Materiales y métodos

El inóculo de HMA (Rizofermic), fue provisto por el Laboratorio de Organismos Benéficos de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Veracruzana. Este inóculo es un consorcio formado por 12 especies de HMA: Acaulospora morrowiae, A. spinosa, A. scrobiculata, Gigaspora rosea, G. decipiens, Scutellospora pellucida, Glomus macrocarpum, G. aggregatum, Funneliformis mosseae, F. geosporus, Rhizophagus intraradices, Claroideoglomus etunicatum.

Se empleó una cepa de hongo solubilizador de fosfato Penicillium brevicompactum, que se obtuvo del Laboratorio de Micromicetos del INECOL A. C. Este hongo fue aislado de suelo de cafetales del estado de Veracruz y fue seleccionada por su alta capacidad fosfato solubilizadora en estudios previos (^{Perea-Rojas 2013}). La cepa del HSF se reactivó en medio de cultivo sólido Papa Dextrosa Agar (PDA), en placas de Petri de 90 × 110 mm y se incubó a 25 °C por 15 días en la oscuridad. Una vez activada se pasó a medio de cultivo Extracto de Malta Agar (EMA) para buscar una mayor esporulación. Transcurridos 15 días se obtuvo una suspensión de esporas que se llevó posteriormente a conteo en cámara de Neubauer bajo un microscopio compuesto (Nikon ECLIPSE 80i) para ajustarla a una concentración de 1 × 10⁸ UFC/mL, tal como lo propone (^{Souchie et al. 2010}).

En cada ciclo se germinaron semillas de C. ensiformis en charolas plásticas con arena estéril durante 7 días. Las semillas de C. ensiformis, fueron proporcionadas por la empresa Leguminutre. Una vez germinadas las plántulas se trasplantaron a macetas de 1,5 Kg con suelo estéril y tepezil (1:1 v/v). Al momento del trasplante se inocularon los HMA (10 gr/planta) directamente a la raíz. Luego de 10 días se inoculó el HSF a las raíces de las plantas a una concentración de 1 × 10⁸ UFC/mL (3 mL).

Posterior a la inoculación, las plantas permanecieron 30 días en el invernadero con riego manual cada tercer día, trascurrido el tiempo se cosecharon, pesaron y tomaron muestras de raíces. Se reincorporó la biomasa a las macetas y se dejaron 45 días manteniendo la humedad del sustrato para favorecer el proceso de mineralización. Esta metodología se repitió durante tres ciclos consecutivos; cada ciclo duró tres meses e incluyó la siembra, cosecha y el tiempo de descomposición de la biomasa; en total el ensayo duro 9 meses.

Evaluación de la colonización micorrízica. Para evaluar el porcentaje de micorrización, las raíces se tiñeron siguiendo la técnica de clareo y tinción de ^{Phillips & Hayman (1970)} y se estimó el porcentaje de colonización micorrízica, de acuerdo con el método de ^{Giovannetti & Mosse (1980)}.

Determinación del fósforo soluble en el suelo. Una vez secas y tamizadas las muestras de suelo, se tomaron 2.5 g y se siguió la técnica de cuantificación de fósforo soluble de ^{Bray & Kurtz (1945)}. Se midieron las reacciones colorimétricas en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 882 nm (Thermo Scientific GENESYS 10S UV-UVS).

Medición de variables de crecimiento (altura, número de hojas y número de nódulos). La altura de las plantas se midió con una regla métrica y se expresó en cm. Se realizó un conteo del número de hojas y número de nódulos por planta en el momento de la cosecha.

Diseño experimental y análisis estadístico. El ensayo se realizó bajo un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial 2 × 4; una planta cobertera: C. ensiformis; dos factores (tiempo; interacción entre HMA y HSF), y 4 tratamientos: 1) HMA; 2) HSF; 3) HMA + HSF; y 4) Control (sin hongos). Se realizaron tres repeticiones de cada tratamiento; el ensayo tuvo un tiempo de duración de 276 días. Dado que los datos cumplían con el supuesto de normalidad (Shapiro Wilk) y homogeneidad de varianza (Bartlett)se sometieron a un ANOVA Factorial (α = 0.05; intervalo de confianza 95 %) y se les realizó una prueba post hoc de Tukey (α = 0.05). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa STATISTICA versión 10 para Windows.

Resultados

Colonización micorrízica. El factor tiempo influyó de manera significativa sobre la colonización micorrízica (%) en los tres ciclos analizados (tiempo: ciclo 1, 2, 3) (F = 144.3821; p < 0.05); así mismo el efecto de la interacción de HMA y HSF influyó de manera significativa (F = 59.5884; p < 0.05). En relación con la colonización, se encontraron los siguientes rangos: 6.6-22.8 % en el primer ciclo, 52.3-89.1 % en el segundo y 64-85.7 % en el tercero. La micorrización en el segundo y tercer ciclo fue mayor con respecto al primero, mostrando diferencias significativas (Tukey < 0.05). Para los tres ciclos la micorrización fue significativamente mayor en las plantas inoculadas con el tratamiento HMA+HSF que en las inoculadas con el tratamiento de HMA (Tukey < 0.05) (Figura 1). El rango de colonización micorrízica en las plantas inoculadas con el tratamiento HMA osciló entre 6.6 % (primer ciclo) a 64 % (tercer ciclo) con el tratamiento HMA+HSF. La colonización micorrízica se detectó mediante la presencia de estructuras fúngicas tales como arbúsculos y vesículas (Figura 2).

Fósforo soluble en el suelo. El factor tiempo mostró un efecto significativo sobre el contenido de fósforo soluble en el suelo (F = 13.2947; p < 0.05); el efecto de la interacción de HMA y HSF no influyó de manera significativa (F = 0.7498; p = n.s), pero sí influyeron significativamente el factor HMA (F = 115.9084; p < 0.05) y el factor HSF (F = 135.5201; p < 0.05). En el primer ciclo, no se detectaron diferencias significativas en el contenido de fósforo entre las plantas inoculadas con los tratamientos HMA, HSF, HMA+HSF (Tukey = n.s), sin embargo, los valores fueron significativamente mayores que en las plantas con el tratamiento Control (Tukey < 0.05). En el segundo y tercer ciclo las plantas inoculadas con el tratamiento HMA+HSF presentaron un mayor contenido de fósforo disponible (Tukey < 0.05) que con el tratamiento HMA, HSF y Control. En ambos ciclos, las diferencias entre las plantas inoculadas con los tratamientos HMA y HSF no fueron significativas (Tukey = n.s), sin embargo, sí lo fueron con respecto al Control (Tukey < 0.05) (Figura 3).

Variables de crecimiento de las plantas. Altura de las plantas: La altura de las plantas varió de manera significativa ante el factor tiempo (F = 376.0556; p < 0.05). Se detectó un efecto significativo de la interacción de HMA y HSF (F = 210.8651; p < 0.05); así mismo del factor HMA (F = 112.3889; p < 0.05) y el factor HSF (F = 124.0079; p < 0.05). En cada ciclo, se detectaron diferencias significativas entre las plantas inoculadas con los tratamientos HMA; HSF; HMA+HSF respecto al Control (Tukey < 0.05). El rango de altura osciló entre 15.7 cm (Control/primer ciclo) a 64 cm (HSF/segundo ciclo). En el primer y tercer ciclo las plantas con la mayor altura fueron las inoculadas con los tratamientos HMA y HMA+HSF sin existir diferencias significativas entre ellas (Tukey = n.s), pero sí con las plantas inoculadas con los tratamientos HSF y Control (Tukey < 0.05). En el segundo ciclo, la altura de las plantas inoculadas con el tratamiento HSF fue significativamente mayor que las inoculadas con los tratamientos HMA, HMA+HSF y el Control (Tukey < 0.05) (Figura 4).

Número de hojas.- Tanto el factor tiempo como la interacción de HMA y HSF influyeron de manera significativa sobre el número de hojas en los tres ciclos analizados (tiempo: ciclo 1, 2, 3) (tiempo: F = 26.8776; p < 0.05; interacción: F = 10.7959; p < 0.05). Así mismo influyeron significativamente los factores HMA (F = 4.5918; p < 0.05) y HSF (F = 10.7959; p < 0.05). El número de hojas varió desde 6 (Control/primer ciclo) hasta 14 (HSF/segundo ciclo). En el primer ciclo no se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos (HMA; HSF; HMA+HSF; Control) (Tukey = n.s). En el segundo ciclo las plantas inoculadas con el tratamiento HSF mostraron mayor número de hojas que con el resto de los tratamientos (Tukey < 0.05). En el tercer ciclo, el número de hojas de las plantas inoculadas con los tratamientos HMA y HMA+HSF, fue significativamente mayor que con las inoculadas con los tratamientos HSF y Control (Tukey < 0.05) (Figura 5).

Número de nódulos: No se detectó un efecto significativo entre la interacción de HMA y HSF (F = 0.6585; p = n.s). Sin embargo, se detectó un efecto significativo del factor HMA (F = 19.5203; p < 0.05) y del factor HSF (F = 139.5203; p < 0.05). El rango del número de nódulos osciló entre 46 (HMA) y 76 (HSF). El número de nódulos fue significativamente mayor en las plantas inoculadas con los tratamientos HSF y HMA+HSF, respecto a las inoculadas con los tratamientos HMA y Control (Tukey < 0.05) (Figura 6).

Discusión

Existen pocos estudios sobre los beneficios que brinda la co-inoculación de HMA y HSF a las plantas (^{Velázquez et al. 2005}, ^{Zaidi & Khan 2006}, ^{Souchie et al. 2006}, ^{Babu & Reddy 2011}, ^{Rodrigues-Cabral et al. 2012}, ^{Castillo et al. 2013}, ^{Ramírez-Gil et al. 2013}, ^{Serna 2013}, ^{Saxena et al. 2015}, ^{Velázquez et al. 2017}, ^{Perea-Rojas et al. 2019}). Específicamente para la planta cobertera C. ensiformis, no se encontraron trabajos relacionados con este tema de la co-inoculación de HMA y HSF; de manera que este estudio representa el primer reporte a nivel mundial donde se evalúa el efecto de la interacción HMA y HSF sobre la colonización micorrízica, P soluble en el suelo, altura, número de hojas, número de nódulos en plantas de C. ensiformis.

De acuerdo a las categorías establecidas por ^{Kormanik & McGraw (1982)}, donde se definen 5 grados de colonización micorrízica: nula (0 %), baja (1-25 %), moderada (26-50 %), alta (51-75 %) y muy alta (76-100 %), de acuerdo a esta escala en este trabajo la colonización micorrízica fue de baja a moderada para el primer ciclo y alta a muy alta en el segundo y tercer ciclo. Por lo que se puede inferir que la especie C. ensiformis es altamente micotrófica.

En comparación con otros estudios en los que se evaluó la colonización micorrízica en plantas de C. ensiformis inoculadas exclusivamente con HMA; los valores aquí expuestos resultaron superiores a los informados por ^{Martín et al. (2007)}, quienes detectaron un 84.61 % de colonización micorrízica, ^{Martín et al. (2009)} 62.69-43.13 %, ^{Martín-Alonso et al. (2012)} 52.5-58.75 %, ^{Martín-Alonso et al. (2013)} 70 %, ^{García-Rubido et al. (2017)} 58.45 %. En otros trabajos de inoculaciones de HMA en otras especies de plantas coberteras señalan rangos inferiores (^{Njeru et al. 2014} de 32.5-43.4 %) a los resultados aquí expuestos. Sin embargo, ^{Caldera et al. (2013)} presentaron valores de colonización similares en la especie Vigna unguiculata (82-85.25 %).

Durante el tiempo de evaluación del ensayo la colonización micorrízica fue mayor en las plantas inoculadas con la interacción de los hongos micorrízicos y el hongo solubilizador (HMA+HSF). Por lo que se puede aseverar que la cepa de hongo solubilizador P. brevicompactum utilizada en este trabajo incrementó un 36.8 % la colonización micorrízica en C. ensiformis, probablemente se estableció una interacción de sinergismo entre estos grupos de hongos que favoreció la micorrización. A la fecha existen pocos estudios de interacciones de HMA y HSF con efectos sinérgicos; ^{Velázquez et al. (2017)} en lechuga indicaron incrementos del 30 % con inoculación Rhizophagus intraradices y Penicillium thomii. ^{Velázquez et al. (2005)}, en plantas de tomate informaron incrementos del 13 % al utilizar Glomus mosseae y Aspergillus niger. Resultados con efectos antagónicos fueron descritos en plantas de maíz y lechuga (^{McAllister et al. 1995}), con efectos neutros en frijol caupí (^{Ramírez-Gil et al. 2013}), en café (^{Perea-Rojas et al. 2019}) y en jitomate (^{Arias et al. 2019}). Cabe señalar que en estos últimos utilizaron el mismo consorcio de HMA y la cepa P. brevicompactum. La respuesta de las plantas a la inoculación depende de las compatibilidades funcionales en la fisiología y en la bioquímica de la interacción, entre los componentes microbianos; así arroja diferentes respuestas, dependiendo de la combinación de los microorganismos (^{Vázquez et al. 2000}).

Los hongos micorrízicos arbusculares se caracterizan por la formación de arbúsculos y con excepción de los géneros Gigaspora y Scutellospora la formación de vesículas (^{Peterson et al. 2004}). En los resultados de este trabajo, sólo en el primer ciclo fue evidente la presencia de arbúsculos, mientras que en los tres ciclos se observaron vesículas. Esto corrobora lo planteado por ^{Alarcón & Ferrera-Cerrato (2000)}, quienes mencionaron que a pesar de que los arbúsculos son estructuras características de los HMA, estos no perduran en el tiempo y sólo se mantienen por unas 2 semanas. Después de este periodo, se observa la formación de un septo en la hifa del arbúsculo y la estructura se colapsa, luego son degradados completamente y las células de la planta regresan a su fisiología normal (^{Camarena-Gutiérrez 2012}). En cuanto a las vesículas, según ^{Aguilera-Gómez et al. (2007)}, algunos géneros de estos hongos las forman, están compuestas principalmente por lípidos, siempre están presentes intercelularmente en la corteza de la raíz y son reservorios de nutrimentos para el hongo.

Para el establecimiento de este experimento se utilizó suelo deficiente en P soluble (0.28 mg/Kg); después de cuatro meses de inoculadas la plantas con los hongos, el contenido de P fue de 3.35 mg/Kg. Es decir, la interacción entre hongos micorrízicos y el solubilizador favoreció un incremento de 3.07 mg/Kg de P soluble en el suelo de las plantas. Por lo que los resultados son prometedores y la co-inoculación de estos dos grupos de hongos puede ser una alternativa para aumentar la disponibilidad de este elemento, que generalmente se encuentra atrapado por iones metálicos de Ca, Al y Fe.

^{Babu & Reddy (2011)}, presentaron incrementos similares (3.1 mg/Kg) en plantas de bambú inoculadas con Aspergillus tubingensis y un consorcio de HMA. El incremento de P soluble en el suelo en este trabajo fue superior al obtenido por ^{Perea-Rojas et al. (2019)}, en plantas de café (2.93 mg/Kg) con la inoculación del mismo consorcio de HMA y la misma cepa de P. brevicompactum, sin embargo, en ese estudio con la interacción de los HSF hubo un incremento de 4.9 mg/Kg. De manera similar a la colonización micorrízica, en esta variable existe una respuesta diferencial de las especies de plantas ante las interacciones de los microorganismos (^{Vázquez et al. 2000}).

El beneficio que ofrece el uso del HSF solo y en interacción con HMA fue notorio en los resultados obtenidos para las variables de crecimiento de las plantas de C. ensiformis (altura y número de hojas). Debido a que no existen antecedentes de co-inoculaciones de HMA y HSF en C. ensiformis, sólo se pueden comparar con estudios de co-inoculaciones en otras especies de leguminosas. ^{Jagandi et al. (2017)}, en plantas de chícharo inoculadas con una bacteria solubilizadora de fósforo (Bacillus polymyxa) y un HMA (Rhizophagus fasciculatus) indicaron incrementos en la altura de 33.4 cm. ^{Ramírez-Gil et al. (2013)}, en plantas de frijol caupí inoculadas con un HSF (Mortierella sp.) y un HMA (Glomus fasciculatum) presentaron en sus resultados un aumento de 14 cm en la altura. En este trabajo se obtuvieron incrementos de altura de 29 cm en las plantas co-inoculadas con la interacción de HMA y HSF, además de 48.3 cm en las inoculadas con el hongo fosfato-solubilizador. Estos resultados son superiores a los de los estudios anteriormente referidos.

Existen estudios que evidencian que C. ensiformis tiene una alta capacidad para fijar nitrógeno atmosférico en asociación simbiótica con las bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium (^{Quiroga-Madrigal et al. 2006}). En este trabajo realizado a nivel de invernadero, la formación de nódulos se vio favorecida por la presencia de HSF (76/planta) y de la interacción de HMA y HSF (69/planta). ^{Pommeresche & Hansen (2017)}, plantean que independientemente de la especie de leguminosa, si se encuentran aproximadamente 15 nódulos las bacterias fijadoras de nitrógeno están funcionando bien, si la cantidad de nódulos excede 100 por planta la nodulación es satisfactoria. Por lo que se puede inferir que en este estudio la nodulación tuvo un nivel satisfactorio; es probable que el alto contenido de P solubilizado por el hongo solubilizador favoreció la formación de nódulos. ^{Pommeresche & Hansen (2017)}, afirman que los factores que obstaculizan la fotosíntesis en plantas, como el estrés hídrico y la falta de otros nutrientes, también reducirá la fijación biológica de nitrógeno.

En el suelo los microorganismos (bacterias, hongos y otros) establecen interacciones, lo que es esencial para garantizar los ciclos de los nutrientes y los procesos de descomposición de la materia orgánica en cualquier ecosistema terrestre debido a los procesos biológicos como la oxidación, la reducción y la mineralización (^{Vandenkoornhuyse et al. 2015}). Tales interacciones han demostrado su contribución al crecimiento de las plantas y a la calidad de los suelos; por lo tanto, constituyen aspectos críticos que deberán ser considerados en el desarrollo de una agricultura sostenible y buen funcionamiento del ecosistema (^{Pedraza et al. 2010}).

El uso de coberteras como C. ensiformis inoculada con HMA y un HSF, dado que es una especie altamente micotrófica y con un alto grado de especificidad con las bacterias fijadoras de nitrógeno simbióticas tiene gran potencial para ser utilizada en agricultura actual, pues conlleva al mejoramiento de los suelos en cuanto al contenido nutricional aportando nitrógeno al suelo y cultivos acompañantes a través de la liberación directa de nitrógeno amoniacal, la senescencia de los nódulos y la descomposición de la planta al finalizar su clico de vida (^{Dubach & Ruselle, 1994}). Se recomienda continuar estudiando el efecto de la interacción de estos grupos de hongos en esta especie y en otras leguminosas, que sean utilizadas como abonos verdes.