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Introducción
La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es causada por el síndrome respiratorio agudo severo por coronavirus 2 (SARS-CoV-2) y fue reportada en diciembre de 2019 por primera vez en Wuhan (China)1. El SARS-CoV-2 se propagó por el mundo; al 21 de enero de 2021 se reportó 95, 612, 831 casos confirmados y 2, 066, 176 muertes reportadas en el mundo2. En México, el reporte es de 1, 711, 283 casos y 146, 174 defunciones3. Los síntomas más comunes asociados a COVID-19 son fiebre, tos, disnea, expectoración, dolor de cabeza y mialgia o fatiga. Sin embargo, son muchos los portadores asintomáticos que hace que el SARS-CoV-2 sea más transmisible4. La principal característica clínica de los casos graves de COVID-19 está asociada a la neumonía atípica grave con síndrome de dificultad respiratoria aguda. Además, se tiene más riesgo de contraer una forma grave de COVID-19 en pacientes ancianos o si se padece una enfermedad crónica como: tensión arterial alta, diabetes, cardiopatías, accidente cerebrovasculares, afecciones respiratorias crónicas y cánceres5. En este sentido, la OMS refiere que las pruebas diagnósticas para COVID-19 son fundamentales para controlar la pandemia.
Las pruebas estándar para el diagnóstico de SARS-CoV-2 requieren una muestra (clínica) de la nasofaringe (MNF)6; sin embargo, la recolección es incómoda para el paciente, se requiere un profesional de salud capacitado que use equipo de protección personal y una alta cantidad de consumo de hisopos y medios de transporte viral7. Por lo tanto, surge una necesidad de estrategias en la toma de muestras que tenga un rendimiento aceptable para el diagnóstico de SARS-CoV-2 y evite las limitaciones de MNF. Por lo tanto, nuestro objetivo fue evaluar la sensibilidad y especificidad de un enjuague bucal con solución salina (EBSS) como muestra diagnóstica para la detección de SARS-CoV-2, comparado con el método recomendado (MNF), en pacientes ambulatorios.
Materiales y métodos
El presente estudio fue realizado en el Hospital Regional de Alta Especialidad “Dr. Juan Graham Casasús” en Villahermosa, Tabasco, México. A las personas adultas (>18 años) que asistían al centro de evaluación ambulatoria del hospital con síntomas sospechosos de COVID-19 (tos seca, fiebre, dolor de cabeza, disnea, mialgia, entre otros), con tiempo de evolución indistinto o tuvieron contacto previo con casos positivos, se les tomaron MNF para la prueba de SARS-CoV-2 y se solicitó su consentimiento para enjuagarse la boca con un volumen de 5 mL de solución salina, en un recipiente estéril que se almacenó a 4 oC hasta su procesamiento. Las MNF fueron procesadas 3 horas después de la toma de la muestra, una vez que se obtuvieron los resultados de las MNF, se seleccionaron aleatoriamente 34 y se identificaron las muestras de EBSS pareadas para ser analizadas, 24 horas después de la toma de la muestra. El ácido ribonucleico (ARN) de las muestras se aisló y purificó mediante el kit de extracción de ácidos nucleicos virales, IBI Scientific, EE.UU. La amplificación se realizó con el GeneFinder™ COVID-19 Plus RealAmp Kit, una reacción constituida por 10 gl de mezcla de reacción COVID-19 Plus, 5 gl de mezcla de sonda COVID-19 Plus y 5 gl de ARN, control positivo o control negativo. Para detectar SARS- CoV-2 se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) Applied Biosistems QuantStudio 5. Una muestra se definió como positiva para SARS-CoV-2 cuando se observó una curva de amplificación sigmoidea para el gen RdRp, gen N o gen E, con valores del umbral de ciclo (Ct) < 40 (Tabla 1)8.
Tabla 1 Interpretación de resultados para GeneFinder™
| Genes | Resultado del ensayo | |||
|---|---|---|---|---|
| RdRp | N | E | C.I | |
| ≤40 | ≤40 | ≤40 | ≤35 | COVID-19 positivo |
| ≤40 | ≤40 | I.D | ≤35 | COVID-19 positivo |
| ≤40 | I.D | ≤40 | ≤35 | COVID-19 positivo |
| ≤40 | I.D | I.D | ≤35 | COVID-19 positivo |
| I.D | ≤40 | ≤40 | ≤35 | COVID-19 positivo |
| I.D | ≤40 | I.D | ≤35 | COVID-19 positivo |
| I.D | I.D | I.D | ≤35 | COVID-19 positivo |
I.D: Indeterminado; C.I: Control interno. Fuente: Elaboración propia a partir del inserto de GeneFinderTM COVID-19 Plus
Los datos numéricos se expresaron como media ± desviación estándar; los datos categóricos se expresaron como porcentaje (%). Se utilizó el coeficiente kappa para estimar la concordancia entre los resultados de detección de SARS- CoV-2 de EBSS y MNF9. Asimismo, se utilizó la prueba t-Student’s para comparar los valores de CT. La sensibilidad y especificidad del EBSS se calculó utilizando el número total de muestras positivas de MNF como estándar de referencia. El nivel de significancia empleado fue de p<0.05 para todos los análisis. Todos los datos se analizaron con SPSS v. 23.
Resultados
Un total de 34 muestras pareadas EBSS/MNF de pacientes con sospecha de COVID-19 se incluyeron en el análisis final. La edad media de los individuos estudiados fue de 39.76 ±
97 (rango 19-69), 21 (61.9%) eran mujeres y 13 (38.2%) hombres. En las muestras pareadas EBSS/MNF fueron 14 los resultados positivos para SARS-CoV-2; 4 (11.8%) muestras de EBSS y 10 (29.4%) de MNF. Únicamente tres pacientes resultaron concordantemente positivos por PCR para muestras de EBSS y MNF; las medias de CT en las muestras de EBSS correspondieron a gen RdRp 28.45 ± 75; gen N 31.80 ± 2.10; y gen E 29.35 ± 2.11. Asimismo, las medias de CT en MNF fueron gen RdRp 25.91 ± 3.54; gen N 30.54 ± 3.22; y gen E 28.36 ± 2.81. Las medias de CT de cada gen (RdRp, N, E) entre las muestras de EBSS y MNF concordantemente positivas no mostraron diferencia significativa (Figura 1).
Figura 1 Media del umbral de ciclo (CT) de los genes RdRp, N, E entre las muestras pareadas EBSS/ MNF concordantemente positivas para SARS-CoV-2. *p<0.05 significativamente diferente con respecto a MNF, determinado por la prueba t-student’s. Fuente: Elaboración propia
Por otra parte, 8 de las 34 muestras pareadas EBSS/MNF eran discordantes, 1 individuo positivo para EBSS fue negativo para MNF y 7 individuos positivos para MNF resultaron negativos para EBSS (Tabla 2 y 3). El grado de concordancia entre EBSS y MNF fue aceptable con un coeficiente kappa = 0.31; IC del 95%: 0.10-0.51 (Tabla 4). La sensibilidad de EBSS fue de 30% (IC del 95%: 0.06 a 0.65) con una especificidad del 95.8% (IC del 95%: 0.78 a 0.99). Cabe mencionar que los resultados negativos para SARS-CoV-2 fueron más frecuentes; 30 (88.2%) muestras de EBSS y 24 (70.6%) de MNF.
Tabla 2 Resultados de la detección de SARS-CoV-2, en muestras pareadas
| EBSS | MNF | Total | |
|---|---|---|---|
| Positivo | Negativo | ||
| Positivo | 3 | 1 | 4 |
| Negativo | 7 | 23 | 30 |
| Total | 10 | 24 | 34 |
EBSS/MNF MNF: muestra (clínica) de la nasofaringe; EBSS: enjuague bucal de solución salina
Tabla 3 Resultados discordantes entre las muestras pareadas EBSS/MNF
| Resultados | Valores Ct de EBSS | Valores Ct de EBSS | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Genes | Genes | |||||||||
| MNF | EBSS | RdRp | N | E | Control interno | RdRp | N | E | Control interno | |
| Muestra 1 | + | - | ND | 33.07 | 29.42 | 26.34 | ND | ND | ND | 23.44 |
| Muestra 2 | + | - | ND | 33.31 | 29.94 | 24.35 | ND | ND | ND | 28.74 |
| Muestra 3 | + | - | 29.20 | 33.55 | 27.43 | 23.93 | ND | 42.08 | ND | 26.81 |
| Muestra 4 | + | - | ND | 36.06 | 31.95 | 25.64 | ND | ND | ND | 25.12 |
| Muestra 5 | + | - | ND | 32.07 | 27.95 | 26.94 | ND | ND | ND | 26.97 |
| Muestra 6 | + | - | ND | 32.65 | 33.07 | 26.76 | ND | ND | ND | 26.90 |
| Muestra 7 | + | - | 24.74 | 24.44 | 21.60 | 26.52 | ND | ND | ND | 22.18 |
| Muestra 8 | - | + | ND | 46.01 | ND | 22.65 | ND | 31.89 | 33.20 | 22.14 |
+: Positivo; -: Negativo; MNF: muestra (clínica) de la nasofaringe; EBSS: enjuague bucal de solución salina; ND: no detectado Fuente: Elaboración propia
Tabla 4 Valoración del coeficiente kappa
| Coeficiente kappa | Fuerza de concordancia |
|---|---|
| 0.00 | Pobre (Poor) |
| 0,01-0,20 | Leve (Slight) |
| 0,21-0,40 | Aceptable (Fair) |
| 0,41-0,60 | Moderado (Modérate) |
| 0,61-0,80 | Considerable (Substantial) |
| 0,81-1,00 | Casi perfecta. (Almost perfect) |
Entre paréntesis, la expresión original en inglés. Fuente: Elaboración propia modificado de Landis y Koch9
Discusión
La infección activa de SARS-CoV-2 se transmite a través de gotículas de saliva o mucosa. Algunos estudios sugieren que la detección de SARS-CoV-2 en saliva, es una alternativa a los métodos de diagnóstico de hisopos estándar10,11,12.
No obstante, existen diversos inconvenientes para analizar la saliva: volumen insuficiente; diferente viscosidad y consistencia de las muestras que requieren diluciones adicionales; la preparación de la saliva es más laboriosa; las muestras mucoides son difícil de pipetear, lo que requiere un mezclado vigoroso13. Todo esto podría resultar en un falso negativo; sin embargo, Kandel y colaboradores13 sugieren no afectar la sensibilidad de la saliva. Nosotros observamos que el EBSS no presenta ningún inconveniente durante su procesamiento, es de fácil recolección, las instrucciones son mínimas, y se evita la presencia de un profesional de salud. Además, la solución salina al 0.9% como parte del EBSS se usó como medio de transporte viral. En este sentido, Rodino y colaboradores14 reportaron que los hisopos nasofaríngeos almacenados en solución salina al 0.9% hasta siete días a temperaturas de 2-8 oC y -20 oC, no mostraron pérdida de sensibilidad y estabilidad para la detección de SARS-CoV-2, sugiriendo a la solución salina al 0.9% como alternativa de medio de transporte viral.
Encontramos que la sensibilidad de EBSS para detectar SARS-CoV-2 es del 30% (IC del 95%: 0.06 a 0.65) y una sensibilidad del 95.8% (IC del 95%: 0.78 a 0.99), con un grado de concordancia aceptable con respecto a MNF. Además, las medias de CT de cada gen (RdRp, N, E) entre las muestras pareadas EBSS/MNF concordantemente positivas, no mostraron diferencia significativa. A pesar de la baja sensibilidad del EBSS, el presente estudio es el primer reporte en evaluar la utilidad de EBSS como muestra diagnóstica para SARS-CoV-2.
Nuestro estudio presenta algunas limitaciones: Primero, el tamaño de la muestra es pequeño. Segundo, no evaluamos la estabilidad de SARS-CoV-2 en el EBSS. Tercero, el rendimiento del EBSS se midió solamente con un kit de detección para SARS-CoV-2, resultado que podría variar con otros kits comerciales para la detección de SARS-CoV-2 con sensibilidad analítica diferente.
Conclusión
Nuestro estudio muestra que el rendimiento del EBSS no es comparable con MNF para la detección de SARS-CoV-2; sin embargo, es una herramienta de autocolección simple, no invasivo, evita la necesidad de hisopos y medio de transporte viral, no requiere personal capacitado ni equipo de protección personal y se puede realizar en cualquier entorno, siendo ésta una ventaja en su uso en países con recursos limitados o en situaciones como la escasez de material por desabasto en la distribución o producción de los mismos. Además, las muestras de EBSS pueden ser de particular beneficio para agilizar la identificación de los casos donde se generen brotes.
