Materiales y métodos

Especies de estudio. Salvia assurgens es una hierba perenne de 20 a 50 cm de altura, endémica de México que florece de mayo a noviembre (^{Cornejo-Tenorio & Ibarra-Manríquez 2011}). Habita en bosques de encino y de pino-encino, entre los 2,100 y 2,650 m snm. Presenta inflorescencias terminales de 12 a 17 cm de largo, con 5-10 verticilastros y cada uno con 4-10 flores. Sus flores son blancas, de 6-8 mm de largo (Figura 1A). La distribución de las poblaciones de S. assurgens está restringida a la porción noroeste del Cinturón Volcánico Transmexicano y principalmente en el estado de Michoacán (^{González-Gallegos & Lopéz-Enríquez 2016}).

Figura 1 Flores de Salvia assurgens (A) y de Salvia madrigalii (B). 

Salvia madrigalii es una especie recientemente descrita (^{Zamudio & Bedolla-García 2017}), micro endémica del estado de Michoacán y que florece de octubre a diciembre. Se distribuye en bosques de pino-encino perturbados y en la transición de éste con el bosque tropical caducifolio entre los 1,600 y 1,700 m snm (^{Zamudio & Bedolla-García 2017}). Es un arbusto de 1 a 2 m de altura con inflorescencias en racimos terminales y axilares de 6 a 13 cm de largo, con dos flores por verticilo. Sus flores son blancas, con un tubo más o menos cilíndrico de 24-35 × 5-9 mm, el labio superior marcadamente galeado de 11 × 17 mm y labio inferior de 10-15 mm de largo (Figura 1B).

Sitio de estudio. El trabajo de campo se realizó de mayo a diciembre del 2019, durante el pico de floración de cada especie. La población de Salvia assurgens (150 a 200 individuos) se localiza al sureste de Morelia, Michoacán a dos kilómetros de la localidad de San Miguel del Monte (19° 36’ 2’’ N; 101° 07’26’’ O) a una altitud de 2,140 m snm. La zona se caracteriza por una vegetación de bosque de pino. La población de Salvia madrigalii (40 a 60 individuos) se localizó al sureste de Morelia, Michoacán, en la comunidad de Tumbisca (19° 34’ 50’’ N, 101° 04’ 29’’ O), a una altitud de 1,705 m snm. El sitio se ubica en la vertiente orientada hacia el pacífico del Cinturón Volcánico Transmexicano y se caracteriza por ser una zona de transición entre el bosque de pino-encino y bosque tropical caducifolio.

Colecta y análisis del aroma floral. Para la colecta de volátiles florales se seleccionaron en total 11 parches de la población de S. assurgens y 12 plantas de la población de S. madrigalii. Debido a la complejidad para realizar la extracción de volátiles en campo, en cada parche o planta de ambas especies se cortaron ramas con inflorescencias e inmediatamente se colocaron en agua, y se trasladaron al laboratorio. Después de una hora de haber hecho el corte de las ramas se realizó la colecta de volátiles de acuerdo a ^{Gervasi & Schiestl (2017)} con modificaciones. Las inflorescencias de 8-15 flores se aislaron en un frasco de vidrio de borosilicato y fueron selladas con una placa de teflón. Los volátiles se capturaron en una trampa absorbente con 150 mg de Porapak Q (malla/tamaño 50/80, Supelco, USA), usando una bomba de vacío a un flujo de 200 mL/min. La extracción se realizó de 9:00 h a 13:00 h (5 horas), este periodo de tiempo corresponde al pico de actividad de los visitantes florales (L. Ramírez observación personal). Como control se extrajeron los volátiles de cinco muestras de frascos vacíos para descartar posibles contaminantes y fueron analizadas en las mismas condiciones cromatográficas. Los compuestos encontrados en las muestras control se descartaron de las muestras del aroma floral. Las trampas fueron eluidas con 2 mL de hexano grado HPLC y después se concentraron a 50 µL con una corriente suave de nitrógeno gaseosos. Se realizaron inyecciones de 3µL y se analizaron en un cromatógrafo de gases (Agilent 6890) acoplado a espectrometría de masas (Agilent 5973N), usando inyecciones splitless a 240 °C, en una columna Equity TM-5 (Supelco 28089-U, 30 m 0.25 mm, 0.25 µm). Se usó helio como gas acarreador a un flujo de 1mL/min^-1. Las condiciones de análisis se realizaron de acuerdo a ^{Kantsa et al. (2017)}. La temperatura inicial del horno fue de 40 °C durante 3 min, seguido por un gradiente de temperatura de 10 a 250 °C durante 5 min. Para identificar los compuestos volátiles se usó la librería espectral de masas del Instituto Nacional de Estándar y Tecnología (NIST 11) y comparando los índices de retención Kovats calculado (mezcla de alcanos C8-C20, Sigma Aldrich, MO, USA) con los índices reportados por ^{Adams (2007)} y ^{El-Sayed (2023)}. Algunos compuestos se verificaron usando estándares sintéticos (Sigma Aldrich, MO, USA). La concentración de los compuestos se calculó usando el área bajo la curva del pico de cada compuesto y la suma de las áreas de todos los picos de cada muestra se consideró como el 100 %.

Producción de néctar y morfología floral. Para medir el volumen de néctar en S. madrigalii se embolsaron 4 botones florales por planta de un total de cuatro plantas por día. Después de la antesis floral se midió el volumen de néctar de cada flor con un microcapilar de 5 µl durante tres días consecutivos utilizando las mismas flores (N = 48). A pesar de que las flores duran abiertas entre 4 y 5 días, no fue posible estimar el néctar en flores del cuarto o quinto día, pues eran muy frágiles y se desprendían fácilmente. En las flores antes señaladas, se estimó la concentración de azúcares utilizando un refractómetro manual ATAGO (Master-53M, Japón) con un rango de 0-40º Brix (equivalente al número de gramos de soluto por gramos de solución). En S. assurgens, no fue posible estimar el volumen debido a la poca cantidad de néctar en sus flores. Para la medición de las características florales se consideró el largo del tubo floral y el ancho del labio inferior, ya que estas características son las más importantes de acuerdo al síndrome de polinización de cada especie (^{Wester et al. 2020}). De cada individuo se seleccionaron al menos tres flores (S. madrigalii N = 109; S. assurgens N = 42) y las mediciones (cm) se realizaron con un vernier digital (Stainless Hardened).

Observación de visitantes florales. En ambas especies se hicieron observaciones con cámaras de video (Sony Handycam DCR-SR20) y observaciones directas de 7:00 h a 13:00 h en días soleados. En S. assurgens se registró un total de 12 h y en S. madrigalii un total de 28 h. Se registró tanto el número de flores observadas, como el de flores visitadas y la identidad del polinizador para calcular la tasa de visita de cada especie por hora. Algunos visitantes florales (únicamente insectos) fueron capturados con una red entomológica y la identificación se realizó con claves para cada grupo taxonómico. Los especímenes fueron depositados en el laboratorio de Biología de la polinización de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. La identificación de los visitantes florales fue corroborada por especialistas de los diferentes grupos taxonómicos.

Análisis estadísticos. Para analizar las diferencias de la tasa de visitas entre S. assurgens y S. madrigalii, realizamos un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguida de una prueba Tukey (HDS) para comparar si los promedios difieren significativamente usando el programa JMP ver. 9.0 (SAS Institute, Tokio, Japón). Para explorar las diferencias del tamaño del tubo floral y el ancho del labio inferior entre especies realizamos un ANOVA de una vía, seguido de una prueba Tukey. El volumen y la concentración del néctar se evaluó por medio de una ANOVA donde se comparó si el promedio de dichas variables difería entre los tres días. Para analizar la disimilitud de los aromas florales entre especies, realizamos un análisis de escalamiento multidimensional no métrico (NMDS por sus siglas en inglés), utilizando la función meta MDS en el paquete “vegan” (^{Oksanen et al. 2013}). Calculamos la proporción relativa de todos los compuestos emitidos por cada especie, transformamos y estandarizamos los datos con la raíz cuadrada utilizando una doble estandarización de Wisconsin para evitar que el NMDS se vea influenciado por los compuestos más abundantes. Se calculó una matriz de distancias por pares utilizando el índice de distancias de Bray-Curtis. Para probar si el patrón de agrupamiento observado era significativo, implementamos la prueba PERMANOVA con 999 permutaciones aleatorias utilizando la función “adonis” en el paquete “vegan”. Para explorar la correlación entre los compuestos volátiles florales (composición y abundancia relativa de los CVOs) y la tasa de visitas de visitantes florales, realizamos un análisis de correspondencia canónica (ACC) usando el software PAST, y la significancia del análisis se determinó usando 999 permutaciones de Monte Carlo. Antes del análisis, los datos de CVOs se transformaron con el arcoseno y los datos de la tasa de visita se transformaron con la raíz cuadrada para obtener una distribución normal de los datos.

Resultados

Aroma floral. En S. assurgens (visitada por insectos), contrario a lo que esperábamos encontramos un menor número de COVs florales (11 compuestos) comparada con S. madrigalii (visitada por colibríes), donde se identificaron 16 COVs. En el aroma floral de S. assurgens encontramos compuestos que incluyen bencenoides y terpenoides, siendo el 1,4-diclorobenceno el compuesto más abundante con aproximadamente el 78 % del aroma total (Tabla 1). En S. madrigalii encontramos terpenoides y bencenoides. El terpenoide humuleno fue el más abundante con aproximadamente 27 % del aroma total, seguido del compuesto m-etilacetofenona del grupo de los bencenoides con aproximadamente el 15 % del aroma total. Salvia assurgens y S. madrigalii emiten en común siete compuestos volátiles florales y también compuestos exclusivos de cada especie (Tabla 1). El análisis NMDS mostró que los compuestos volátiles florales difieren entre S. assurgens y S. madrigalii (stress = 0.047). Este resultado fue confirmado por la prueba de PERMANOVA, la cual mostró que el aroma floral difiere significativamente entre S. assurgens y S. madrigalii (F = 48.002, P < 0.001). Los individuos de S. assurgens se agruparon principalmente en el eje 1 negativo del NMDS y los individuos de S. madridalii se agruparon en el eje 1 positivo del NMDS. De los 20 compuestos volátiles, 18 contribuyeron significativamente con la ordenación del NMDS (Figura 2).

Figura 2 Análisis de escalamiento multidimensional no paramétrico (NMDS, por sus siglas en inglés) de los compuestos volátiles florales de Salvia assurgens y S. madrigalii, basado en la distancia Bray-Curtis, usando la abundancia relativa del aroma floral. Únicamente se muestran los vectores con P < 0.05. 

Visitantes florales. En Salvia assurgens se observaron en total 1,512 flores de las cuales 523 fueron visitadas. Se registraron cuatro especies de visitantes florales, la mariposa Thorybes dorantes Stoll 1790, Bombus ephippiatus Say, Xylocopa tabaniformis azteca Cresson, y una mosca de la familia Tachinidae (Figura 3). La tasa de visita (hr/flor) más alta fue de Thorybes dorantes (0.371 ± 0.15), seguida de Bombus ephippiatus (0.194 ± 0.08), Xylocopa tabaniformis azteca (0.119 ± 0.04) y la mosca de la familia Tachinidae (0.026 ± 0.013). En Salvia madrigalii se observaron en total 1674 flores, de las cuales 784 fueron visitadas. El colibrí Amazilia beryllina fue el único visitante floral de S. madrigalii (Figura 4) con una tasa de visita de 0.574 ± 0.105. En S. assurgens la tasa de visitas fue más alta (0.744 ± 0.18) comparada con la de S. madrigalii (0.574 ± 0.105) sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (F _1,80 = 0.674, P = 0.41).

Figura 3 Visitantes florales de Salvia assurgens. (A) Thorybes dorantes, (B) Bombus ephippiatus, (C) Xylocopa tabaniformis azteca, (D) Mosca de la familia Tachinidae. 

Figura 4 Amazilia beryllina, el único visitante floral observado en Salvia madrigalii. 

El ACC mostró que los volátiles florales (composición y abundancia relativa) y la tasa de visita se correlacionaron significativamente (rastro = 0.738, P = 0.001). El eje 1 explica el 81.8 % y el eje 2 el 15.7 %, ambos explican el 97.5 % de la variación total. El CCA (Figura 5) muestra que la tasa de visitas de A. beryllina se correlacionó con los volátiles del grupo de los sesquiterpenos, los cuales son exclusivos de las flores de S. madrigalii. Los visitantes florales de S. assurgens (Bombus ephippiatus, Thorybes dorantes, Xylocopa tabaniformis azteca, Tachinidae) se correlacionaron con monoterpenos, 1,4-diclorobenceno, alcohol feniletílico y 2-fenoxietanol (Figura 5).

Figura 5 Análisis de correspondencia canónica (ACC) que muestra la correlación entre la tasa de visita de los visitantes y los volátiles florales de Salvia assurgens y S. madrigalii. Los círculos azules representan los volátiles florales de S. assurgens y S. madrigalii y los vectores (líneas verdes) representan a los visitantes florales. 

Producción de néctar y morfología floral. En S. assurgens, el largo del tubo floral fue más corto (1.84 ± 0.039) comparado con el de S. madrigalii (4.67 ± 0.055) de manera significativa (F_{1, 149} = 2347.4, P < 0.0001), mientras que el ancho del labio inferior fue más grande en S. assurgens (0.608 ± 0.45) comparado con S. madrigalii (0.396 ± 0.06; F_1,149 = 46.38.201, P < 0.0001). En S. madrigalii tanto el volumen de néctar como su concentración disminuyeron conforme el día de vida de las flores. El volumen de néctar fue de 2.8 ± 0.7; 2.44 ± 0.8 y 1.8 ± 1 µL en flores del primer al tercer día respectivamente y la concentración disminuyó de 28 ± 1.1; 20.5 ± 1.7 a 18. 5 ± 1.4º Brix en flores del primer al tercer día respectivamente.

Discusión

Nuestros resultados muestran que el perfil químico del aroma floral de Salvia assurgens y S. madrigalii difiere significativamente, además de que cada especie atrae a visitantes florales particulares. Salvia madrigalii fue visitada exclusivamente por el colibri Amazilia beryllina, lo que constituye el primer reporte de los visitantes florales de esta especie en poblaciones naturales y difiere del colibrí reportado para la especie en cultivo (Cynanthus latirostris). Salvia assurgens fue visitada por insectos, siendo la mariposa Thorybes dorantes el principal visitante floral. Contrario a lo que esperábamos las flores de S. madrigalii emitieron un mayor número de COVs comparada con S. assurgens (16 y 11 compuestos respectivamente). De acuerdo al ACC la tasa de visita de los visitantes florales se correlacionó de manera significativa con la composición y abundancia relativa de los volátiles florales.

Salvia assurgens y S. madrigalii emiten algunos COVs florales en común y otros son exclusivos de cada especie (Tabla 1). Todos los compuestos volátiles encontrados en ambas especies son reportados comúnmente como COVs florales en varias especies de angiospermas (^{Knudsen et al. 2006}). Algunos estudios sugieren que la variación en los COVs florales se atribuye a los polinizadores como principal fuerza selectiva (^{Parachnowitsch et al. 2012}, ^{Farré-Armengol et al. 2015}, ^{Gervasi & Schiestl 2017}, ^{Chapurlat et al. 2019}). Por ejemplo, especies lejanamente emparentadas convergen en los CVOs florales cuando comparten el mismo grupo de polinizadores (^{Knudsen & Tollsten 1995}, ^{Andersson et al. 2002}) o pueden divergir entre poblaciones de la misma especie si interactúan con diferentes comunidades de polinizadores (^{Hetherington-Rauth & Ramírez 2016}, ^{Weber et al. 2018}). En este sentido, a pesar de que S. assurgens y S. madrigalii son del mismo género, difieren significativamente en el perfil químico de COVs florales (Figura 2), además de que estas especies no comparten visitantes florales. Desafortunadamente desconocemos qué tan cercanas filogenéticamente son estas dos especies, pues no se han incluido en las recientes filogenias del subgénero Callosphacea (^{Fragoso-Martínez et al. 2018}).

Generalmente es aceptado que las especies polinizadas por insectos emiten mayor diversidad y concentración de COVs comparada con las especies polinizadas por aves (^{Knudsen et al. 2004}, ^{Steenhuisen et al. 2012}, ^{Farré-Armengol et al. 2015}). En este estudio mostramos que el aroma floral de S. assurgens, polinizada por insectos, emite un menor número de COVs florales comparada con S. madrigalii (visitada por colibríes) (Tabla 1). Se ha propuesto que las especies de Salvia de flores blancas podrían ser potencialmente polinizadas por polillas nocturnas (^{Ramamoorthy 1984}, ^{Reith & Zona 2016}); sin embargo, en observaciones crepusculares de S. assurgens y S. madrigalii no se observó a ningún visitante floral en ambas especies (L. Ramírez observación personal).

De acuerdo al ACC se mostró que la tasa de visitas de A. beryllina se asoció con los compuestos volátiles del grupo de los sesquiterpenos (copaeno, palustrol, cubebeno, gurjuneno, humuleno, muuroleno y germacreno) emitidos por las flores de S. madrigalii (Figura 5). Los aromas florales en los que dominan los sesquiterpenos, son comunes entre las plantas polinizadas por abejas (^{Dobson 2006}, ^{Larue et al. 2016}). Específicamente los compuestos humuleno y cariofileno estimulan la respuesta antenal de mariposas (^{Dobson 2006}), y el germacreno estimula la respuesta antenal de la Musca domestica (^{Zito et al. 2015}). ^{Kim et al. (2021)} sugiere que los colibríes usan el sentido del olfato para localizar su alimento. En este contexto, los sesquiterpenos son exclusivos del aroma floral de S. madrigalii (excepto el cariofileno) y posiblemente juegan un papel importante en la atracción de A. beryllina, el único visitante floral observado, por lo que estudios posteriores son necesarios para probar esta idea. Por otra parte, se ha propuesto que las flores polinizadas por colibríes producen entre 10-30 µL de néctar con una concentración del 15 al 25 % (^{Johnson & Nicolson 2008}). En nuestro estudio el volumen de néctar de las flores de S. madrigalii fue bajo para ser una especie polinizada por colibríes (2.8 µL) en flores del primer día de vida y disminuyó conforme la edad de las flores. De manera similar, la concentración de azúcares en el néctar de S. madrigalii disminuyó de 28 a 18 º Brix en flores del primer al tercer día. Sin embargo, estas concentraciones concuerdan con lo reportado para especies visitadas por colibríes (^{Johnson & Nicolson 2008}). En S. assurgens el aroma floral estuvo dominado por 1,4-diclorobenceno (78 % del aroma total), el cual se ha reportado como compuesto dominante en el aroma floral de la planta carnívora Pinguicula moranensis donde la mariposa Thorybes dorantes fue el principal visitante floral (^{Cuevas et al. 2023}). En S. assurgens, T. dorantes fue el visitante floral principal; sin embargo, es poco probable que las mariposas activen el mecanismo de palanca, esencial en la polinización (^{Hedström 1985}, ^{Espino-Espino et al. 2014}, ^{Reith & Zona 2016}), por lo que se les considera como ladrones de néctar. Se requieren estudios específicos para evaluar la eficiencia de T. dorantes, principal visitante floral de S. assurgens. Otros de los visitantes florales observados en S. assurgens fueron dos especies de abejas (Bombus ephippiatus y Xylocopa tabaniformis azteca); mientras ^{Cultid-Medina et al. en 2021}, reportaron 17 especies de abejas que visitan las flores de esta especie. Las mediciones realizadas de la morfología floral concuerdan con el síndrome esperado y observado en ambas especies, mientras que en otros casos como en Salvia leucantha (flores blancas y pequeñas) es visitada por colibríes al igual que S. plurispicata con flores melitófilas (^{Espino-Espino et al. 2014}). El ACC mostró que el 1,4-diclorobenceno y los monoterpenos (α-pineno, camfeno, limoneno y ocimeno) se correlacionaron con la tasa de visitas de los visitantes florales de S. assurgens (T. dorantes, B. ephippiatus, X. tabaniformis azteca y una mosca de la familia Tachinidae; Figura 5). Los monoterpenos son compuestos comunes en el aroma floral de varias especies de angiospermas y se han asociado con la atracción de mariposas, abejas y moscas (^{Andersson et al. 2002}, ^{Dobson 2006}, ^{Byers et al. 2014}).

Nuestro estudio aporta evidencia de que el aroma floral de S. assurgens y S. madrigalii difiere significativamente y de que la tasa de visita de los visitantes florales se asoció de manera significativa con los volátiles florales. Posteriores estudios de bioensayos de preferencia olfativa son necesarios para probar si realmente los volátiles particulares de cada especie (S. assurgens y S. madrigalii) resultan atractivos para sus visitantes florales.