Toma de muestras

La colección de muestras se realizó durante enero-diciembre de 2015, se utilizó un muestreo probabilístico por conglomerados en dos etapas⁸. Las unidades primarias las constituyeron los siete distritos y como unidades secundarias las unidades de producción (UP) dentro de los distritos. Se escogió una muestra de tres unidades primarias (n) y dentro de las unidades primarias se eligieron aleatoriamente un total de 17 unidades secundarias. En cada unidad secundaria (UP) se eligieron 6 gallinas, constituyendo un tamaño de muestra total de 109 gallinas adultas de las cuales: 93 gallinas criollas adultas, en primera etapa de postura, con peso promedio de 2.0 kg, 16 gallos adultos. El inventario estimado de gallinas adultas fue de 2,004 animales para la región de Valles Centrales, lo que constituyó el 6 % de la población muestreada. El tamaño de muestra fue obtenido con una precisión del 10 % y confiabilidad del 90 %. El muestreo fue distribuido en seis núcleos geográficos (ITVO: Nazareno e Itvo; Cuilápam: San Antonio, San Lucas y Cuilápam; Etla: San Juan y Suchilquitongo; Huixtepec: Huixtepec 1, 2, 3 y 4; Ocotlán: Chichicapam, San Antonino 1 y 2; y Tlacolula: Teotitlán, Totolapam 1 y 2, más un Testigo de gallinas Plymouth Rock. A cada animal de la vena cubital del ala se le extrajeron 2 ml de sangre, enseguida la sangre se depositó en tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, conservándose a una temperatura de -20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Extracción de ADN, marcadores microsatélites y procedimiento de PCR

El ADN se extrajo con el kit comercial ChargeSwitch® gDNA Plant Kit (Invitrogen), usando el protocolo del proveedor. La cuantificación del ADN se realizó con un espectrofotómetro de ultra-bajo volumen (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) ajustando las concentraciones de ADN a 10 ng μl^-1. Se utilizaron 10 pares de iniciadores de microsatélites para evaluar diversidad genética (Cuadro 1) reportados previamente^9-11. Los iniciadores se marcaron con las etiquetas fluorescentes (6-FAM, HEX o ROX) en el extremo 5’ para su detección por PCR múltiplex.

El procedimiento de PCR constó de un volumen total de 25 µl que contenían: 5 µl de Buffer 5X (Promega), 2 µl a 25 mM de MgCl₂ (Promega), 0.5 µl mezcla de DNTPs (Promega) a 2 mM, 1 µl de cada iniciador (5 pmol), 1U de Taq polimerasa (Promega) y 1 µl de ADN molde (10 ng µl^-1). La amplificación se realizó en un termociclador (Bio-Rad C1000^TM) con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización de 94 °C por 45 seg, alineación para grupos de iniciadores a 53.6 °C, 56.6 °C y 62 °C durante 1 min, una extensión de 72 °C por 1 min, y una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis capilar en un secuenciador automático de ADN (Genetic Analyzer ABI-3130 Applied Biosytems, Foster City, CA, USA) y analizados con el programa GeneMapper® de Applied Biosystems.

Análisis estadístico

Con base en el perfil alélico determinado en cada individuo para cada locus, se calcularon las frecuencias alélicas, heterocigosidad observada (Ho) y heterocigosidad esperada (He), así como el equilibrio Hardy-Weinberg. Con base en el grado de diferenciación genética de las poblaciones, se estimó con los estadísticos F de Wright (F_IS; F_IT y F_ST), considerando como criterio de agrupación los núcleos geográficos de origen de los individuos, para definir los parámetros de diversidad genética, se usó el programa POPGENE (Versión 1.3.2). Adicionalmente con las frecuencias alélicas de cada loci de las poblaciones, se realizó un análisis de componentes principales con el paquete SAS V. 9.4¹² y un análisis de agrupamiento por el método de UPGMA basado en distancias euclidianas para las poblaciones de gallinas criollas y grupo de referencia, para determinar su patrón de similitud genética.

Diversidad genética

Se identificaron en total 109 alelos en las 18 poblaciones de gallinas, considerando los 10 loci evaluados, el número de alelos varió desde seis para MCW145 hasta 16 para MCW158, con un promedio de 10.9 alelos por locus; todos los loci fueron polimórficos (Cuadro 2) coincidiendo en algunos de los iniciadores en un mapeo en pollos⁹. El MCW145, fue la excepción porque presentó un menor valor con respecto a lo reportado previamente^9,10.

En investigaciones realizadas en diferentes razas locales de gallinas criollas, encontraron un número total de alelos por locus menor al presente estudio, utilizando diferentes loci de microsatélites aplicados en la misma especie. Así, en Suecia, Alemania y Polonia, se reportaron 113, 217 y 62 alelos observados con 24, 29 y 10 loci respectivamente^1,13,14; por otro lado en China, Tailandia e India se encontraron valores similares 276, 227 y 170 alelos con 29, 20 y 17 loci^6,15,16. De igual manera, investigadores de Israel e Irán^17,18 encontraron 211 y 310 alelos en poblaciones locales, usando 22 y 31 loci de microsatélites, respectivamente. Coincidiendo en un promedio similar al encontrado en este estudio. El numero promedio de alelos reportados en las poblaciones de Oaxaca, México, muestran una amplia diversidad de genes, la cual es similar a la de otros países que poseen razas de gallinas locales bien definidas.

El número de alelos efectivos por locus varió desde 2.1 (MCW95) hasta 10.9 (MCW135), con un promedio de 4.9. El valor de heterocigosidad observada (Ho) osciló de 0.08 con el locus MCW145, y el valor más alto fue de 0.92 en el locus MCW134 (Cuadro 2), mientras que la heterocigosidad esperada (He) presentó valores de 0.54 (MCW95 y MCW145) hasta 0.91 (MCW135). Si bien esto sugiere la existencia de una amplia diversidad genética de las poblaciones analizadas, también indica discrepancias entre ambos tipos de heterocigosidad, lo que indica desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg, siendo las causales los procesos de migración, que ocurren en las poblaciones estudiadas o la deriva genética, posiblemente atribuida al bajo número de individuos que normalmente componen cada una de las poblaciones. Otros estudios^10,19 se han reportado valores de He para el locus MCW145 de 0.69 y 0.75, respectivamente; estos resultados fueron mayores a lo encontrado en este estudio (0.54), debido a que este locus se asocia con un menor número de alelos, que influyen de manera importante en el valor, pues cada alelo representa un término adicional a la sumatoria para el cálculo de He. En estudios^10,20 para el loci MCW134 se reportaron valores de He=0.68 y 0.64 en China, respectivamente. Son valores más bajos en referencia al valor obtenido en este estudio (0.805).

El número de alelos encontrados en poblaciones por loci fueron en orden descendente: el genotipo de referencia Plymouth Rock, con 70 alelos, seguida de Cuilápam con 65 alelos, contrastando con la población Teotitlán con 41 alelos, siendo el valor más bajo (Cuadro 3). Sin embargo, la población San Antonino 1 presentó el mayor número de alelos efectivos (43.8), seguida de ITVO con 37.8 alelos, mientras la población de Suchilquitongo registró 29 alelos efectivos, lo que implica un alto número de alelos que puede ser transmitido a la siguiente generación de gallinas criollas.

La heterocigosidad observada (Ho) en las poblaciones de gallinas varió desde 0.575 en la población San Lucas hasta 0.75 en la población San Antonino 2, con promedio de 0.741, mientras que la heterocigosidad esperada (He) fue más baja en el grupo de referencia (0.625), lo cual sugiere que existe un nivel de parentesco menor entre progenitores. Así mismo, las poblaciones Huixtepec 2, San Lucas y San Antonino 1 (0.733, 0.732 y 0.716, respectivamente), poseen la mayor diversidad genética, y por consiguiente un mayor potencial para su utilización en programas de mejoramiento. En estudios anteriores en gallinas locales^2,21-23 realizados en Suecia, Corea, China e India se reportaron valores de Ho y He más bajos. Por otro lado, en poblaciones de gallinas locales del Tíbet y China, encontraron valores de 0.798 y 0.76 para He^10,24, más elevados con respecto a lo encontrado en gallinas de Oaxaca, México; esto podria atribuirse al uso de diferentes loci de microsatelites.

Diferenciación genética de poblaciones de gallinas

Las agrupaciones de Ocotlán y Tlacolula presentaron los valores de F_IS más bajos (-0.072 y -0.079), indicando un mayor número de individuos heterocigotos dentro de cada población. En general, las agrupaciones de gallinas criollas son poblaciones no consanguíneas, esto por los valores menores a cero; y cercanas al equilibrio de Hardy-Weinberg. Estudios han enfatizado la adaptación de las gallinas locales a las diferentes condiciones geográficas que existen en cada país y por ello el equilibrio Hardy-Weinberg se mantiene constante en cada generación^2,21.

En el caso de F_IT, los valores más bajos fueron para Ocotlán y el testigo (-0.003 y -0.037), a nivel de unidades de producción. Mientras en Ocotlán, como era de esperarse, debido al cambio constante de reproductores machos mediante compra directa en los mercados regionales, se genera un importante flujo de material genético avícola local a nivel regional. Mientras en el grupo testigo, por su origen y esquema de reproducción establecido, se maximiza la obtención de individuos heterocigotos. En este caso, el grupo de Cuilápam presentó los mayores valores para F_IS (0.106) y F_IT (0.177), con respecto al resto de las agrupaciones, pero estadísticamente, estableciendo intervalos de confianza, se encuentra en equilibrio de sus individuos heterocigotos (Cuadro 4), explicado por la falta de un proceso de sustitución de machos en las unidades de producción, aumentando la relación de parentesco y la proporción de loci homocigotos.

Las agrupaciones de Cuilápam, ITVO y Huixtepec presentaron una diferenciación genética (F_ST) moderada²⁵ (0.079, 0.077 y 0.076, respectivamente); estos resultados indican que existe una diferenciación entre las poblaciones por aislamiento geográfico o de manejo, y por consiguiente, un reducido flujo genético entre individuos de las distintas regiones avícolas. El valor global para F_ST de 0.059 indica el 94.1% de la variación total está dentro las poblaciones y solamente el 5.9% se encuentra entre de las poblaciones²⁵ (Cuadro 4). Confirmando una moderada diversidad genética dentro de las poblaciones, lo que se asocia con la forma de selección de machos reproductores y hembras de remplazo realizado por las productoras y demuestra el potencial que existe para realizar mejoramiento genético intrapoblacional a través de esquemas de selección recurrente que permite aprovechar los efectos de la selección y recombinación en un proceso continuo. Resultados similares en cuanto a la diferenciación genética han sido reportados^26-28 en poblaciones de gallinas locales de Egipto, Bután, Asia y China, mientras que en otro estudio con ocho razas de pollos nativos de Corea²⁹ reportaron un mayor coeficiente de diferenciación (0.180).

Relaciones entre las poblaciones

El análisis de componentes principales (CP) explicó un 32.2 % de la variación total con los tres primeros componentes, conformados por alelos más importantes de los 10 loci de microsatélites (Cuadro 5). En el plano de tridimensionalidad de las poblaciones (Figura 1), con base en los primeros tres componentes principales, se identifica a las poblaciones más alejadas: Nazareno= A, ITVO= B y Suchiquitongo= J y Huixtepec=N, caracterizadas por no permitir material genético avícola comercial, lo que sugiere un marcado flujo genético dentro de las mismas poblaciones. En otros estudios se han encontrado diferenciaciones claras en las poblaciones de gallinas locales en Kenia³⁰, así como en la india³¹, usando CP considerando a los dos primeros componentes con valores de 46.25 % y 23.37 % de la variación genética con gallinas locales.

Figura 1 Plano de la dimensionalidad de las poblaciones de gallinas con los componentes principales CP1 vs CP2 vs CP3, generados con las frecuencias alélicas de 10 loci de microsatélites 

Los agrupamientos obtenidos por el análisis de conglomerados (Figura 2) fueron similares a los observados en plano de dimensionalidad del análisis de componentes principales, se distinguen tres agrupaciones principales (distancia genética de 0.90). El primer grupo conformado por Nazareno, ITVO, San Lucas y San Antonio, que incluye poblaciones aisladas y diferentes genéticamente por características únicas de las gallinas criollas, producto de un reducido flujo genético en estas poblaciones criollas con poblaciones avícolas con un grado de recombinación con razas conocidas como Plymouth Rock. En el subgrupo 2 están las poblaciones que poseen un mayor grado de parentesco genético, evidenciado por la proporción de alelos con el grupo de referencia (Plymouth Rock), como causa del proceso de introducción de esta raza comercial en las comunidades mediante paquetes tecnológicos y en consecuencia, se origina un proceso de cruzamientos con gallinas adaptadas a las condiciones ambientales y de manejo de las diferentes zonas rurales, ocasionando una pérdida o desgaste de las características de adaptación y supervivencia de las gallinas criollas. El tercer subgrupo estuvo conformado por las poblaciones de Huixtepec 4, San Antonino 2, Teotitlán y Totolapam 1, comparten frecuencias alélicas similares, lo que sugiere que tienen una variabilidad en rasgos fenotípicos únicos, propios de las gallinas criollas.

Figura 2 Dendograma de las poblaciones de gallinas, construido con el método UPGMA con base en distancias euclidianas obtenidas a partir de frecuencias de 109 alelos de microsatélites