Introducción

La tuberculosis (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) representa un riesgo para la salud pública y una amenaza a la seguridad sanitaria; es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial¹. Es una enfermedad infecto-contagiosa que afecta principalmente a los pulmones². La organización mundial de la salud (OMS), reportó que en el año 2021 murieron 1.4 millones de personas, y considera que es la enfermedad más mortífera después de la COVID-19; se estima que 10.6 millones de personas se enfermaron de TB en el año 2021³. Es evidente que durante la pandemia causada por COVID-19, el sistema de atención, diagnóstico y tratamiento de TB fue deficiente; esto aumenta la posibilidad de un remonte de la enfermedad, con un posible impacto en la salud mundial⁴. En la mayoría de los casos el virus SARS-CoV-2 ocasiona una infección respiratoria en el individuo infectado, la cual se puede complicar en diferentes grados que van de leves a graves. El uso de medicamentos inmunosupresores en COVID-19 puede conducir a un aumento en la expresión génica de Mtb. Algunos reportes, describen casos de co-infección entre Mtb y SARS-CoV-2, con una prevalencia de TB entre los pacientes con COVID-19 de entre 0.47 y 4.47 %, y se reporta que la tasa de mortalidad en pacientes con TB/COVID-19 fue más alta que la de los pacientes afectados solo por uno de estos patógenos^4-6.

En la práctica clínica cotidiana, el diagnóstico certero de la TB es por medio del cultivo del microorganismo, y se requieren bacterias en crecimiento para realizar pruebas de susceptibilidad a los medicamentos, lo que resulta un desafío médico importante y vuelve lento el procedimiento⁷. Aunado a esto, existe el problema del desarrollo progresivo de la TB farmacoresistente, lo que refuerza la necesidad urgente de investigar nuevas moléculas para diagnóstico y control de la TB⁸. El diagnóstico oportuno; tanto como el tratamiento eficaz de los individuos infectados, podría ayudar a reducir la TB. Por esta razón, es indispensable realizar investigación de biomarcadores novedosos para el diseño de métodos de control. En los últimos años, se ha investigado a los microRNAs como moléculas prometedoras para tales efectos, debido a su alta estabilidad, sensibilidad y especificidad⁹. Los miRNA son pequeños RNA reguladores no codificantes que actúan reprimiendo la expresión de proteínas a nivel postranscripcional, y tienen funciones importantes en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos¹⁰. Los mecanismos de regulación de los miRNAs, se basan en la complementariedad de secuencias entre el miRNA y el RNAm blanco; si la unión es perfecta resulta en la degradación del RNAm, si la unión es parcial, se reprime la traducción¹¹. La deadenilación del RNAm conduce a la inestabilidad y por ende la degradación del RNAm¹⁰. Después de cualquiera de estos mecanismos, se activa la respuesta inmune innata del huésped, con la producción de citocinas y quimiocinas¹¹.

El desarrollo en las ciencias omicas ha permitido la rápida identificación y caracterización de pequeños RNA no codificantes, los cuales forman parte de un complejo sistema de regulación génica, y se ha encontrado una expresión diferencial de estos en individuos infectados con TB. Durante la infección con Mtb, se activa la respuesta inmunitaria del huésped, en esta interacción huésped-Mtb, se manipula el perfil de miRNAs; esto implica la regulación de varios procesos biológicos mediados por esas moléculas¹¹. Algunos miRNAs que se modifican durante una infección por Mtb; también se producen en células inmunitarias contenidas en el granuloma y conducen a la respuesta inmunitaria adaptativa; también se pueden secretar en el medio extracelular, a través de procesos como la apoptosis o necrosis, la encapsulación dentro de microvesículas o exosomas y mediante la unión a lipoproteínas de alta densidad (HDL), entre otras. Esto permite patrones estables de expresión de miRNAs asociados a la infección por TB¹².

Se sabe poco sobre la patogénesis molecular de la enfermedad, pero existen reportes recientes que demuestran la importancia de los miRNA en la TB pulmonar y que pueden ser detectados en sangre de pacientes infectados; por lo que actualmente son señalados como candidatos para el diagnóstico. Los miRNA, que son modulados en respuesta a la infección con Mtb, son miR-125b, miR-155, miR-144, miR-3179, miR-147, miR-146a/b, miR-886-5p, let-7e, let-7i^13,14. La presencia y regulación de estos miRNA en humanos infectados por TB indica su importancia en la patogénesis y sobrevivencia del bacilo, por lo que es indispensable su investigación durante la infección.

El miRNA 146b ha sido asociado a la regulación de diversas vías de señalización y algunos de sus genes blanco descritos son AKT3, IL6, IRAK1, NFKB1, TLR4¹⁵; y se ha reportado que se sobre expresa en el suero de pacientes con TB activa¹⁶. El miR-155 modula la producción de mediadores inflamatorios en respuesta a estímulos microbianos regulando negativamente la expresión de TAK1 y la proteína de unión a TRAF6. También se ha observado que, en la infección por TB, miR-155 se sobre expresa e inhibe la autofagia inducida por IFN-γ; algunos de los genes blanco a los que ha sido asociado son AKT1, APAF1, ATP6V1H, CASP3¹⁵. Interesantemente, miR-155 tiene doble función durante la infección con TB; por un lado, mantiene la supervivencia de los macrófagos infectados con Mtb y, por otro lado, promueve la supervivencia y la función de las células T específicas de Mtb¹⁷. Considerando la importancia de los miRNA en la patogénesis de la TB humana, donde se han detectado en sangre de pacientes enfermos; en este trabajo, se realizó la predicción de los genes a los que se unen los miR-146a, miR-146b y miR-155 y se realizó el análisis de las rutas metabólicas en las que estos intervienen.

Material y métodos

Resultados

Predicción de genes diana y análisis de las rutas metabólicas de los miRNAs

Los análisis bioinformáticos, permitieron predecir genes diana para los miR-146a, miR-146b y miR-155 (Cuadro 1); algunos de estos genes tienen grandes implicaciones durante la infección de TB. El miR-146a, puede regular genes involucrados en adhesión celular y procesos de formación del fagosoma (CLDN16, ATP6V1C2) (Figura 1). El miR-146b está involucrado en las rutas metabólicas de degradación de valina, leucina e isoleucina y la ruta de señalización de la hormona tiroidea entre otras (Figura 2). El miR-155 interviene en las rutas del sistema de intercambio de azufre y el metabolismo de triptófano; de acuerdo con las predicciones del programa KEGG (enero, 2022) (Figura 3).

Cuadro 1 Predicción de las principales rutas metabólicas y genes a los que se unen e interceptan los miRNA miR-146a, miR-146b y miR-155 

miRNA	Ruta metabólica KEGG	Genes blanco-destacados	Valor P
miR-146a	Moléculas de adhesión celular	CLDN16 (claudin 16)	0.02
	Fagosoma	ATP6V1C2 (ATPase H+ transporting V1 subunit C2)	0.03
miR-146b	Degradación de valina, leucina e isoleucina	BCKDHB (branched chain keto acid dehydrogenase) ABAT (4-aminobutyrate aminotransferase)	0.006
	Ruta de señalización de la hormona tiroidea	THRA (thyroid hormone receptor alpha) RXRB (retinoid X receptor beta)	0.01
miR-155	Sistema de intercambio de azufre	MOCS2 (molybdenum cofactor synthesis 2)	0.006
	Metabolismo de triptófano	IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygenase 1)	0.01

El análisis se realizó a partir de la secuencia madura -3p de cada miRNA.

Figura 1 Rutas metabólicas predichas KEGG para el miRNA 146a de acuerdo con los genes a los que se une. Panel A) Moléculas de adhesión celular, Panel B) Fagosoma. Se resaltan (amarillo) los genes destacados en esta investigación 

Figura 2 Rutas metabólicas predichas KEGG para el miRNA 146b de acuerdo con los genes a los que se une. Panel A) Degradación de valina, leucina e isoleucina, Panel B) Ruta de señalización de la hormona tiroidea. Se resaltan (amarillo) los genes destacados en esta investigación 

Figura 3 Rutas metabólicas predichas KEGG para el miRNA 155 de acuerdo con los genes a los que se une. Panel A) Metabolismo del triptófano, Panel B) Sistema relay de azufre. Se resaltan (amarillo) los genes destacados en esta investigación 

Los tres miRNA tienen genes diana validados en la base de datos. En el caso específico del miR-146a, sus principales rutas metabólicas KEGG son moléculas de adhesión celular y fagosoma; pero también participa en la regulación del metabolismo del cáncer, uno de los genes destacados en este proceso es ZEB2, que es un factor de transcripción que desempeña un papel en las vías de señalización del factor de crecimiento transformante β, que son esenciales durante el desarrollo fetal temprano y su desregulación ha sido caracterizada en diferentes tipos de cáncer²⁶. El software miRTarBase no muestra intersección de los miRNA en las rutas metabólicas, ya que no comparten genes diana predichos.

Discusión

En el análisis del miR-146a se encontraron dos rutas metabólicas predichas importantes, donde hay dos genes con los que interacciona este miRNA en rutas independientes; uno de ellos es el gen CLDN16 que codifica a la claudina 16. Las claudinas son proteínas con dominios transmembrana que se encuentran en la zona de unión estrecha entre las células de los epitelios y endotelios; junto a otras proteínas forman poros y son componentes clave del canal paracelular. Los canales paracelulares en la unión estrecha, tienen propiedades de selectividad iónica, dependencia del pH y otros efectos²⁷. La sobreexpresión de claudina 16 ha sido asociada a cáncer de ovario y otras enfermedades, y se ha determinado su importancia en la reabsorción de magnesio celular²⁷.

En un estudio se determinó el patrón de expresión de algunas claudinas (2 y 4), y se analizaron los cambios estructurales en biopsias de colon en pacientes con TB. Los resultados demuestran que la claudina 2 se expresa en la zona de unión estrecha entre las células y no se observaron cambios estructurales en el tejido analizado²⁸. Recientemente, se investigó el efecto de la infección por TB en la expresión de proteínas de unión celular en el sistema nervioso central (SNC). Estos resultados sugieren que Claudina-5 disminuye su expresión y cambia su localización dentro de la célula en respuesta a la infección con Mtb de la cepa N15, sugiriendo que Mtb afecta la expresión de proteínas cerebrales de las uniones celulares. Este daño, consistió en cambios celulares sugerentes de toxicidad, debido a que se observaron signos de necrosis²⁹.

El gen ATP6V1C2 codifica a una enzima que es una ATPasa, algunos estudios han sugerido la importancia de las ATPasas tipo P en la fisiología y la supervivencia intracelular de las micobacterias³⁰. Un perfil transcripcional en humanos, de las ATPasas en condiciones de hipoxia, estrés oxidativo, inanición e intoxicación por agentes químicos y procesos de infección in vitro e in vivo, evidenció la expresión diferencial de estos transportadores frente a estas condiciones. La ATPasa es una bomba de protones altamente conservada que se expresa en las células³¹. Recientemente, se realizó un estudio donde se investigaron dos compuestos que inhiben el crecimiento de cepas de TB sensibles y resistentes a los medicamentos, en este estudio, a través de ensayos transcriptómicos mostraron cambios en la expresión de ciertos genes en respuesta a la infección con TB; uno de esos genes fue ATP6V1C2 el cual se encontró sobre expresado en respuesta a la infección con TB³².

El miR-146b interacciona con genes destacados que participan en la producción de energía en las células, tales como la deshidrogenasa (BCKDHB); y con aminotransferasa (ABAT) involucrada en la degradación de valina, leucina e isoleucina. Algunos reportes indican que el aumento en la actividad del lactato deshidrogenasa sérica es un indicador de diagnóstico presuntivo de neumonía y otras infecciones como la TB³³.

El miR-155 demostró interacción con los genes MOCS2 e IDO-1, los cuales provienen del sistema de intercambio de azufre y del metabolismo de triptófano respectivamente. El gen MOCS2 codifica para dos proteínas diferentes MOCS2A y MOCS2B, estas dos juntas forman la enzima molibdopterina sintasa que participa en la biosíntesis del cofactor de molibdeno (MoCo), que es un grupo prostético. Las enzimas dependientes de MoCo intervienen en muchos procesos biológicos; interesantemente, el MoCo funciona directamente en las enzimas etilbenceno deshidrogenasas y otras³⁴. El molibdeno (Mo) es necesario para que varias enzimas como el sulfito oxidasa, el aldehído oxidasa, entre otras puedan tener su función. La función de esas enzimas es la descomposición de sustancias en el cuerpo, algunas de las cuales son tóxicas si no se metabolizan. Algunas Micobacterias tienen genes que codifican para MoCo. Mtb posee múltiples homólogos que codifican sintasa en la biosíntesis de MoCo; esto sugiere que su expansión puede cumplir diferentes funciones celulares³⁵.

Las enzimas de Mo son catalizadores en la generación de energía y reacciones de desintoxicación, entre otras funciones. Se sabe que los sustratos convertidos por las enzimas Mo bacterianas, que son importantes para la virulencia son del grupo que se generan en el huésped durante la inflamación o red de señalización. Esto sugiere que podrían ser objetivos importantes de fármacos³⁶. Las enzimas de Mo catalizan importantes reacciones redox. Las micobacterias tienen varias enzimas que contienen Mo; estas ayudan a regular la latencia de Mtb. El cofactor MoCo, es el cofactor común de las enzimas Mo en las micobacterias³⁷. En algunos experimentos se ha identificado una vía novedosa que usa Mtb para la resistencia al estrés (hipoxia) impuesto por el huésped; esta capacidad de Mtb de persistir en condiciones de hipoxia, contribuye a la TB latente en el huésped. Mtb adquirió a través de transferencia horizontal el gen moaA1-D1, el cual está involucrado en la biosíntesis del MoCo; a saber; estos genes tienen homólogos presentes en todo el género Mycobacterium; interesantemente los genes moaA1-D1 se inducen bajo condiciones de hipoxia³⁸. Evolutivamente, el complejo Mtb ha desarrollado mecanismos para tener éxito, en parte por la adquisición de genes involucrados en la patogénesis. Descifrar y conocer los mecanismos a través de los cuales Mtb causa enfermedad, es relevante para identificar objetivos desconocidos y de interés para el desarrollo de nuevo métodos de control, diagnóstico y terapia de la enfermedad. El estudio amplio de la biosíntesis de las enzimas MoCo de Mtb, ayudará a identificar objetivos farmacológicos prometedores para controlar la TB, especialmente la TB latente.

El gen IDO-1 codifica a una enzima que se encuentra principalmente en macrófagos, la enzima participa en la degradación del triptófano que genera quinurenina; esta ruta metabólica constituye un mecanismo de modulación de la respuesta inmune. La indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO-1) es un enzima que se encuentra en numerosas células³⁹. La IDO-1 ayuda a la degradación del triptófano en quinurenina, en el interior de las células, y por tanto regula la disponibilidad del triptófano. Esto tiene amplias implicaciones en la respuesta inmune del organismo. Se ha reportado que la proteína IDO-1 se sobreexpresa en respuesta a la infección con Mtb en macrófagos humanos y murinos in vitro. La sobreexpresión de IDO-1 se ha correlacionado también, con la expresión de otros marcadores inflamatorios, como la proteína C reactiva y el mal pronóstico de pacientes con TB^40,41.

Estudios in vitro demuestran que la actividad de IDO-1 en las células presentadoras de antígeno, inhibe la proliferación de células T específicas de antígeno micobacteriano. La actividad de IDO-1 podría tener una función importante en la inhibición de la respuesta inmunitaria adaptativa específica para Mtb, y podría ayudar a que el patógeno sobreviva en el huésped infectado. El metabolismo del triptófano es un medio para regular las funciones de las células T, como en la evasión del sistema inmunitario inducido por tumores, la tolerancia periférica y la inflamación durante la infección^40,42. La activación del metabolismo del triptófano es un mecanismo antimicrobiano que se presenta contra algunas bacterias patógenas. La activación de IDO-1 y el metabolismo de triptófano en los macrófagos dentro del SNC, se relaciona con demencia asociada a el SIDA y otras enfermedades cerebrales inflamatorias⁴³. Intervenir la actividad de la enzima IDO-1, es una estrategia prometedora para desarrollar tratamientos en los trastornos neurológicos asociados con el VIH. En relación con la alta prevalencia de individuos infectados con VIH y Mtb. Así como una terapia (dirigida al huésped) efectiva contra la TB.

Si bien, este análisis se realizó en los miRNA que se han descrito en humanos, es importante destacar que el genoma de M. bovis tiene similitud a nivel de nucleótidos de más del 99.95 % con M. tuberculosis; no obstante, M. bovis ha perdido parte de su genoma debido a mutaciones genéticas, por mecanismos de deleción; lo que lo hace más pequeño (M. bovis AF2122/97: 4’345,492 pb) comparado con M. tuberculosis (CDC1551: 4’403,836 pb)^44,45. Interesantemente, se ha sugerido que M. tuberculosis surgió de M. bovis durante el periodo en que el ganado fue domesticado por el hombre, aproximadamente hace 10-15,000 años, al infectar al humano⁴⁶. Esta aseveración está fundada en la observación de la infección (causada por varias cepas de M. bovis) en diferentes hospederos animales incluyendo al humano; mientras que la infección natural de M. tuberculosis, aparentemente hasta la fecha de esta publicación, se encuentra restringida al humano⁴⁷. Esta similitud tan estrecha entre estas dos especies hace que el estudio de productos génicos, proteicos, así como miRNA que pueden ser análogos o equivalentes entre M. tuberculosis y M. bovis, sea viable para tratar de comprender un poco más de la patogénesis de la tuberculosis causada por estas dos especies, y quizá para sentar las bases para el diseño de nuevos biomarcadores o posibles blancos terapéuticos.

Conclusiones e implicaciones

Los hallazgos mostrados aquí, sugieren que los miR-146a, miR-146b y miR-155 están asociados a la activación de mecanismos moleculares específicos en respuesta a la TB. Los genes con los cuales los miR-146a y miR-155 interaccionan o se unen, están involucrados en la respuesta inmune y en procesos celulares imprescindibles durante una infección por TB.