Origen de los hongos micorrízicos arbusculares

Los AMF se aislaron de suelo proveniente de la selva baja caducifolia del Sureste de México, en la reserva ecológica Cuxtal, con ubicación de 20° 52’ 07.44’’ N y 89° 36’ 51.64’’ W. El tipo de suelo es Leptosol con profundidad que varía de 0 a 25 cm (^{Díaz-Garrido et al., 2005}). El clima es cálido sub-húmedo con lluvias en verano e invierno. La precipitación media anual es de 900 mm con temperatura media anual es de 27.5 °C (^{García, 1973}). La vegetación dominante está compuesta por bosques tropicales caducifolios (^{Flores & Espejel, 1994}).

Propagación, extracción e identificación de los hongos micorrízicos arbusculares

Para identificar a los AMF, el suelo colectado se tamizó y mezcló con arena estéril (1:1 v/v) y se colocó en macetas de 10 kg para su propagación. En seguida, como cultivo trampa (^{Sieverding, 1991}) se sembraron semillas de sorgo (Sorghum bicolor L.). Las macetas se mantuvieron en invernadero en promedio a 36 ± 2 °C y humedad relativa en promedio del 64 %, se realizaron riegos a capacidad de campo. Después de 12 semanas y con el propósito de estimular la esporulación de los AMF se suspendió el riego. En la semana 16 se realizó la extracción de esporas, de acuerdo al método de tamizado y decantación en húmedo y centrifugación (^{Gerdermann & Nicholson, 1963}), donde se procesaron 100 g de suelo de cada maceta de propagación, se homogenizo con Tween 20 (0.05 %) en agua, la solución se filtró a través de una serie de tamices con apertura de mallas de 600, 425, 90 y 25 μm, y de las fracciones retenidas se extrajeron las esporas y se depositaron en viales de 1.5 mL de capacidad provistos con agua destilada estéril.

La identificación se realizó comparando y contrastando las características morfológicas de las esporas, con descriptores específicos para género y especie, disponibles en el sitio web del International Culture Collection of Arbuscular and Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal Fungi (^{West Virginia University, 2020}), la taxonomía de Glomeromycota (^{Schenck & Pérez, 1990}; ^{Schüßler & Walker, 2010}). Las esporas se separaron por especies y se depositaron en viales. De acuerdo con las características morfológicas se identificaron tres especies: Funneliformis geosporum C. Walker & A. Schüßler, Claroideoglomus claroideum C. Walker A. y Glomus ambisporum C. Walker & A. Schüßler.

Para la conservación de las esporas se desinfectaron mediante la extracción del agua estéril de los viales y se le adicionó Tween 20 a 0.05 %, se centrifugaron a 500 rpm por un minuto, enseguida se eliminó el sobrenadante y se adicionó Cloramina T al 2 %, se centrifugó a 500 rpm durante 15 minutos, ambos procedimientos se repitieron dos veces. Finalmente se retiró el sobrenadante y se adicionaron a cada vial una mezcla de gentamicina (100 ppm) y estreptomicina (200 ppm) y se mantuvieron a 4 °C hasta su inoculación.

Evaluación de hogos micorrízicos arbusculares en el crecimiento inicial de chile dulce (C. annuum).

Se evaluaron cinco tratamientos, tres constituidos por cada especie de AMF: T1 = F. geosporum, T2 = C. claroideum y T3 = G. ambisporum, con la incorporación de un 50 % de fertilización química, dos tratamientos testigos: T4 = fertilización química 100 % (Polyfeed^®, 17-17-17, Haifa, México, 2 g L^-1 de agua) sin AMF, aplicada dos veces por semana, a partir de los 10 días después a la siembra (dds) y T5 = un control (solo agua, sin AMF y sin fertilización).

Previo al establecimiento del experimento, se esterilizó suelo mediante arrastre de vapor durante tres días por 1 hora a 90 °C, y se llenaron diez charolas de germinación de 72 cavidades. En seis de éstas por cada cavidad se depositaron 30 esporas de cada AMF, las cuatro restantes sirvieron para los testigos, sin la inoculación de AMF. En las charolas se sembraron semillas de chile dulce (C. annuum) tipo Criollo previamente desinfestada con hipoclorito de sodio al 1 %, seguido de dos lavados con agua destilada estéril. Las charolas se cubrieron hasta la germinación de las semillas y se mantuvieron en invernadero en promedio a 28 ± 2 °C, con humedad relativa promedio de 64 % e intensidad lumínica promedio de 400 luxes con la aplicación de riegos a capacidad de campo.

Transcurridos 47 dds se estimaron en 30 plántulas las variables de crecimiento: altura de plántula, biomasa aérea seca, peso fresco y seco de raíz. En cinco plantas por tratamiento se estimó el porcentaje de colonización micorrízica. Las raíces se lavaron con agua corriente y se depositaron en casetes para tejidos, posteriormente se pasaron por KOH al 10 %, H₂0₂ al 30 %, HCL al 30 %, con calentamientos y enjuagues con agua corriente. Finalmente se incorporó azul de tripano y se dejaron reposar por 24 h. Transcurrido este tiempo se eliminó el azul de tripano y las raíces se enjuagaron con agua corriente (^{Phillips & Hayman, 1970}).

Posteriormente se realizaron preparaciones permanentes, se tomaron 10 secciones de raíz y se montaron en un porta objeto, con la ayuda de papel estraza se presionaron para ablandarlas, enseguida se adicionaron dos gotas de alcohol polivinílico y un cubre objeto. Las muestras se etiquetaron y se metieron a la estufa de secado a 47 °C por 72 h. Finalmente se observaron en un microscopio óptico las estructuras de los AMF (micelio, esporas, vesículas y enrollamientos) y se cuantificó el porcentaje de colonización (^{McGonigle et al., 1990}).

Obtención de J₂ de M. incognita

Se muestrearon plantaciones comerciales en producción de chile dulce (C. annuum) parasitadas por M. incognita, en el municipio de Tixpehual, Yucatán, localizado 20°58´40”N y 89°26´30”W a una altitud de 8 metros sobre nivel del mar. Las raíces agalladas se depositaron en bolsas de papel y se conservaron a 6 °C en refrigeración durante 24 h. Se lavaron con agua corriente y se extrajeron masas de huevos con jeringas bajo el microscopio estereoscópico (Leica M80, USA). Éstas se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1 % durante un minuto y se lavaron con agua destilada estéril hasta eliminar el desinfectante. Los huevos se incubaron en una estufa de estufa de cultivo microbiológico a 25 ± 1 °C durante tres días hasta la eclosión de los J_2. Posteriormente, se concentraron en un matraz de 500 mL, se tomó 1 mL y se contabilizaron para calibrar el inoculo. De las raíces con agallas se extrajeron hembras adultas para identificar la especie mediante caracteres morfotaxonómicos (^{Ayuob, 1980}).

Bioensayo de control de M. incognita en invernadero

Para estimar el biocontrol de M. incognita con los AMF, se llenaron con suelo estéril, macetas de plástico de 2 kg de capacidad. Previo al trasplante se realizó un hoyo de tres cm de diámetro y cinco cm de profundidad y se inoculó 1 mL de agua que contenía 1,000 huevos larvados y 300 J₂ de M. incognita, enseguida se trasplantó una plántula de chile dulce (C. annuum) de 47 días de edad inoculadas con los AMF, como se indica en el primer experimento y provenientes de éste.

En este experimento hubo un ajuste de la nutrición de las plantas a partir de la inoculación del nematodo. La cual consistió en una fertilización con equilibrio químico 2:1:1, con las fuentes: urea (Magro^®, 46-00-00, Fertinova, México), nitrato de potasio (Ultrasol^®, 12-00-46, SQM, México) y fosfato monoamónico (MAP^®, 12-61-00, Greenhow S. A. de C. V. México), aplicada dos veces por semana.

En este experimento también se evaluaron cinco tratamientos: tres constituyeron las especies de AMF: T1 = F. geosporum, T2 = C. claroideum y T3 = G. ambisporum, dos tratamientos testigos: T4 = un nematicida oxamil 24 % en dosis de 1 mL L^-1 de agua (Vydate^®, Dupont, México), aplicado al suelo al momento del trasplante, con nematodos y sin AMF y T5 = un control, con nematodos y sin AMF. Cada tratamiento estuvo constituido por 15 plantas que constituyeron las repeticiones, distribuidas en condiciones de invernadero, indicadas en el primer experimento.

Los tratamientos se evaluaron a los 50 días después de la inoculación con M. incognita, se consideraron como variables de biocontrol del nematodo: el índice de agallamiento estimado con una escala de daño radical para nematodos agalladores (^{Taylor & Sasser, 1983}), el número de huevos y hembras por gramo de raíz (^{Herrera-Parra et al., 2014}). Como variables de crecimiento se midieron: altura de planta, número de botones florales por planta, biomasa aérea seca por planta, peso fresco de raíz, longitud de raíz y finalmente por desplazamiento volumétrico, volumen de raíz. Como variables asociadas a los AMF se estimó el porcentaje de colonización en las raíces de cinco plantas por tratamiento de acuerdo con las técnicas de ^{Phillips y Hayman (1970)} y ^{McGonigle et al. (1990)} indicadas en el primer experimento.

Diseño experimental y análisis de datos

En los experimentos se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Con los datos obtenidos se realizaron análisis de varianza y para el caso de los datos relacionados con la colonización total micorrízica y el índice de agallamiento, que no cumplieron con los supuestos de distribución normal, se transformaron para homogenizar varianzas mediante la función de arco seno [y = arcsin (x/100)]. Se aplicó como comparador de medias el método de Tukey (p ≤ 0.05), mediante el paquete estadístico InfoStat 2018.

Respuesta de plántulas de chile dulce (C. annuum) a la inoculación con hongos micorrízicos arbusculares

Los AMF promovieron un crecimiento significativo (p ≤ 0.01) de las plántulas de C. annuum a los 47 dds en comparación a las plántulas del control. Los tratamientos que incluyeron a C. claroideum y G. ambisporum incrementaron la altura de las plántulas hasta un 20.50 % en relación a las inoculadas con F. geosporum y a las de fertilización química al 100 %, y hasta un 73 % en relación a las del control (Tabla 1).

Un efecto significativo (p ≤ 0.01) de producción de biomasa aérea seca se obtuvo con G. ambisporum con ganancias de un 97 % en relación a las plántulas del control, además superó a la fertilización química al 100 % y a F. geosporum con los que se registró hasta un 0.32 ± 0.03 g de biomasa aérea seca. También, C. claroideum mejoró esta variable respuesta al igual que G. ambisporum y la fertilización química al 100 % (Tabla 1).

El crecimiento de raíces se incrementó significativamente (p ≤ 0.01) con C. claroideum y G. ambisporum e incrementaron significativamente la biomasa fresca (90 %) y seca (98 %) de raíz, en relación a las del control. Los promedios de biomasa fresca y seca de raíz con la fertilización química al 100 % fueron iguales a los causados con F. geosporum e inferiores a los de C. claroideum y G. ambisporum (Tabla 1). En el cultivo de C. annuum se requiere una fase preliminar de crecimiento en condiciones protegidas, para obtener plántulas con características deseables para su establecimiento en los sistemas de producción (^{Macías-Rodríguez et al., 2013}). En esta etapa la inoculación con C. claroideum y G. ambisporum es una alternativa para mejorar el crecimiento de las plántulas (altura, biomasa aérea y radical), incluso con mejores características a las obtenidas con la fertilización química al 100 %. Estos efectos se han observados en cultivares de C. annuum Ancho con Glomus spp + Gigaspora sp. y la incorporación de fertilización a dosis media (P 22 µg mL^-1) donde se estimaron mayor biomasa seca (^{Alonso-Contreras, 2013}). En cultivares como Jalapeño, De árbol y Serrano con la inoculación Rhizophagus intraradices (antes Glomus intraradices) y Glomus zac-19 mejoraron la emisión de hojas, diámetros de tallos y biomasa aérea (^{González-Mendoza et al., 2015}). En C. frutescens favorecieron el crecimiento inicial con F. mosseae y Racocetra fulgida (antes Scutellospora fulgida) en combinación con el 50 % de estiércol de bovino (^{Jiménez et al., 2017}). Otros reportes señalan que los AMF incrementan significativamente la actividad fotosintética, el contenido de clorofila y la asimilación de agua y nutrimentos inmóviles del suelo (^{Alvarado-Carrillo et al., 2014}; ^{Lehman y Rilling, 2015}), reducen el estrés biótico y abiótico (^{Khalid et al., 2016}; ^{Tchabi et al., 2019}) lo que favorece el crecimiento de la fase inicial de los cultivos como se observó en este estudio.

De las tres especies de AMF, F. geosporum fue la que menos favoreció el crecimiento de las plántulas. Esta repuesta pudo estar modulada por la compatibilidad entre el AMF y el hospedero y no se establece una simbiosis mutualista funcional (^{Jin et al., 2017}; ^{Bazghaleh et al., 2018}), lo que no manifiesta efecto positivo sobre la producción de biomasa en las plantas (^{Rosheim, 2016}; ^{Avio et al., 2017}). Los resultados indicaron que los AMF con dosis medias de fertilización favorecieron el crecimiento de las plántulas de C. annuum y que la incorporación de estos microorganismos puede ser una alternativa complementaria para la producción de plántulas, lo que reduce el uso de fertilizantes químicos y daños al ambiente.

Las especies de AMF: F. geosporum, C. claroideum y G. ambisporum colonizaron las raíces de las plántulas de C. annuum, con diferencia significativa (p ≤ 0.01). En particular, G. ambisporum tuvo mayor colonización (100 ± 0.00 %), seguido de F. geosporum (98.66 ± 0.95 %) y C. claroideum (96.97 ± 1.73 %). Las plántulas con la fertilización química al 100 % y las del control tuvieron menos del 10 % de colonización de las raíces (Tabla 1). Los porcentajes de colonización estimados en las plántulas inoculadas con estos hongos sugieren que en esta etapa de crecimiento permiten la colonización de sus raíces, lo que puede ser una estrategia para incrementar el éxito del crecimiento en etapas tempranas del cultivo, donde se han reportado mejor translocación de P, tasa fotosintética y producción de biomasa seca (^{Alonso-Contreras et al., 2013}; ^{Nana et al., 2015}).

Efecto de hongos micorrízicos arbusculares en M. incognita

En las plantas control inoculadas con M. incognita, sin hongos micorrízicos arbusculares y sin la aplicación de nematicida, se observaron los síntomas de la enfermedad: clorosis, disminución del crecimiento y formación de agallas. En estas plantas hubo mayor índice de agallamiento (51.60 ± 37.24), número de huevos (408.30 ± 282.54) y hembras (60.80 ± 41.97) (p ≤ 0.01) (Tabla 2).

El índice de agallamiento se redujo significativamente (p ≤ 0.01) con la inoculación de F. geosporum y G. ambisporum, con los que se redujeron daños de un 79.65 % en relación a las plantas control (Tabla 2). Este potencial se ha reportado con R. intraradices (antes G. intraradices) contra Nacobbus aberrans (^{Lax et al., 2011}), con Rhizophagus intrarradices, Funneliformis mosseae contra Rotylenchulus reniformis (^{Herrera-Parra et al., 2014}), con G. bagyarajii, G. macrocarpum contra M. incognita (^{Raghavendra et al., 2016}), con Gigaspora albida, Claroideoglomus etunicatum y Acaulospora morrowiae (antes Acaulospora longula) contra M. arenaria (^{Da Silva et al., 2017}), lo que evidencia la efectividad como agentes microbianos de biocontrol.

C. claroideum y el tratamiento nematicida, a pesar de que estadísticamente no tuvieron un efecto diferente al control, mostraron una tendencia en reducir el índice de agallamiento hasta un 38 %. El efecto con C. claroideum se relacionó con su capacidad de mejorar la longitud y ramificación de raíces lo que permitió nuevos espacios disponibles para la alimentación del nematodo y nuevas infecciones, lo que causó mayor daño y hasta un 87 % de producción de huevos y un 51 % en la formación de hembras, en relación con las plantas tratadas con el nematicida. Este tratamiento, no impidió la penetración de los J₂, pero redujo significativamente la reproducción del nematodo con 44.40 ± 3.20 huevos y 18.40 ± 1.89 hembras, y su efecto para reducir el daño fue igual que con F. geosporum y G. ambisporum, los que limitaron la producción de huevos del 89 % y de formación de hembras del 69.73 %, en relación a las plantas control (Tabla 2).

La capacidad de los AMF para reducir el daño y la reproducción de nematodos endoparásitos (^{Lax et al., 2011}; ^{Herrera-Parra et al., 2014}; ^{Tchabi et al., 2019}), está asociado con la competencia que se establece entre organismos por fuentes de carbono, espacios y sitios de infección, ya que se trata de organismos con las mismas necesidades fisiológicas y luchan por establecerse en el mismo sitio donde obtienen recursos para su alimentación (^{Vos et al., 2014}; ^{Schouteden et al., 2015}). También está relacionado con la producción de exudados radicales, como fenoles, flavonoides y ácidos orgánicos (^{Hage-Ahmed et al., 2013}); que desorientan al J₂ del nematodo e impiden su penetración y permiten la simbiosis funcional entre plantas y AMF, lo que permite la activación del sistema de defensa de los hospederos (^{Cervantes-Gámez et al., 2015}). Esta acción prepara a la planta y permite una respuesta de defensa también contra patógenos foliares (^{Pérez-Ortega et al., 2015}, ^{Reyes-Tena et al., 2016}).

Efecto de AMF en el crecimiento de C. annuum

La disminución de los daños en las raíces y reducción de la reproducción del nematodo por los AMF favoreció el crecimiento de las plantas. En las plantas control el crecimiento fue significativamente menor (p ≤ 0.01) que en las plantas tratadas con los AMF y el nematicida.

Las plantas con mayor altura fueron las inoculadas con F. geosporum y C. claroideum, estos tratamientos presentaron el mismo efecto que el nematicida y registraron plantas un 75 % más altas que las del control (Tabla 3). Reportes similares mostraron incrementos de altura de plantas de C. annuum cv. Cacho de Cabra con la inoculación de C. claroideum (^{Castillo et al., 2009}) y en los cultivares Jalapeño, Serrano y De árbol, con la inoculación de Glomus spp. y R. intraradices favorecieron significativamente el crecimiento en altura, en relación a las plantas control (^{González-Mendoza et al., 2015}). La interacción funcional entre los AMF y las plantas incrementan la producción de giberelinas y citocinas (^{Alonso-Contreras et al., 2013}; ^{Pereira et al., 2016}), reducen el estrés abiótico y los daños por el nematodo (^{Baum et al., 2015}). Factores que favorecen el crecimiento de las plantas aun parasitadas por estos fitoparásitos.

El mayor número de botón floral se presentó en las plantas inoculadas con los AMF y el nematicida, en promedio oscilaron de 8 ± 0.78 a 11 ± 0.87, las plantas control no emitieron botones florales (Tabla 3). Esta respuesta se asoció a la capacidad que tienen los AMF para translocar nutrimentos como N, P, K, Ca, Cu, Mg, Zn, Fe (^{Nana et al., 2015}; ^{He et al., 2017}) lo que favorece mejor nutrición, crecimiento y emisión de botones florares, e.g. estudios con G. caledonium y R. intraradices en C. annuum promovieron mayor emisión de flores, asociado con mejores contenidos de P y Zn (^{Ortas et al., 2011}). En especies como Heliconia stricta, la inoculación la de Rhizophagus intraradices y la cepa Zac 29 aumentaron el número de brotes y flores, mejoraron el estado nutricional y la actividad fotosintética (^{Uc-Ku et al., 2019}).

Se registró un incremento significativo (p ≤ 0.01) de biomasa aérea seca con el nematicida (2.69 ± 0.45 g) y F. geosporum (2.20 ± 0.30 g), con el resto de los AMF se registraron incrementos superiores al control de hasta un 95 % (Tabla 3). Esta respuesta se ha observado en cultivos inoculados con AMF (^{González-Mendoza et al., 2015}; ^{Zayed et al., 2017}; ^{Uc-Ku et al., 2019}) en los que se reportan cambios de la actividad fotosintética para favorecer la fijación de CO₂, la eficiencia de captación y translocación de P, lo que se refleja en mayor crecimiento, expansión foliar y producción de biomasa.

Con C. claroideum y G. ambisporum las plantas tuvieron un 21 % de raíces más largas que las tratadas con el nematicida y un 75 % que las del control. Las raíces con mayor peso fresco (p ≤ 0.01) se lograron con el nematicida (5.86 ± 1.80) y con F. geosporum (5.03 ± 1.53). Con el resto de los AMF se incrementó hasta un 88 % en relación a las plantas control. El mayor volumen de raíces se estimó con el nematicida (8.70 ± 1.56 cm³) y un incremento significativo (95 %) en tamaño de las raíces con la incorporación de los AMF en relación a las del control (Tabla 3). El mayor porcentaje de colonización micorrízica se estimó con G. ambisporum (68.83 %). Con C. claroideum y F. geosporum las raíces tuvieron un 42.98 %. Las plantas tratadas con el nematicida y las del control presentaron un 6.36 % de colonización, que pudo deberse a esporas introducidas por las corrientes de aire.

Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que con especies nativas de AMF como recurso biológico, puede emplearse para disminuir el estrés biótico que inducen patógenos de raíz como M. incognita y favorecer el crecimiento de C. annuum en las condiciones de estudio evaluadas.