INTRODUCCIÓN

Las garrapatas son consideradas entre los vectores más importantes de agentes patógenos que afectan tanto a seres humanos como a animales. En comparación con otros artrópodos, estos ectoparásitos son capaces de transmitir virus, bacterias y protozoarios, siendo además los principales reservorios naturales de varios de ellos (¹). De todas las enfermedades que trasmiten, las más relevantes son las fiebres rickettsiales o rickettsiosis, infecciones sistémicas de compromiso prominente del endotelio vascular que producen gravedad variable, algunas potencialmente fatales como el tifus murino o epidémico y la fiebre manchada de las Montañas Rocosas (²).

Las rickettsiosis son ocasionadas por bacterias cocobacilos, gram negativos de asociación obligada con las células eucariotas, pertenecientes al género Rickettsia, orden Rickettsiales, familia Rickettsiaceae (³). Estos microorganismos no se transmiten directamente entre humanos, por lo que la infección en vertebrados susceptibles ocurre por la inoculación de secreciones glandulares salivales o la autoinoculación de las heces de los ectoparásitos vectores, depositadas sobre la piel o pelaje de los hospederos (⁴).

Con respecto a las diferencias serológicas, epidemiológicas y características de crecimiento intracelular, el género Rickettsia se divide en: 1) grupo de la fiebres manchadas, en el cual se encuentran Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii y Rickettsia peacockii, entre otras especies; 2) grupo tifo, conformado por Rickettsia typhi y Rickettsia prowazekii; 3) grupo transicional, formado por Rickettsia felis y Rickettsia akari; y 4) grupo ancestral, que incluye a Rickettsia canadensis y Rickettsia bellii (²).

En México, particularmente en la Península de Yucatán, se han registrado numerosos casos de fiebres rickettsiales en seres humanos ocasionados por distintas especies: Zavala-Castro et al. (⁵, ⁶), hallaron tifo murino provocado por R. typhi. Asimismo, Zavala-Velázquez et al. (⁷) y Zavala- Castro et al. (⁸), reportaron la infección con R. felis. Además, Zavala-Castro et al. (⁹, ¹⁰) y Lugo- Caballero et al. (¹¹), describieron infecciones con R. rickettsii. Finalmente, Zavala-Castro et al. (¹²), notificaron un par de casos originados por R. akari. Aunque todas estas rickettsias son transmitidas por ectoparásitos artrópodos, en México y particularmente en la península de Yucatán, son escasas las investigaciones que determinan su posible participación en el ciclo de transmisión (¹³).

En mayo y junio de 2010, se presentó un brote de fiebre rickettsial en habitantes de la comunidad rural y vulnerable de Bolmay, Yucatán, México (Área de Epidemiología de la Jurisdicción Sanitaria número 2 de los Servicios de Salud de Yucatán [SSY], datos no publicados). Adicionalmente, Martínez-Ortiz et al. (¹⁴), identificaron (con pruebas moleculares) la infección con R. typhi en sangre de perros domésticos de dicha comunidad; sin embargo, no se determinó la circulación de Rickettsia spp. en los artrópodos presentes en esta.

El objetivo del presente estudio es analizar la presencia de Rickettsia spp. en garrapatas que infestan perros domésticos de Bolmay.

MATERIAL Y MÉTODOS

Bolmay, Yucatán, México (20°32’56’’N-87°56’04’’W), tiene un clima tipo Aw0 (cálido subhúmedo con lluvias en verano) y una temperatura media anual de 36 °C. La vegetación dominante es selva baja caducifolia con algunas áreas de pasto forrajero y distintos árboles frutales u ornamentales. El uso de suelo es principalmente para actividades agropecuariasy secundariamente para asentamientos urbanos. Además, es común observar numerosos perros y gatos sin dueño, así como diversos grados de pobreza, abundantes desperdicios orgánicos e inorgánicos, carencia de medidas de higiene y de servicios básicos como energía eléctrica, alumbrado público y agua potable (¹⁴).

La recolección de ectoparásitos se realizó en los meses de mayo y junio de 2014. La manipulación de los perros fue realizada por médicos veterinarios con el consentimiento y en presencia de los dueños, bajo condiciones mínimas de estrés y siguiendo especificaciones nacionales (NOM-062-ZOO-1999). La inspección duró entre 10 y 15 minutos por animal. Las garrapatas se recolectaron de 95 perros, seleccionados por conveniencia, en la localidad de estudio, con ayuda de peines para separar el pelo y pinzas de disección para conservar íntegro el hipostoma, según la metodología expuesta por Solís-Hernández et al. (¹⁵).

Los ejemplares recolectados fueron colocados y embebidos en alcohol absoluto en viales para microcentrífuga de 1.5 ml (Eppendorf®, Hamburgo, Alemania) para su conservación y traslado a la Unidad Colaborativa para Bioensayos Entomológicos (UCBE) del Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CCBA)-Universidad Autónoma de Yucatán (UADY) para el registro del estadio de desarrollo vital (ninfa, larva o adulto), sexo (macho o hembra), género y especie.

Cada ectoparásito se identificó con las guías taxonómicas para ectoparásitos reportados en México y América (16-19), con ayuda de un estereoscopio convencional (Motic®, Columbia Británica, Canadá).

Las garrapatas fueron agrupadas en viales con hasta ocho ejemplares extraídos del mismo perro, pertenecientes a la misma especie y estadio de desarrollo vital. Desafortunadamente, debido a la alta infestación y el tiempo limitado para la exploración de los perros, no fue posible recolectar las pulgas observadas.

De cada uno de los viales se extrajo ADN total (utilizando el ectoparásito entero) con el estuche comercial DNA Mini-Kit (QIAGEN®, Hilden, Alemania),segúnlasespecificacionesdelfabricante.La extracción final se cuantificó en un espectrofotómetro (NanoDrop2000®; Thermo ScientificTM, Maryland, Estados Unidos) y posteriormente se conservó a -20°C hasta su empleo en las pruebas PCR.

Para la identificación de ADN rickettsial se realizaron dos PCR. La primera de ellas se ejecutó para amplificar un segmento del gen htrA antigénico (17-kDa), altamente conservado en todas las especies de Rickettsia (²⁰). Para esta reacción se utilizaron los cebadores propuestos por Webb et al. (²¹): 17kD1 (5’-GCTCTTGCAACTTCTATGTT-3’) y 17kD2 (5’-CATTGTTCGTCAGGTTGGCG-3’), que amplifican un tamaño de 434 pb. Posteriormente, con la finalidad de aumentar la sensibilidad, se emplearon los cebadores descritos por Schriefer et al. (²²): 17kN1 (5’-CATTACTTGGTTCTCAATTCGGT-3’) y 17kN2 (5’-GTTTTATTAGTGGTTACGTAA-3’), que codifican una región inmersa en el mismo fragmento con un tamaño de 232 pb.

Adicionalmente, se llevó a cabo una PCR de punto final para identificar un fragmento del gen rOmpB perteneciente al género Rickettsia (²³). En esta reacción se usaron los oligonucleótidos propuestos por Peniche-Lara et al. (²⁴): Rp.330(2) (5’-ATGGCTT CAAAA CCAAATTTTCTAA-3’) y Rp. 330(2) (5’-GCTCT ACCTGCTCCATTATCTGTACC-3’), los cuales amplifican un fragmento de 990 a 1000 pb. Todas las reacciones incluyeron control positivo (ADN de cultivo de R. parkeri) y negativo (agua estéril). La electroforesis de todos los productos de PCR se realizó en geles de poliacrilamida al 8 %, teñidos con bromuro de etidio. La visualización final se hizo en un fotodocumentador (Bio-Rad®, California, Estados Unidos).

Los productos positivos de htrA se purificaron con el estuche comercial QIAquick® PCR Purification (QIAGEN®, California, Estados Unidos), de acuerdo con las especificaciones del fabricante y fueron enviados para secuenciación al Instituto de Biotecnología (IBT) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

Las secuencias obtenidas fueron alineadas con el programa MEGA versión 6.0 y posteriormente analizadas con la herramienta BLAST, para determinar los porcentajes de cobertura e identidad con secuencias previamente depositadas en el GenBank, utilizando el algoritmo Megablast.

RESULTADOS

Se recolectaron un total de 291 garrapatas en 95 perros domésticos, pertenecientes a tres géneros: Amblyomma (55.7%, 162/291), Rhipicephalus (34%, 99/291) e Ixodes (10.3%, 30/291), y a tres especies: Rhipicephalus sanguineus sensu lato, Ixodes affinis y Amblyomma mixtum. De los perros muestreados, 69 (72.6%, 69/95) presentaron infestaciones severas con garrapatas de diferentes géneros, especies, sexos y estadios de desarrollo vital.

Se recolectaron individuos de los tres estadios de desarrollo vital: ninfas (49.8%, 145/291), larvas (6.9%, 20/291) y adultos (43.3%, 126/291) y de ambos sexos: hembras (38.9%, 49/126) y machos (61.1%, 77/126).

A la exploración física, ninguno de los perros evidenció signos clínicos compatibles con rickettsiosis, aunque la mayor parte de ellos presentaron alergias por picadura de ectoparásitos, así como diversos grados de desnutrición o abandono.

Los ectoparásitos colectados se agruparon en 105 viales. Doce (11.4%, 12/105) resultaron positivos para cualquiera de los genes de Rickettsia spp., seis (50%, 8/12) únicamente para htrA, cuatro (33.3%, 4/12) solamente para rOmpB y dos (16.7%, 2/12) para ambos. Al menos un vial con cualquiera de los géneros (Ixodes, Amblyomma o Rhipicephalus) encontrados en el presente estudio fue positivo para algún gen. Las especies positivas fueron Rh. sanguineus s. l., A. mixtum e I. affinis. De igual forma, la infección se detectó en larvas, ninfas, adultos, machos y hembras (Cuadro 1).

El análisis de alineamiento de cada secuencia obtenida arrojó 96% de identidad y cobertura para distintas secuencias de especies patógenas, entre ellas R. typhi (acceso GenBank KC469609.1), R. felis (acceso GenBank CP000053.1) y R. prowazekii (acceso GenBank AY570301.1), por lo que no fue posible determinar la especie infectante. Asimismo, dicho análisis no mostró secuencias pertenecientes a rickettsias simbiontes no patogénicas para seres humanos o animales.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados sugieren la participación de las garrapatas en los ciclos de transmisión de las fiebres rickettsiales en habitantes y animales domésticos de la comunidad de estudio. Los hallazgos positivos para los fragmentos de los genes htrA (17-kDa) y rOmpB, demuestran que Rickettsia spp. circula en algunas especies de garrapatas recolectadas en el presente estudio, reforzando además la asociación de estos artrópodos en el mantenimiento de las rickettsiosis en ambientes rurales, tanto en seres humanos como en animales (²⁵).

Los géneros y especies de garrapatas presentes en esta investigación han sido previamente identificadas en Yucatán, México (¹⁶, ¹⁷, ¹⁸, ¹⁹, ²⁶). Como ya se ha demostrado, Amblyomma y Rhipicephalus (los géneros más numerosos), parasitan habitualmente perros domésticos en medios rurales (²⁷), aunque Rh. sanguineus s.l. circula también en condiciones urbanas, dependiendo de factores como el clima, el número de hospederos y la geografía, entre otros (²⁸). Por su parte, el género Ixodes infesta habitualmente animales en contacto con ambientes silvestres o peri-domésticos (²⁹) e identificarlo en perros de comunidades rurales en Yucatán, se debe principalmente a que algunas veces son utilizados en actividades como la cacería de subsistencia (²⁷). De las garrapatas recolectadas en este estudio, particularmente el complejo Amblyomma spp., ha sido descrita como positiva a Rickettsia spp. (³⁰); no obstante, los ejemplares se tomaron de ganado bovino procedente de distintos ranchos de Yucatán. Por otro lado, Zavala-Velázquez et al. (³¹), colectaron ejemplares de Amblyomma spp. y Rh. sanguineus s.l. que parasitaban perros, pero no obtuvieron evidencia molecular de la infección con Rickettsia spp.

En el trabajo de Dzul-Rosado et al. (³²), se reportó la presencia de R. typhi en seis ejemplares adultos de Rh. sanguineus s.l., que infestaban perros en una comunidad rural con historial de enfermedades rickettsiales en sus habitantes. Asimismo, Braga-Ordóñez et al. (³³) y Peniche-Lara et al. (³⁴), detectaronADN de R. rickettsii en Rh. sanguineus s. l. recolectadas de perros provenientes de comunidades rurales del estado de Yucatán. Con referencia a estos hallazgos, se concluye que la presente es la primera evidencia molecular de la infección con Rickettsia spp. en garrapatas I. affinis recolectadas en Yucatán. La presencia de garrapatas positivas en perros domésticos infectados con Rickettsia spp. ya ha sido documentada en la región (¹⁴, ³⁵), por lo que estos ectoparásitos también representan un posible factor de riesgo para la transmisión Rickettsia spp. a otros animales domésticos, debido a su notable capacidad para parasitar numerosas especies de hospederos susceptibles, incluidos los seres humanos (²⁶, ³⁶).

Rhipicephalus sanguineus s.l. es la garrapata más distribuida en Yucatán, incluso ha sido recolectada de habitantes accidentalmente parasitados es distintas comunidades (²⁶), por lo que generalmente está asociada con poblaciones de perros en cercanía con ellos (³², ³⁷). Aspecto que pudo contribuir para que las personas de la comunidad de estudio enfermen de rickettsiosis; no obstante, esta hipótesis no pudo ser demostrada, aunque en un estudio previo, se ha documentado la presencia de R. typhi en garrapatas del género Rhipicephalus (³²).

Por su parte, I. affinis generalmente no parasita seres humanos (³⁸); sin embargo, ocasionalmente ha sido identificada en personas y perros de Yucatán (²⁶, ³⁹). Caso similar con A. mixtum, la cual ha sido descrita en perros de una comunidad del Estado(²⁶). Por otra parte, las garrapatas del complejo Amblyomma spp. (positiva en el presente estudio) han sido reconocidas como los vectores más relevantes en el ciclo de transmisión de R. rickettssi en países sudamericanos como Argentina, Brasil y Colombia, reportándose como la más frecuente en parasitismos accidentales de seres humanos (⁴⁰).

El hallazgo de la probable circulación de rickettsias patógenas en garrapatas I. affinis y Rh. sanguineus s. es doblemente relevante, debido a que previamente, Solís-Hernández y colaboradores, detectaron la infección con Borrelia burgdorferi sensu lato, agente causal de la enfermedad de Lyme o borreliosis (que afecta a seres humanos y animales), en ejemplares recolectados de perros de una comunidad rural de Yucatán, México. Asimismo, los perros infestados presentaron evidencia molecular de infección, por lo que el riesgo potencial para la transmisión de estos agentes etiológicos a las poblaciones humanas es alto, debido al estrecho contacto entre estos animales, sus ectoparásitos y las personas.