es probable que una mayor cantidad de nitrógeno disponible en el rumen mejore la eficiencia con la que se utiliza la energía, estimulando el crecimiento de la población bacteriana⁴³. Esto indica que si la energía obtenida de los carbohidratos para el crecimiento microbiano no es limitante, los péptidos y aminoácidos resultantes son utilizados de manera más eficiente para la síntesis de proteínas microbianas. Sin embargo, si los carbohidratos son limitantes, una fracción considerable de la proteína se descompone en amoniaco, que puede eliminarse parcialmente a través de la orina. Así, tendría que haber una coordinación entre la disponibilidad de energía y el nitrógeno en el rumen¹⁵. Recientemente, se han utilizado ecuaciones para predecir la producción de proteína microbiana como una función lineal de la ingesta de proteína degradable ruminalmente en el ganado de leche¹⁷. Además, el ganado de engorda requiere un mínimo de 100 g de nitrógeno soluble/kg de materia orgánica digerida en todo el tracto para maximizar el flujo del nitrógeno microbiano^44,45.

Efecto de la grasa de la dieta

Si bien desde hace varias décadas se han reconocido los efectos negativos de la grasa de la dieta, los nuevos avances en los métodos moleculares han revelado que los microorganismos ruminales que pertenecen a los géneros Fibrobacter, Ruminocuccus, Butyrivibrio y Prevotella pueden ser muy sensibles a la grasa^46,47. Es importante señalar que se ha demostrado que los ácidos grasos insaturados son tóxicos para las bacterias ruminales, especialmente para aquellas que digieren la fibra. Esta toxicidad podría deberse a un impedimento de la digestión de los nutrientes debido a que los ácidos grasos se adhieren a la pared celular⁴⁶. Así, no es de extrañar que una de las principales acciones de algunos géneros bacterianos ruminales sea la biohidrogenación de los ácidos grasos para minimizar los impactos negativos de los ácidos grasos insaturados en el crecimiento microbiano. También se han reportado efectos detrimentales de la grasa alimentaria en los protozoarios ruminales, hongos y arqueas cuando el alimento contiene aceite de linaza o de soya⁴⁶.

Efecto del pH ruminal

Se han reconocido los efectos del pH sobre el crecimiento de algunas bacterias ruminales⁴⁸. Ciertas especies, como Fibrobacter succinogenes y Ruminoccosus albus son muy sensibles al pH ruminal ácido⁴⁹. Esta sensibilidad puede explicarse por los efectos negativos del pH en la absorción de glucosa. Otras especies bacterianas como Prevotella ruminicola y Selenomonas ruminantium son bastante resistentes a la reducción del pH extracelular⁵⁰. El tipo de mecanismos de transporte utilizados por las bacterias influye en su sensibilidad al pH. Por ejemplo, el transporte de arabinosa y xilosa por Prevotella ruminicola es más sensible a las reducciones del pH extracelular que el transporte de glucosa⁵¹. Un bajo pH extracelular también reduce el transporte de la arginina, el glutamato y la leucina en Streptococcus sp.⁴⁹. Gracias al desarrollo de la secuenciación de ADN de alto rendimiento se ha descrito el efecto del pH ruminal en todos los taxones de la población bacteriana. Por ejemplo, se ha demostrado que las bacterias que digieren la fibra son más sensibles al pH ruminal bajo que las bacterias que digieren el almidón^37,21. Además, los investigadores han encontrado que la acidosis ruminal leve o severa puede inducir cambios drásticos en la población bacteriana del rumen. Se ha reportado en el ganado la proliferación rápida de algunas bacterias tales como Streptoccocus bovis y Lactobacillus sp. en situaciones en las que el rumen contiene altas proporciones de carbohidratos de fermentación rápida y un pH ruminal bajo^52,53. Además, la reducción del pH ruminal debida a las dietas altas en granos afecta negativamente el crecimiento protozoario⁵⁴; por lo tanto, el modelo para predecir la proteína microbiana incluye la fibra detergente neutra como un factor de ajuste²⁹.

Efecto de la ingesta de alimento

La reducción de la ingesta de alimentos puede afectar la actividad bacteriana y disminuir la eficiencia microbiana debido a la insuficiencia en el nitrógeno soluble y la materia orgánica fermentable⁴⁵. No obstante, si la restricción en la ingesta de alimento no es severa, la eficiencia microbiana aumentará (gramos de nitrógeno microbiano/kilogramos de materia orgánica fermentada); pero el rendimiento microbiano (gramos de nitrógeno microbiano que llegan al duodeno) disminuirá como consecuencia de la reducción de la cantidad de materia orgánica fermentada en el rumen. Otros estudios han reportado una relación positiva entre el incremento de la ingesta de alimento y el rendimiento microbiano; esto se debe a que una mayor ingesta de alimento aumenta la tasa de paso que previene la depredación de protozoarios^44,53. Además incrementa la cantidad de nitrógeno bacteriano que llega al duodeno, debido a que la producción de nitrógeno bacteriano se correlaciona positivamente con la ingesta de materia orgánica digerible⁵³.

El uso de las purinas totales como marcador microbiano

Las bases de purina (adenina y guanina) son parte de los ácidos nucleicos de las células microbianas⁶³. En pocas palabras, este procedimiento combina los métodos estándar para hidrolizar los nucleótidos con ácido perclórico. El primer paso va seguido de la precipitación de las purinas libres con el nitrato de plata para separar las purinas de los compuestos que interfieren. En este método, las purinas ácidas resolubilizadas se cuantifican con un espectrómetro a 260 nm. Después se estima la proteína microbiana con base en la relación entre las purinas y el nitrógeno de los pellets bacterianos de referencia⁶⁴ y la concentración de las purinas en las muestras.

Se considera que el uso de las purinas tiene algunos retos inherentes. Por ejemplo, las purinas del alimento, que escapan a la destrucción en el rumen debido a que pueden causar una sobreestimación de la proteína microbiana⁶³. Las células epiteliales intestinales desprendidas también pueden aportar purinas a la digesta, y por lo tanto provocar una sobreestimación. Además, se ha reportado una mayor concentración de purinas en el duodeno de las ovejas que en el abomaso, atribuyéndola a las células desprendidas y a la secreción de bilis⁸. El factor de corrección 0.195 × BW^0.75 se ha utilizado para mitigar esta sobreestimación⁶⁵. Al parecer, otros retos importantes que se enfrentan cuando se utilizan las purinas totales como marcador microbiano tienen que ver con si las purinas están presentes en un porcentaje similar en las distintas especies y en todas las etapas de crecimiento microbiano. Se ha reportado que los valores para las purinas en las bacterias mezcladas en el rumen varían mucho. Por ejemplo, en un estudio se encontró una concentración media de purinas del 7.28 %, con valores que oscilan entre 2.40 y 13.02 %⁵³. Se han reportado variaciones en las concentraciones de purinas de las bacterias ruminales mixtas en cultivo continuo utilizando diversas fuentes de proteína⁶⁶. Esta variación también se ha reportado entre los cultivos puros. Las concentraciones, expresadas como un porcentaje de la MS, oscilan entre 0.69 y 5.57 %, con un valor medio de 2.98 %. Esta situación indica que, si se utilizara la relación entre las purinas y el nitrógeno para calcular la proteína microbiana a nivel duodenal, se obtendrían valores por encima de los reales. Entre los factores biológicos que pueden ser responsables de estas variaciones se encuentran la diferencia en la composición química entre las bacterias asociadas al líquido y la de las bacterias asociadas a las partículas, así como la etapa de crecimiento bacteriano¹⁹. Por lo tanto, el procedimiento de aislamiento bacteriano tendría que recolectar un pellet bacteriano que sea representativo no sólo de diferentes sitios del rumen, sino también de las bacterias asociadas al líquido y a partículas⁶⁷.

El uso del ácido diaminopimélico como marcador microbiano

Este método se basa en la estimación de la relación entre el ácido diaminopimélico y el nitrógeno en las bacterias ruminales y la cantidad de un marcador microbiano en la digesta⁵. La cantidad de nitrógeno bacteriano en la ingesta intestinal se calcula con base en estos valores⁶⁸. En pocas palabras, las muestras liofilizadas se hidrolizan con ácido metasulfónico y después se centrifugan. Entonces, la muestra derivatizada se inyecta en la columna y se somete una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Durante el proceso de oxidación, la metionina se convierte en metionina sulfona. En el último paso del proceso se lleva a cabo la separación cromatográfica de las columnas de intercambio iónico. El ácido diaminopoimélico se encuentra en la membrana celular de las bacterias ruminales y está ausente de los alimentos que comúnmente se proporcionan como alimento a los rumiantes⁶⁸. La precisión de la técnica depende de que se mantenga una relación constante entre el ácido diaminopimélico y el nitrógeno de las diversas especies de microbios, o entre especies microbianas en el rumen. Sin embargo, este último supuesto no es consistente con la naturaleza secuencial de la fermentación del rumen. Además, la relación entre el ácido diaminopimélico y el nitrógeno puede variar entre las especies bacterianas ruminales³⁹. Las diversas bacterias tienen distintas concentraciones de peptidoglicano en la pared celular y, por lo tanto, diferentes concentraciones de ácido diaminopimélico. Por ejemplo, las bacterias gram-positivas contienen entre 30 y 70 % de peptidoglicano en la pared celular; las bacterias gram-negativas contienen sólo un 10 %. Además, si se alimenta al ganado exclusivamente con dietas a base de forraje, las bacterias gram-negativas serán predominantes en el rumen, y si el ganado consume más concentrado, la proporción de bacterias gram-positivas aumentará^69,70. Por ello, las variaciones en la abundancia relativa de bacterias gram-positivas y gram-negativas puede afectar la estimación de la síntesis del nitrógeno bacteriano. Por ejemplo, si las bacterias gram-positivas predominan en el rumen, esta relación será mayor, y esto dará lugar a una subestimación de la síntesis de proteína bacteriana si los pellets de referencia no son representativos de la digesta entera.

El uso del nitrógeno marcado como marcador microbiano

La síntesis de la proteína microbiana también ha sido calculada cuantificando la incorporación del ¹⁵N de (^l5NH₄)₂SO₄ a los microbios^15,6. El ¹⁵N se introduce de manera constante en el rumen a través de una cánula ruminal, a razón de aproximadamente 1 L por día. Este método se basa en la incorporación de nitrógeno amoniacal marcado y no toma en cuenta la proteína microbiana sintetizada directamente a partir de los aminoácidos o péptidos. La técnica de utilizar el nitrógeno como marcador es no sólo costosa sino también bastante compleja, y por ende no ha sido ampliamente utilizada. Una de las ventajas de este enfoque, comparado con el análisis de las purinas, es el hecho de que la proteína marcada con ¹⁵N que sale del rumen sólo será de origen microbiano, mientras que una porción de las purinas que salen del rumen puede ser de origen alimentario⁷¹. Sin embargo, se ha demostrado que la relacion marcador/nitrógeno difiere entre las bacterias asociadas con la fases líquida y las asociadas con la fase particulada³⁰. Así, resulta todo un reto establecer esta razón a partir de un pellet bacteriano representativo.

El uso del ADN como marcador microbiano

La PCR en tiempo real es una herramienta potente que se utiliza para el análisis cuantitativo del ácido nucléico. Recientemente se ha probado el ADN como marcador microbiano empleando este método. La PCR en tiempo real es un refinamiento de la PCR desarrollado a mediados de los 1980^72,73, que permite la detección rápida del ADN microbiano, indicando así la presencia de un microorganismo o grupo de microorganismos. En comparación con un método convencional de PCR que emplea dos cebadores -uno directo y uno inverso-, en los ensayos de PCR en tiempo real se requiere de una sonda fluorescente adicional. Por ello, este método es altamente sensible y específico, dado que se utilizan tres oligonucleótidos complementarios al marcador de ADN⁷⁴. Una ventaja de este enfoque es que permite cuantificar la proteína microbiana que se origina en las bacterias, protozoarios y levaduras, lo cual no se podría lograr utilizando los marcadores microbianos convencionales. Por lo tanto, el método se basa en la cuantificación de un segmento de ADN específico de estos dominios microbianos⁷⁴.

Uno de los primeros estudios que utilizaron ADN mediante una PCR en tiempo real para estimar la proteína microbiana se realizó en el año 2005⁷⁵, empleando el gen protozoario 18S como marcador microbiano. Este ensayo se utilizó para cuantificar la cantidad de biomasa protozoaria en el líquido ruminal y la digesta del intestino delgado. Estos autores también reportaron que el someter la digesta duodenal a dos ciclos de congelación y descongelación reducía la recuperación casi a la mitad, pero el uso de una sola congelación (una práctica estándar) parecía incrementar la recuperación del ADN microbiano. El ensayo incluye procedimientos para aislar las células protozoarias del rumen a fin de utilizarlas como una norma para convertir las copias del gen 18S a una base de biomasa. Se ha determinado que el nitrógeno protozoario constituye el 12.7 % de la reserva de nitrógeno microbiano ruminal total, y 11.9 % del initrógeno microbiano duodenal en las dietas altas en forraje⁷⁵.

Los investigadores también han reportado el uso de ADN microbiano como un marcador para estimar la proteína bacteriana midiendo el gen 16S^5,8, o la proteína de levaduras midiendo parte del segundo cromosoma de Saccharomyces cerevisiae⁹. Una de las ventajas de utilizar ADN como marcador microbiano consiste en que es altamente específico para un amplicón que forma parte de las bacterias, los protozoarios o las levaduras y excluye cualquier material externo originado de alimento no degradado, lo cual evita la contaminación^8,64. La cuantificación de la proteína de las levaduras de la proteína microbiana es particularmente importante cuando las raciones de alimento de los rumiantes incluyen ingredientes que contienen células de levaduras de Saccharomyces cerevisiae, como las de la industria del etanol⁷⁶. Si la contribución de la proteína alimentaria de levaduras no se cuantifica por separado, entonces se sobreestimará la proteína microbiana que se origina de las bacterias y los protozoarios.

Entre los principales componentes del ensayo de PCR en tiempo real se incluyen 1) un cebador directo, que es un oligonucleótido de entre 20 y 24 pares base y cuyo extremo 5’ se tiempla hasta el extremo 3’ del marcador de ADN⁷³; 2) También se requiere un cebador inverso, oligonucleótido cuya longitud debería ser de entre 20 y 24 pares y cuyo extremo 5’ debería ser compatible con el extremo 3’ del marcador de ADN microbiano⁷³; 3) Asimismo se requiere una Sonda dual marcada. La reacción de la PCR en tiempo real se lleva a cabo mediante ciclos de temperatura. Se aplica una alta temperatura (95 ºC) para separar las cadenas del ADN de doble hélice; después, la temperatura se baja a 60 ºC para permitir que los cebadores se tiemplen hasta el marcador de DNA, y por último, la temperatura se sube a 72 ºC, que es la óptima para la polimerasa que extiende los cebadores⁷⁴.

No obstante, reportes recientes indican que algunas especies de bacterias y protozoarios pueden presentar diversos números de copias de los marcadores de ADN utilizados. Por ejemplo, los filos Firmicutes y Gammaproteobacteria pueden contener cinco veces más copias del gen 16S que el resto de los filos bacterianos⁷⁷, lo cual podría introducir un sesgo en el método si los pellets bacterianos utilizados como referencia no son representativos de las muestras que se están analizando. Además, se ha sugerido que los valores más bajos estimados de proteína microbian podrían deberse a la recuperación incompleta de copias de ADN de las muestras⁸ o a que los cebadores universales utilizados no se ligan al 100 % de los genes microbianos 16S y 18S, cuando se cuantifica la proteína bacteriana o protozoaria, respectivamente.

El uso de la secuenciación del ADN de alto rendimiento

Los avances recientes en las técnicas moleculares aplicadas a la secuenciación de ADN de alto rendimiento del ADN microbiano en combinación con el análisis bioinformático de la población microbiana que habita en el rumen han hecho aportaciones importantes a nuestro conocimiento del microbioma ruminal¹². Esta técnica ha sido aplicada a una variedad de temas de investigación relacionados con la nutrición de los rumiantes. Por ejemplo, se han logrado nuevos conocimientos de los cambios en la población bacteriana de los rumiantes debido a un cambio en la composición de la dieta²¹, a un cambio en el pH ruminal³⁷, a las bacterias biohidrogenizadoras^14,78, al papel de las bacterias en la composición de la grasa de la leche⁷⁹ y a las arqueas que intervienen en la formación del metano^22,80. Además, la secuenciación del ADN puede mejorar nuestra comprensión de los factores que afectan el cálculo de la proteína microbiana y su flujo al intestino delgado. Específicamente, se han revelado diferencias filogenéticas detalladas entre los pellets bacterianos que se utilizan como referencia y la población bacteriana de la digesta intestinal.

Diferencias taxonómicas entre las bacterias del líquido ruminal y de la digesta intestinal

Uno de los principales retos para la estimación de la síntesis de proteína microbiana y de su flujo al intestino delgado consiste en obtener un pellet bacteriano de referencia que sea representativo de la población microbiana de los contenidos ruminales. Si bien por mucho tiempo se han supuesto diferencias entre las bacterias del líquido ruminal y las de la digesta total que fluye ¹⁰, apenas en los últimos años el uso de la secuenciación de ADN de alto rendimiento ha permitido a los investigadores examinar el perfil taxonómico completo de los pellets de referencia y de la digesta intestinal ¹⁴. Estos hallazgos han revelado que el perfil taxonómico de los pellets bacterianos aislados del líquido ruminal difiere drásticamente del de las bacterias de la digesta intestinal cuando se analiza los niveles taxonómicos de filo, orden, familia y género (Cuadros 3 y 4). Por ejemplo, se han encontrado mayores proporciones de los filos bacterianos predominantes Firmicutes, TM7 y Tenericutes en los pellets bacterianos de referencia que en la digesta intestinal. Además, en los pellets de referencia se encontraron grandes proporciones de los órdenes bacterianos Bacteroidales y Clostridiales, así como niveles superiores de la familia bacteriana Lachnospiraceae. Por otra parte, los pellets bacterianos de referencia contenían proporciones más bajas de los filos Fibrobacteres, Spyrochaetes, Proteobacteria y Lentisphare, así como de la familia Ruminoccocaceae y del género Butyrivibrio. Estos hallazgos apoyan la idea de que el uso exclusivo de bacterias asociadas al como pellets de referencia daría lugar a un sesgo en la estimación de la síntesis de proteína microbiana, y de que es necesario desarrollar procedimientos de desprendimiento eficaces para obtener pellets bacterianos más representativos de los contenidos ruminales enteros a fin de calcular con exactitud la aportación de proteína microbiana a la proteína metabolizable total. Según estos hallazgos, el desprendimiento de las bacterias fibrolíticas de la fracción sólida de los contenidos ruminales es particularmente importante para obtener pellets microbianos de referencia que sean representativos.

Implicaciones de las diferencias taxonómicas entre las bacterias del líquido ruminal y las de la digesta intestinal sobre los marcadores microbianos

Los resultados obtenidos del uso de la secuenciación de ADN de alto rendimiento dilucidan los factores potenciales que pudieran sesgar la estimación del flujo de proteína microbiana al aislar el pellet representativo exclusivamente de la fase líquida de los contenidos ruminales. Por ejemplo, algunos estudios han sugerido que las bacterias asociadas a partículas contienen proporciones menores de purinas que las bacterias asociadas al líquido⁸¹. Los datos sobre el contenido de purina entre los diversos taxones bacterianos son limitados, y dado que existe una gran proporción de bacterias asociadas a partículas que quedan excluidas del pellet de referencia aislado durante la centrifugación diferencial, es probable que la divergencia entre el perfil taxonómico del aislado y el de la digesta intestinal represente una fuente de subestimación del suministro intestinal de proteína microbiana. Esto puede explicar en parte los valores estimados inferiores que se observaron en comparación con los valores predichos³.

La concentración de peptidoglicano varía, además, entre las bacterias, de modo que tienen concentraciones distintas de ácido diaminopimélico. Las bacterias gram-positivas contienen más peptidoglicano en la pared celular que las bacterias gram-negativas. Debido a que, cuando se utiliza el ácido diaminopimélico como marcador microbiano, los pellets de referencia aislados del líquido ruminal contienen una proporción mayor de Firmicutes (filo), Clostridiales y Coriobacteriales (órdenes) y Lachnospiraceae (familia) -representados en gran medida por bacterias gram-positivas- que las bacterias de la digesta intestinal, los investigadores tendrían que tener en cuenta la posibilidad de subestimar el flujo intestinal de proteína microbiana.

La información limitada sobre la manera en que la concentración de nitrógeno marcado varía entre las bacterias ruminales es escasa. Sin embargo, los reportes indican que la razón marcador/nitrógeno difiere entre las bacterias asociadas al líquido y las asociadas a partículas, y que el enriquecimiento de ¹⁵N es mayor en las bacterias asociadas al líquido que en las bacterias asociadas a partículas⁸². Por lo tanto, los resultados relativos a las diferencias entre el perfil taxonómico de las bacterias del líquido ruminal y el de las bacterias de la digesta intestinal sugieren que, cuando los pellets microbianos de referencia se obtienen únicamente del líquido ruminal, el flujo intestinal de proteína microbiana puede ser subestimado.

Por último, dadas las variaciones en el número de copias del gen 16S entre las bacterias ruminales, y en particular en los números mayores de copias en las Firmicutes, y debido a que las proporciones de Firmicutes son mayores en las bacterias aisladas del líquido ruminal, cuando se utiliza el ADN como marcador microbiano se pueden obtener valores de proteína bacteriana inferiores a los reales si los pellets bacterianos de referencia no son representativos de la digesta que fluye al intestino delgado.