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Introducción
Los moluscos bivalvos se utilizan como bioindicadores para estimar los tipos y cantidades de contaminantes presentes en ambientes acuáticos, dada su distribución cosmopolita y habilidad de bioacumularlos (Oliver et al. 2001, Bebianno y Berreira 2009, Torres et al. 2012). Existen diversos factores que intervienen en el proceso de bioacumulación, como la biología de la especie de bivalvo, la tasa de filtración, la tasa de absorción, el contenido lipídico y la capacidad de detoxificación, además de factores externos como el punto de muestreo de las fuentes contaminantes, la salinidad, cantidad de materia orgánica y la temperatura ambiental (León et al. 2013).
La acumulación de hidrocarburos (HC) en el tejido lipídico de los organismos, es uno de los principales riesgos para los organismos bioacumuladores (Pereira et al. 1999). Algunas investigaciones demuestran que la exposición de bivalvos a hidrocarburos y metales pesados puede causar daño a nivel celular, en la reproducción y el crecimiento de los organismos (Gold et al. 1995, Oliver et al. 2001). También se ha determinado que la temperatura es un factor que afecta a los organismos ectotermos influyendo en sus reacciones químicas y fisiológicas (Gordon 2005, Ivanina et al. 2008, Sokolova y Lanning 2008). Se ha registrado que la exposición prolongada del bivalvo Crassostrea virginica a altas temperaturas y a metales pesados, afecta los procesos bioquímicos y provoca maduración gonádica temprana (Ruddy et al. 1975). Además, temperaturas elevadas coadyuvan a la acumulación de altas concentraciones de sustancias xenobioticas en los tejidos, asociada a una elevada actividad de hematocitos (Lüchman et al. 2011). Por lo que la temperatura es un factor influyente en el proceso de bioacumulación de HC y puede relacionarse con afectaciones en el desarrollo gonadal. Por tal motivo el objetivo del estudio fue determinar el efecto de la temperatura en la bioacumulación de hidrocarburos en C. virginica, la influencia en la tasa de sobrevivencia y el desarrollo gametogénico.
Materiales y Métodos
Colecta de sedimento
Se colectaron 50 kg de sedimento de la laguna de Tamiahua en la localidad de San Jerónimo, municipio de Tamalín en la zona norte del Estado de Veracruz, México. El área se caracteriza por estar contaminada con hidrocarburos en el ambiente acuático y terrestre. El sedimento se transportó al Laboratorio de Biotecnología Ambiental de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad Veracruzana, donde se evaluó la concentración de hidrocarburos en el sedimento, mediante análisis de detección y cuantificación, de acuerdo con Fernández et al. (2006).
Colecta de organismos
Se obtuvieron de la cooperativa pesquera “Del Puerto de Tuxpan” 100 organismos de C. virginica adultos con medidas entre 80 y 87 mm. Los cuales se transportaron al Laboratorio de Biotecnología Ambiental de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad Veracruzana, donde se realizó el proceso de purga, que consistió en recambios de agua cada 48 h durante 20 d, utilizando agua salobre artificial preparada con agua estéril y sal para acuario. Al finalizar el proceso de purga, se midió la longitud total en mm de cada organismo con un vernier con precisión de 0.1 mm, y se obtuvo peso en g con una balanza digital con precisión de 0.1 g.
Diseño experimental
Se utilizaron recipientes de vidrio de 50 cm de largo, 28 cm de ancho y 30 cm de altura, con capacidad de 50 L. Para regular la temperatura se utilizaron termostatos y motor aireador para acuario, manteniendo los parámetros promedio de oxígeno disuelto (OD) de 7.8 mg L-1 y 30 ppm de salinidad. En cada recipiente se colocaron 15 organismos de C. virginica por 30 d. Con base al promedio anual de temperatura superficial del agua en la laguna de Tamiahua de 26 a 30°C, se evaluaron cuatro tratamientos. Los cuales fueron tratamiento A (sin HC a 26 °C), B (sin HC a 30 °C), C (HC a 26 °C), D (HC a 30°C) y control (sin HC a temperatura ambiente).
Extracción y cuantificación de HC en sedimento
Para determinar la cantidad de HC totales en el sedimento utilizado en los tratamientos, se realizó la extracción y cuantificación del contaminante de acuerdo con la técnica del método de reflujo con el equipo Soxhlet, tomando como referencia los métodos de la Sociedad Estadounidense para Pruebas y Materiales ASTM D5369-93 (ASTM 2005) y de la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos, EPA 3540 C y 3541 (EPA 1994, EPA 1996).
Extracción y cuantificación de HC en Organismos
Se realizó la extracción en cada uno de los organismos al término de la exposición.
Previamente se llevó a cabo la disección para identificar y extraer las gónadas.
Las cuales se fijaron en Buffer Fosfato Salino con paraformaldehido para
histología al 4 % (pH 7.2) hasta su utilización. El resto del organismo se
consideró como tejido blando, el cual se empleo para extraer el hidrocarburo
acumulado. El tejido se secó en una estufa FELISA a 35 °C por 24 h, con la
finalidad de eliminar la humedad y obtener el peso neto de cada organismo. Luego
se maceró hasta lograr una mezcla homogénea, para realizar la extracción con el
método de reflujo en un equipo Soxhlet. La cuantificación de HC se realizó
calculando el porcentaje de extracto obtenido con la fórmula: 
donde: EE=
extracto etéreo, P2= peso del matraz más extracto obtenido,
P1= peso constante del matraz vacío y Pm=
g de muestra (García 2005).
Parámetros biológicos
Se determinó la tasa de sobrevivencia de los organismos utilizando la fórmula:
, donde
TS= tasa de sobrevivencia, la cual se obtuvo a los 15 y 30
d de exposición a los tratamientos.
Análisis histológico
Se llevó a cabo al finalizar el experimento para lo cual se utilizaron las gónadas fijadas en la disección. Las muestras se bañaron en sacarosa en concentraciones de 10 %, 20 % y 30 % a 4 °C por 24 h, o hasta que las muestras descendieron al fondo de los frascos contenedores. Terminado el proceso del baño en sacarosa, se llevó a cabo la inclusión en resina (NEG 50) en microtubos de plástico, manteniéndolos por 24 h a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo se efectuó el proceso de corte utilizando un micrótomo de congelación Microm a 25 °C, realizando cortes transversales de las gónadas con un grosor de 7 µm, los cuales se colocaron en porta objetos esmerilados bañados en poli-L-lisina al 1 %. Para mejorar la apariciencia de la estructura celular se realizó la tinción de los cortes con la técnica de Hematoxilina-Eosina. Los cortes obtenidos se analizaron con ayuda de un microscopio compuesto, mediante el cual se identificó la presencia de gametos sexuales masculinos (espermatogonias) o femeninos (ovocitos) y se determinó la etapa del estadio gametogénico.
Resultados
Contenido de hidrocarburo
La concentración de hidrocarburo en el sedimento fue de 929.29 mg kg-1 de HC, lo que se clasifica como fracción ligera de acuerdo con la Norma Mexicana NOM-138-SEMARNAT/SS-2012. En cuanto al contenido de HC en los organismos el valor más bajo se observó en el tratamiento control con 18 ± 2 mg kg-1 de HC en el 20 % de organismos. Mientras que en los tratamientos A y B se estimaron concentraciones de 25 ± 4.08 y 29 ± 1.83 mg kg-1 de HC, respectivamente. En tanto que en el tratamiento C los organismos presentaron un mayor contenido de HC con 83 ± 3 mg kg-1. Encontrándose la mayor bioacumulación en el tratamiento D con 118 ± 3 mg kg-1. No se encontraron diferencias significativas en el contenido de HC entre el control y los tratamientos sin HC (A, B), mientras que en los tratamientos expuestos a HC (C, D) el contenido de estos compuestos fue significativamente mayor (p<0.05) (Figura 1).
Parámetros biológicos
Los organismos tuvieron una talla promedio de 80 ± 0.3 mm por lo que se consideran adultos. La tasa de sobrevivencia (TS) determinó que el control y los tratamientos A, B y C no mostraron diferencias significativas. Los organismos de estos tratamientos y el control tuvieron el 100 % de sobrevivencia los primeros 15 d. Para el control, y los tratamientos A y C este porcentaje se redujo al 93 % a los 30 d, mientras que para el tratamiento B se obtuvo una TS del 86 %. El tratamiento D, tuvo diferencias significativas (p= 0.04) con el resto de los tratamientos. Este mismo tratamiento mostro una menor TS durante todo el experimento, a los 15 d tuvo una TS del 73 % y disminuyó al 53 % al final del experimento (Figura 2A, 2B).
Desarrollo gonadal y análisis histológico
En los organismos del tratamiento control, A y C se observó el desarrollo de las gónadas sobre el área visceral. Mientras que en los organismos de los tratamientos B y D no se observó desarrollo de gónadas (Figura 3). Los mayores porcentajes de organismos fueron hembras, con porcentajes entre el 64 y 61 % en el control y los tratamientos A y B. Mientras que los organismos machos se encontraron entre el 21 y 28 % en los tratamientos control y A, además de organismos indefinidos con porcentajes entre 7 y 14 %. En los tratamientos C y D predominaron los individuos indefinidos con porcentajes entre el 42 y 75 %, con hembras entre 58 y 25 %, respectivamente (Figura 4). En el control y el tratamiento A se observó que los organismos identificados como hembras se encontraban en la fase de gametogénesis avanzada, en ellos se apreció la poca cobertura de tejido conjuntivo y el desarrollo de folículos con presencia de ovocitos en formación, adheridos a las paredes foliculares. En algunos casos se observaron agrupaciones de folículos anastomosados donde se distinguieron ovocitos en desarrollo. En el caso de los machos se identificaron dos fases; gametogénesis inicial, en la que se observa la presencia de folículos y espermatogonias; y gametogénesis avanzada; con una reducción del tejido conjuntivo y desarrollo de espermatocitos primarios. En los organismos pertenecientes al tratamiento B se identificó la fase de gametogénesis inicial, en los que se apreció una amplia cobertura de tejido conjuntivo donde se desarrollaron folículos en formación en modo de islotes, que carecían de ovocitos adheridos a las paredes foliculares (Figura 5). En el tratamiento C se observaron organismos indefinidos en la etapa de gametogénesis inicial, en lo que el tejido conjuntivo estuvo cubierto de folículos con presencia de ovocitos inmaduros. En el tratamiento D los organismos presentaron una cobertura total de tejido conjuntivo con presencia de células mesenquimatosas, por lo que no se logró definir alguna de las etapas de desarrollo gametogénico, no obstante en casos aislados se determinó la etapa de gametogénesis inicial (Figura 6).
Figura 3. Desarrollo gonadal en los organismos: A) control, B) tratamiento A y C) tratamientos B y D. La flecha señala la gónada.
Figura 4. Porcentajes de sexos identificados en el control y en los diferentes tratamientos. Barra gris oscura corresponde a organismos hembras; barra gris claro a machos y barra negra a organismos indefinidos.
Figura 5. Crassostrea virginica visto al microscopio óptico: A) Hembra del control, gametogénesis avanzada, B) macho del control, gametogénesis avanzada, C) macho del tratamiento A, gametogénesis inicial. tc tejido conjuntivo, ov ovocito, ep espermatocitos, eg espermatogonias. H-E Hematoxilina-Eosina.
Discusión
Los sedimentos contaminados tuvieron una concentración de 929.29 mg kg-1 de HC; valor que es superior a los 440.09 mg kg-1 de HTP en sedimento reportado por San Martin et al. (2012), en la misma área. La diferencia entre ambos valores puede deberse a factores como la topografía y la dirección del flujo del manto freático, además de factores metodológicos como el punto de muestreo seleccionado, lo que indica que hay sitios específicos de mayor contaminación dentro de la misma área. Otros autores han observado que en zonas afectadas por derrames, los niveles de HC se mantienen altos, aún años después del evento (Tronzynski et al. 2004, Kelly et al. 2008). Las concentraciones promedio de HC en los individuos no expuestos del control y los tratamientos A y B al final fueron de 18 ± 2, 25 ± 4.08 y 29 ± 1.83 mg kg-1 de HC, respectivamente, lo que demuestra la capacidad de los organismos de acumular contaminantes y la baja eliminación del mismo durante la purga. La acumulación de contaminantes en diversas especies de ostras puede darse incluso por poco tiempo de exposición y su permanencia en los organismos puede ser residual aún después de la depuración (Kelly et al. 2008).
La acumulación de HC en los individuos fue similar a los 26 y 30 °C, lo cual es concordante con lo descrito por Torres et al. (2012) quienes no encontraron diferencias significativas en los niveles de acumulación en organismos de C. rhizophorae expuestos a concentraciones de hasta 1 406.13 mg kg-1 de HC en dos temporadas del año. Con valores de bioacumulación de 584.33 mg kg-1, valor que es superior a los 118 ± 3 mg kg-1 encontrados en el presente estudio. Estas diferencias se pueden atribuir al grado de contaminación y la biodisponibilidad de los HC (Blasco et al. 1999, Blasco et al. 2003). Pero factores biológicos como la talla y el peso, las diferencias fenotípicas y condiciones fisiológicas y reproductivas pueden estar relacionadas en el monitoreo de la contaminación marina (González-Fernández et al. 2016). La TS y la temperatura son factores importantes, presentándose la mayor mortalidad de organismos a los 30 °C. Mientras que los organismos del control y de los tratamientos no expuestos a HC a 26 °C, tuvieron TS del 93 %, en tanto que los tratamientos no expuestos a HC a 30 °C disminuyeron la TS al 86 %. En los organismos expuestos a HC, se observó que la TS no fue afectada en los tratamientos a 26 °C, los cuales tuvieron la misma TS que los individuos del control y los del tratamiento sin HC. Se ha determinado que la exposición a contaminantes a temperaturas menores de 26 °C se puede mantener sobrevivencias del 100 % (Diniz et al. 2008). La TS fue influenciada de forma negativa por la presencia de HC a 30 °C, observándose la declinación de la misma desde los primeros 15 d del tratamiento. La reducción observada en la TS se puede atribuir a la sinergia entre el contaminante y la temperatura. Al respecto se sabe que la exposición a metales de C. virginica bajo estrés de temperatura se refleja en alta mortalidad (Lanning et al. 2006).
La maduración gonadal de los organismos, fue afectada en los individuos de los tratamientos B, C y D, con efectos mayores en los organismos de los tratamientos C y D, lo que ocasionó un efecto negativo en el desarrollo de gametos sexuales, con daños mayores en los organismos expuestos a 30 °C, lo que ocasionó el poco o nulo desarrollo de las gónadas, y generó en su mayoría organismos indefinidos. Mientras que en el control y el tratamiento A, se observó el crecimiento de las gónadas. Las afectaciones en el desarrollo gonadal de organismos bivalvos se relacionan con la exposición a fuentes de contaminación, como los hidrocarburos (Cuevas et al. 2015). También los individuos del tratamiento B, no expuestos a HC mostraron daños en el desarrollo gonádico. Lo que se atribuye al efecto de la temperatura, debido a que es necesaria una temperatura favorable para el inicio y desarrollo normal de la gametogénesis (Polanco et al. 2002). Al respecto Cuevas et al. (2015) han observado que la severidad de respuesta a la exposición de un agente químico por parte de las ostras depende del grado de exposición al contaminante.
Al analizar de forma histológica las gónadas, se observó que la exposición al tratamiento D no generó ningún tipo de célula anormal o histopatología a nivel gonadal. Al respecto Gold et al. (1995) reportan daños histopatológicos en branquias, tracto digestivo, divertículo digestivo y tejido conectivo en organismos de C. virginica provenientes de lagunas contaminadas con HC y metales pesados. Las fases de gametogénesis fueron establecidas en todos los tratamientos y el control. En específico, para el control y el tratamiento A, la fase de gametogénesis avanzada se observó en organismos hembras apreciándose el desarrollo de ovocitos maduros dentro de los folículos. En el caso de organismos machos las fases inicial y avanzada se detectaron y se observó espermatogonias desarrolladas. En los tratamientos B y C los organismos se encontraban en la fase de gametogénesis inicial. Mientras que en los tratamientos C y D los organismos se clasificaron como indefinidos, caracterizados por una amplia o total cobertura de tejido conectivo sin desarrollo de gametos. El escaso desarrollo gametogénico observado se puede atribuir a la posible transformación de productos tóxicos derivados de la exposición a las altas temperaturas (Bertilsson y Widenfalk 2002). Al respecto algunos autores señalan que la temperatura y la presencia de metales pesados en el medio, afectan de forma negativa las reacciones fisiológicas de los bivalvos (Gordon 2005, Sokolova y Lanning 2008).
Conclusiones
La temperatura no es un factor que favorezca la bioacumulación de HC en C. virginica. No obstante, la combinación de HC y elevadas temperaturas afectan de forma negativa la TS, el desarrollo gametogénico de los organismos y la presencia de organismos indefinidos. Estos resultados dan un panorama de los posibles daños ocasionados ante el aumento de la temperatura y la exposición a los hidrocarburos, lo cual podría afectar la producción.
