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Introducción
El maíz ha sido la base de la alimentación desde los pueblos prehispánicos (Cuevas-Mejía, 2014). Dentro de las 220 variedades de maíz que se han descrito en América Latina (Sierra-Macías y col., 2014), se encuentran los maíces pigmentados, los cuales contienen una alta cantidad de compuestos antioxidantes (Bello- Pérez y col., 2016; Bei y col., 2017), que contribuyen en la prevención y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, cáncer y diabe tes, entre otras (Gul y col., 2016).
Se han reportado diversos compuestos fenólicos en maíces, como cianidina-3-glucósido, pelargonidina-3-glucósido, ácido 2,4,6-trihidroxibenzoico, ácido p-cumárico o ácido p-hidroxicinámico, ácido cafeico, apigenina-O-hexosido, lu- teolina-O-rutinosido (Lao y Giusti, 2017; Hernández y col., 2018). Sin embargo, muchos de estos compuestos no están de forma libre, si no ligados a componentes de la pared celular de las plantas (Streimikyte y col., 2022), por lo que se requieren tratamientos que permitan liberarlos, como el uso de enzimas o procesos de fermentación.
Durante la fermentación se presentan cambios en los niveles de compuestos fenólicos, debido a la acción de enzimas (celulasas, hemicelulasas, xylanasas, pectinasas, proteasas, entre otras) producidas durante la fase de crecimiento de los microorganismos (Huynh y col., 2014). Estas enzimas rompen los componentes químicos de la pared celular, resultando en una hidrólisis de los enlaces que unen a los compuestos fenólicos a la pared celular (Alves-Magro y de-Castro, 2020), logrando así liberar los compuestos antioxidantes.
Dentro de los microorganismos más utilizados en la fermentación en medio sólido (FMS), se encuentran los hongos filamentosos, de los cuales, el género Rhizopus es uno de los más usados, pertenece a la clase Fitomicetos, orden Mucolares, familia Mucoraceae (Ibarruri y Hernández, 2018; Aoki y col., 2020). R. oligosporus, R. stolonifer y R. oryzae son generalmente reconocidos como seguros (GRAS, por sus siglas en inglés: Generally Recognized As Safe), de acuerdo a la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés: Food and Drug Administration), y pueden ser usados para consumo en humanos (Cantabrana y col., 2015). Entre las características por las que este género de hongo es interesante para la aplicación en alimentos, destacan el que crece a un rango amplio de temperatura (7 °C a 45 °C), y que durante su crecimiento produce hidrolasas como amilasas, proteasas y lipasas, que pueden ayudar a incrementar la biodisponibilidad de nutrientes al realizar una hidrólisis en los componentes de la pared celular del material vegetal (Ghosh y Ray, 2011; Cantabrana y col., 2015).
Se ha reportado que la FMS de maíz ha sido utilizada para la obtención de enzimas como la celulasa (Yoon y col., 2014), compuestos bioactivos como la monacolina K (Zhang y col., 2018), la cual reduce los niveles de colesterol- LDL y ácido cítrico (Tong y col., 2023). Sin embargo, existen muy pocos estudios sobre su empleo junto a R. oryzae para la obtención de compuestos fenólicos a partir del maíz o de su potencial como materia prima para el desarrollo de alimentos funcionales.
El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la FMS sobre la liberación de compuestos fenólicos con capacidad antioxidante a partir de granos de maíz utilizando R. oryzae.
Materiales y métodos
Reactivos
El agar papa dextrosa fue adquirido en BD- BIOXON®. El ácido clorhídrico, ácido acético glacial, n-butanol, etanol y metanol absolutos, fueron obtenidos en J. T. Baker®. El DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS+ (2, 2’-Azinobis-3-etil-benzo-tiazolina-6-acido sulfónico), persulfato de potasio (K2S2O8), Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácido carboxílico, 97 %), TPTZ (2,4,6-tripiridils-triazina), cloruro férrico, catequina, sulfato férrico de amonio, reactivo de Folin-Ciocalteu, ácido gálico (AG), sulfato de hierro y carbonato de sodio fueron adquiridos en Sigma Chemical Co.
Microorganismo
Se utilizó la cepa R. oryzae (Colección Departamento de Investigación en Alimentos-Universidad Autónoma de Coahuila, Saltillo, México). El microorganismo se conservó en una solución crioprotectora a - 20 °C (leche descremada: glicerol; 9:1). Las esporas se activaron en agar papa dextrosa a 30 °C/7 d, posteriormente se colectaron con Tween-80 (0.01 %) y se realizó un conteo en un hematocitómetro (Brand, Alemania).
Material vegetal
Los granos de maíz (Zea mays) fueron adquiridos en un local comercial en Delicias, Chihuahua, México, en marzo de 2022. Se llevaron al Laboratorio de Biotecnología y Bioingeniería del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD), Delicias, donde se descartaron los granos quebrados, y los seleccionados se desinfectaron mediante radiación ultravioleta (UV) durante 30 min, y se almacenaron a temperatura ambiente (25 °C) en contenedores herméticos hasta su uso.
Fermentación en medio sólido
Después de remojar los granos durante 24 h, se cocieron en agua hasta reventar, se retira ron, se esterilizaron a 121 °C/15 min y se dejaron enfriar a temperatura ambiente (25 °C). Para la FMS, se colocaron 12 g de maíz en bolsas de polipropileno (25 cm2) resellables, se inocularon con 1 x 106 esporas/g de soporte en condiciones de asepsia y se incubaron a 30 °C/72 h. Los extractos fueron recuperados y extraídos cada 12 h. Para la extracción, se tomaron 4 g de muestra húmeda, y se mezclaron con 20 mL de etanol al 80 % (relación m/v 1:5) durante 5 min, y se filtraron a vacío. Los extractos obtenidos se congelaron a - 20 °C hasta su análisis.
Contenido de fenoles totales hidrolizables
El contenido fenólico total hidrolizable (CFTH) se determinó usando el método de Folin-Ciocalteu, de acuerdo con lo reportado por Wong-Paz y col. (2014). Se mezclaron 20 µL del extracto con 20 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu. Después de 5 min, se añadieron 20 µL de carbonato de sodio (0.01 M) y se dejó reposar la mezcla durante 5 min. Finalmente, la solución se diluyó con 125 µL de agua destilada y se registró la absorbancia (790 nm) en un lector de microplaca (Thermo Scientific, Multiskan Go, Vantaa, Finlandia). Se realizó una curva estándar de ácido gálico (0 mg/L a 200 mg/L; 3.612 5x; R2 = 0.995), y se expresaron los resultados como equivalentes de ácido gálico por gramo de materia seca (mg EAG/gms).
Contenido de fenoles totales condensados
Se determinó el contenido de fenoles totales condensados (CFTC) de acuerdo con la técnica reportado por Hernández y col. (2017) adaptada a microplaca. Se mezclaron en tubos de tapa roscada 250 µL de la muestra, 1.5 mL de HCl-n-Butanol (1:9 v/v) y 50 µL de reactivo férrico (1 mL HCl concentrado, 2 g de sulfato férrico de amonio y aforado a 5 mL con agua destilada) y se calentaron los tubos en baño de ebullición a 100 °C/40 min. Los tubos se enfriaron hasta llegar a temperatura ambiente (25 °C), se tomaron 200 µL de cada tubo y se registró la absorbancia a 460 nm, utilizando un lector de microplaca. Los resultados se expresaron en equivalentes de catequina por gramo de materia seca (mg EC/gms), empleando una curva patrón de catequina (0 mg/L a 1 000 mg/L; y = 0.279 4x; R2 = 0.993).
Contenido de fenoles totales
El CFT se obtuvo como la suma del CFTH y el CFTC, y se expresó como mg/gms.
Capacidad antioxidante por el ensayo DPPH
Se basa en la aceptación de un electrón o átomo de hidrógeno por el radical 2,2-difenil-1- picril-hidracilo (DPPH), ocasionando su reducción por acción de los antioxidantes presentes en la muestra. Se utilizó el ensayo reportado por Molyneux (2004), adaptado a microplaca. Se mezclaron 7 µL del extracto con 193 µL de solución de DPPH (60 µM), se dejó reposar 30 min y se registró la absorbancia a 517 nm en un lector de microplacas. El resultado se expresó como equivalentes de Trolox por gramo de materia seca (mg ET/gms) empleando una curva estándar de Trolox (0 mg/L a 200 mg/L; y = 3.551 6x; R2 = 0.986 4).
Capacidad antioxidante por ensayo ABTS+
Se basa en la cuantificación del decoloramiento del radical ABTS+ [ácido 2,2’-acinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] por efecto de su reducción debido a la acción de los antioxidantes presentes en la muestra. Se realizó con base en lo reportado por Torres-León y col. (2019), adaptado a microplaca. Se preparó el radical ABTS+ mezclando 2.45 mL de ABTS+ 7 mM y 12.5 mL de persulfato de potasio (K2S2O8) 2.45 mM y se incubó la solución en oscuridad por 16 h. Posteriormente, se ajustó la absorbancia a 0.7 ± 0.2 a una longitud de onda de 734 nm. Para el ensayo, se mezclaron 10 µL de muestra y 190 µL del radical ABTS+. Pasado 1 min de reacción, se registró la absorbancia en un lector de micro- placa. El resultado se expresó como equivalentes de Trolox por gramo de materia seca (mg ET/gms) empleando una curva estándar de Trolox (0 mg/L a 200 mg/L; y = 3.551 5x; R2 = 0.985 7).
Capacidad antioxidante por ensayo FRAP
A diferencia del análisis por DPPH y ABTS+, que evalúan la capacidad de la muestra para neutralizar radicales libres, el análisis de la capacidad de reducción férrica del plasma (FRAP, por sus siglas en inglés: ferric reducing ability of plasma) se basa en el principio de que los antioxidantes son sustancias capaces de reducir el ion férrico al ion ferroso, es decir, evalúa la capacidad reductora mediante un mecanismo de transferencia de electrones (Mercado-Mercado y col., 2013) y a su vez simula las condiciones de un sistema biológico (Benzie y Strain, 1996).
Se determinó de acuerdo con Alvarez-Parrilla y col. (2005), adaptado a microplaca. El reactivo FRAP se preparó mezclando 50 mL de una solución buffer de acetatos 0.3 M y pH 3.6, 5 mL de una solución 2,4,6-tripiridils-triazina (TPTZ) 10 mM y 5 mL de una solución de cloruro férrico. La solución se mezcló y se dejó reposar a 37 °C/30 min. Para el ensayo se mezclaron 18 µL de agua, 6 µL del extracto y 180 µL de solución FRAP, se dejó reposar a 37 °C/1 h y se registró la absorbancia a 595 nm en un lector de microplaca. Los resultados se expresaron como mg Fe+2/gms utilizando una curva estándar de sulfato de hie rro (0 mg/L a 800 mg/L; y = 1.272 1x; R2 = 0.004).
Análisis estadístico
Se trabajó con un diseño completamente al azar para determinar el efecto del tiempo de fermentación sobre el CFT y capacidad antioxidante (CA) del maíz; cada tratamiento se evaluó por triplicado, y se reportó el promedio y su desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y una prueba de diferencia mínima significativa (LSD, por sus siglas en inglés: Least significant difference) (P ≤ 0.05) para establecer las diferencias significativas entre tratamientos, empleando el programa Statistica 7.0 (Stat Soft, Tulsa, Ok, EUA).
Para el análisis de la asociación entre el CFT y la CA se empleó los coeficientes de correlación de Pearson.
Resultados y discusión
Fermentación en medio sólido
El CFTC, después de un incremento inicial durante las primeras 12 h, mostró un decremento de 0.18 mg EC/gms en comparación con el tiempo anterior (Figura 1). Posteriormente volvió a aumentar (aunque presentó otra breve fase de disminución después de las 60 h) para alcanzar un incremento total a las 60 h de 0.58 mg EC/gms con respecto al tiempo inicial (0 h). El CFTH, que empezó a aumentar después de las 12 h, mostró un decremento en su contenido, posterior a las 36 h con un incremento global de 0.39 mg EAG/gms respecto al tiempo inicial. Chen y col. (2021), reportaron un comportamiento similar en un proceso de FMS con varios microorganismos y maíz blanco, al aumentar el contenido de fenoles en el material fermentado de hasta 1.25 veces. Así mismo, Buenrostro-Figueroa y col. (2017), utilizando R. oryzae e higo, lograron incrementar el contenido de fenoles hasta 4.93 veces. Estos aumentos se deben a la acción de las enzimas celulasas, xylanasas, lipasas, proteasas y amilasas, producidas por el microorganismo durante el proceso de fermentación (López y col., 2010; Darman y col., 2011; Kaur y col., 2015; Behnam y col., 2016).
Figura 1 Contenido de fenoles totales hidrolizables y condensados en fracciones fenólicas de maíz fermentado.
El valor más alto de CFT se obtuvo a las 60 h, con un incremento de 0.83 veces con respecto al tiempo 0 h (Figura 2) (Tabla 1). Estos resultados son 1.31 veces superiores a los reportados por Sánchez-Magaña y col. (2019), al mismo tiempo de fermentación en granos de maíz variedad Pioneer utilizando R. oligosporus. El tiempo de máxima CFT coincide con lo documentado por Buenrostro-Figue roa y col. (2017) para la FMS de cáscara de higo con R. oryzae, donde pasadas las 60 h disminuyó el CFT, lo cual se puede atribuir a la degradación de los compuestos por enzimas del mismo hongo (Starzyńska-Janiszewska y col., 2021).
Figura 2 Contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante durante la fermentación de granos de maíz.
Tabla 1 Efecto de la FMS en maíz con R. oryzae sobre CFT y CA.
| Tiempo | ABTS+ (mgET/gms) | DPPH (mgET/gms) | FRAP (mgFe+2/gms) | CFT (mg/gms) |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.95 ± 0.09b | 0.58 ± 0.03b | 2.39 ± 0.17b | 1.05 ± 0.09b |
| 60 | 1.47 ± 0.111a | 1.27 ± 0.13a | 5.38 ± 0.20a | 1.92 ± 0.05a |
a,bLetras distintas indican diferencia significativa entre el tiempo de fermentación para un mismo tipo de ensayo.
Capacidad antioxidante
El proceso de FMS de maíz empleando R. oryzae presentó un efecto significativo sobre la CA a las 60 h (Tabla 1) (Figura 2). El proceso de fermentación aumentó considerablemente la CA del maíz en el ensayo ABTS+, 0.55 veces, comparado con el tiempo 0 h de proceso, mientras que en las mismas condiciones, la FMS frente al radical DPPH incrementó 1.19 veces y para el análisis FRAP aumentó 1.25 veces, con respecto al tiempo 0. Dichos incrementos están relacionados con la liberación de compuestos fenólicos durante el proceso de fermentación (Bei y col., 2017).
Diversos estudios han demostrado el efecto positivo de la FMS sobre el incremento en la CA. Queiroz-Santos y col. (2018), reportaron un aumento de 1.7 veces de la CA (DPPH) en granos de soya fermentados con Saccharomyces cerevisiae. En orujo de uva sometido a FMS con R. oryzae, Leite y col. (2019), registraron un incremento de 2.7 veces la CA en relación al material no fermentado. Wu y col. (2022) desarrollaron un proceso de FMS utilizado avena como sustrato, empleando como inóculo una mezcla de Lactobacillus plantatum y R. Oryzae, y reportaron incrementos en la CA del material fermentado después de 72 h, con valores de 2.04, 2.10 y 2.72 veces superiores comparado al material sin fermentar. Esos resultados, si bien fueron más altos al del presente estudio, mostraron una tendencia similar a aumentar la CA del producto fermentado.
Finalmente, se observó una fuerte correlación entre el CFT y la actividad antioxidante en los tres ensayos evaluados (DPPH, ABTS+ y FRAP) (Tabla 2), lo cual confirma que el aumento de la CA se debe al aumento de los FT liberados durante el proceso de FMS con R. oryzae.
Conclusiones
El proceso de fermentación en medio sólido con R. oryzae mostró ser un método simple y eficaz para incrementar el contenido de fenoles totales (CFT) y la capacidad antioxidante (CA) del maíz, ya que mejoró el valor biológico del cereal, al incrementar hasta 0.83 y 1.25 veces el CFT y CA del maíz, respectivamente, a las 60 h de proceso. El grano bioprocesado muestra potencial para ser empleado como materia prima en el desarrollo de alimentos funcionales, debido a su propiedad antioxidante. Se requieren estudios adicionales que permitan evidenciar el incremento en el valor funcional del maíz bioprocesado con R. oryzae.
