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Introducción
En México se reporta una producción anual de melón de 605 mil toneladas, siendo los estados de Coahuila, Michoacán y Guerrero los principales productores, con una participación del 25.2, 16.1 y 15.7% de la producción nacional (SIAP 2016). La pudrición de raíces y tallo en este cultivo ha sido un factor limitante de la producción intensiva, identificándose a Fusarium oxysporum, F. proliferatum y F. solani, como agentes causales de la enfermedad (Chehri et al. 2011, Zhao et al. 2014, El-Amraoui et al. 2015) y en específico a F. oxysporum f. sp. melonis (FOM) (Sebastiani et al. 2017). El hongo FOM es un habitante del suelo que infecta a las plantas penetrando de forma directa o por heridas de las raíces de donde se extiende hasta el xilema; provocando marchitamiento y muerte, además de persistir en el suelo debido a la producción de clamidosporas (Agrios 2005). El control genético de esta enfermedad es el método más estudiado, se han determinado los mecanismos de respuesta de defensa constitutiva o inducida de genotipos de melón a través de observaciones microscópicas, donde se observa el comportamiento de Fusarium en el xilema (Cohen et al. 2015). Para evaluar materiales genéticos por métodos moleculares Van Dam et al. (2017) diseñaron 18 pares de cebadores de PCR, con base a genes efectores candidatos, que discriminan entre siete formas especiales que afectan a cucurbitáceas, lo que permite reconocer los genotipos hospederos de cada una de ellas.
Los fungicidas como benomyl, carbendazim, procloraz, fludioxonil, tebuconazole ó azoxystrobin son los más utilizados para su control, pero en contraparte impactan de forma negativa la biodiversidad del agroecosistema, con efectos nocivos en la salud humana y animal, además de que generan resistencia (Suárez et al. 2011). Se tienen registros de la resistencia a fungicidas (Brent y Hollomon 2007), lo cual no ocurre con el uso de agentes de control biológico, quienes controlan a los fitopatógenos por efecto directo, antibiosis, competencia por nutrientes y espacio, o parasitismo, o bien interfiriendo con los mecanismos patogénicos de la enfermedad y modificando la interacción patógeno-planta, al inducir resistencia adquirida local o sistémica (Bardin et al.2015). Existe una interacción positiva de los microorganismos con plantas cultivadas, al aumentar el crecimiento, rendimiento y suprimir los efectos patológicos (Suárez et al. 2007). Por ejemplo Trichoderma spp. se reporta en tomate (Debbi et al.2018), Bacillus spp. en melón y banano (Cao et al.2011, Xue et al. 2015) y Streptomyces spp. en Andropogon gerardii y Lespedeza capitata (Essarioui et al. 2017). Estas características les confieren a los agentes de control biológico una alternativa eficiente para el manejo de la enfermedad. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue identificar el agente causal de la pudrición radical del cultivo de melón de la región de Paila, Parras Coahuila y evaluar la actividad antagónica de agentes microbianos como manejo y control de esta enfermedad.
Materiales y métodos
Colecta de muestras de la enfermedad
En los meses de junio y julio de 2015, se muestrearon parcelas de melón chino cantaloupe de la localidad de Paila Municipio de Parras de la Fuente, Coahuila (Tabla 1). Se colectaron plantas completas con síntomas de marchitez, necrosis en raíces y tallo, las cuales se colocaron en bolsas plásticas y trasladadas para su procesamiento al laboratorio de Fitopatología del Departamento de Parasitología, de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), en Buenavista, Saltillo, Coahuila, México.
Tabla 1: Sitios de muestreo de Fusarium spp. en parcelas comerciales de la región productora de melón de Paila, Municipio de Parras de la Fuente, Coahuila.
| Localidad | Coordenadas | Muestras | Muestreo | Cepa |
| Rancho Raúl Rivera | 25° 42′ 39.3″ LN | Melón, primera etapa de siembra | Mayo-Junio del 2015 | FRR-1 |
| 102° 00′ 45.5″ LO | ||||
| Rancho La Guadalupana | 25° 42′ 22″ LN | Melón, segunda etapa de siembra | Mayo-Junio del 2015 | FRG-2 |
| 102° 20′ 43″ LO | ||||
| Rancho Adolfo Flores | 25° 45′ 57.8″ LN | Melón, segunda etapa de siembra | Mayo-Junio del 2015 | FAF-3 |
| 101° 59′ 50″ LO | ||||
| Rancho Elena | 25° 45′ 10″ LN | Melón, tercera etapa de siembra | Mayo-Junio del 2015 | FRE-4 |
| 102° 24′ 47″ LO | ||||
| Rancho Feliciano Alarcón | 25° 45′ 20.2″ LN | Melón, primera etapa de siembra | Mayo-Junio del 2015 | FCA-5 |
| 102° 10′ 48.5″ Longitud oeste | ||||
| Rancho Héctor Alarcón | 25° 45′ 39″ LN | Melón, siembra de la temporada pasada | Mayo-Junio del 2015 | FHA-6 |
| 102° 10′ 53″ LO |
Aislamiento e identificación del agente causal
Las raíces colectadas y la parte basal de las plantas se lavaron con agua corriente, se secaron a temperatura ambiente, se cortaron en pequeños trozos de tejido y se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 3 min. Después se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se transfirieron de forma aséptica a cajas Petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), acidificadas con ácido láctico (200 µl L−1). Las placas se incubaron a 28 °C por siete días. En función de los tipos de crecimiento y coloración se recuperaron diferentes aislamientos y transcurridos 10 días se observaron bajo microscopio compuesto las macroconidias características del género Fusarium. De los aislamientos se hizo una suspensión de conidias en agua destilada estéril para obtener esporas aisladas en placas con PDA. Transcurridas 24 h, se transfirieron puntas de hifa en placas con PDA, hasta su desarrollo para observar crecimiento colonial. A partir de los cultivos puros, se tomaron fragmentos de la colonia y se transfirió al centro de cajas Petri con PDA y Synthetischer nährstoffärmer agar (SNA). Las placas inoculadas se incubaron a 28 °C por 15 días, se procedió a realizar observaciones macroscópicas de las cepas crecidas en PDA. De las cepas que se desarrollaron en medio SNA, se hicieron montajes en portaobjetos para observar las características microscópicas del hongo. Para identificar las especies, se usaron las claves taxonómicas de Leslie y Summerell (2006) mediante la observación de la morfología del micelio, fialides, microconidias y macroconidias.
Identificación molecular de Fusarium
Los aislamientos de Fusarium se sembraron en el medio de cultivo PDA y se incubaron por cinco días. La extracción del ADN se realizó mediante el método de Doyle y Doyle (1990), con modificaciones; la extracción se valoró con electroforesis en gel de agarosa al 1%. La amplificación se realizó con el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de las regiones internas transcritas ITS1 e ITS4 entre los genes ribosomales (rDNA) 18S-5.8S y 5.8S-28S utilizando el par de iniciadores de secuencia ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC). La amplificación se realizó, colocando en cada muestra buffer de enzima a 1x, 1 µL; dNTP’s a 0.2 mM, 1 µL; MgCl a 2 mM,0.4 µL; ITS1 a 1 pM, 0.5 µL; ITS4 a 1 pM, 0.5 µL; 0.5 UDO de Taq polymerasa, 0.1 µL; DNA problema ajustado a 50 ng, 1 µL; y 5.5 µL de agua ultrapura estéril para ajustar un volumen final de 10µL. Las condiciones para el termociclador fueron: 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 10 s, 30 ciclos de alineamiento a 57 °C por 30 s, 30 ciclos de extensión a 72 °C por 2 min y 1 ciclo de extensión final a 72°C por 5 min (Ochoa et al, 2012). Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de bandas de in vitro gen (PureLink® Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit), para proceder a su secuenciación directa en ambas direcciones, usando el algoritmo BLAST, las secuencias obtenidas fueron comparadas con las reportadas en la base de datos del banco de genes del NCBI, por sus siglas en inglés. Para la edición del árbol filogenético se hizo la alineación mediante el software Clustal Omega y el gráfico con el programa FrigTree.
Pruebas de patogenicidad de Fusarium
Se realizaron con pruebas in vitro (Sánchez et al. 1975), sumergiendo semillas de melón desinfectadas del genotipo Top Mark (altamente susceptible) en una suspensión de conidios de cada aislamiento (1 x 105 conidias por mL) producidos en PDA. Se incubaron sobre placas con Agar-Agua (AA) a 28 °C, durante siete días. La severidad de la enfermedad se evaluó, mediante la escala: 0 = sin síntomas visibles;1 = puntos necróticos aislados en el hipocótilo; 2 = oscurecimiento en la base del hipocótilo; 3 = lesión necrótica de 1-5 mm en la base del hipocotilo; 4 = lesión necrótica de 6-10 mm en la base del hipocótilo; 5 = lesión necrótica mayor a 11 mm en la base del hipocótilo.
Tratamientos evaluados
Los microorganismos antagónicos evaluados fueron: Bacillus liquefaciens (BIF), B. amyloliquefaciens (BCC), B. subtillis (BSK), Trichoderma asperellum (TA), T. harzianum (TH2), T. viride (TV), Streptomyces longisporoflavus, (SL), S. mutabilis (SM), S. griseus (SG) y Streptomyces sp. (SSP), provenientes del cepario del Departamento de Parasitología de la UAAAN. El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar, con 78 tratamientos y cinco repeticiones. La unidad experimental consistió en una placa de Petri y la variable a medir fue el diámetro de crecimiento del hongo.
Bioensayo
La actividad inhibitoria de las 10 especies mencionadas anteriormente se evaluó por separado con seis aislamientos de Fusarium. En el caso de Trichoderma se realizó mediante la técnica de Cherif y Benhamou (1990), que consistió en depositar en un extremo de la caja Petri un explante PDA de 5 mm de diámetro con micelio de Fusarium de ocho días de edad y en el otro extremo de la caja se depositó un explante de 5 mm de las diferentes especie de Trichoderma, incubándose a 28 °C por 12 h. Después, se midió el crecimiento radial de Fusarium cada 24 h, para lo cual se utilizó un Vernier digital. Para medir el antagonismo de Bacillus y Streptomyces se utilizó el método de confrontación, en este caso la especie antagonista a evaluar se inoculó en los cuatro puntos cardinales de cada placa con medio de cultivo PDA y colocando al centro de la misma un explante de 5 mm de diámetro de Fusarium. Las placas se incubaron a 28 °C, la medición de la capacidad inhibitoria se realizó con un Vernier digital, tomando el diámetro del crecimiento fúngico (mm) en los dos puntos cardinales referentes a la inhibición. Posteriormente se determinó el porcentaje de inhibición mediante la fórmula: Porcentaje de inhibición = ((DCC-DCT) * 100) / DCC, donde: DCC = Diámetro de la colonia control, y DCT = Diámetro de la colonia tratada.
Resultados
Aislamiento e identificación de Fusarium
Se aislaron seis hongos, que tuvieron características típicas de Fusarium (Tabla 2). El crecimiento caracteristico de F. solani (FRR-1, FRG-2 y FCA-5) mostró pigmentación blanca y beige en medio sólido PDA (Figura 1), al microscópio se observaron microconidias en fialides largas, agrupadas en falsas cabezas, de forma oval a elíptica, mono y bicelulares, las macroconidias presentaron células apicales y basales redondeadas de tres a cinco septos. F. oxysporum (FAF-3, FRE-4 y FHA-6), presentó micelio algodonoso, coloracíon café y violeta rosáceo, microscópicamente se encontraron microconidias unicelulares y bicelulares, de forma ovoide a elipsoide, en fialides cortas agrupadas en falas cabezas y macroconidias con las células apicales ligeramente curvadas, células basales truncas con tres a cinco septos.
Tabla 2: Similaridad de las secuencias de nucleótidos de los aislamientos Fusarium spp. obtenidos de la región de Paila, comparadas con la base de datos del NCBI.
| Aisladow | Especie | Nucleotidosx | No. de accesoy | ISz |
| FRR-1 | F. solani | 421 | KU883630 | 100% |
| FRG-2 | F. solani | 477 | KU325529 | 98% |
| FAF-3 | F. oxysporum | 429 | KU097274 | 98% |
| FRE-4 | F. oxysporum | 475 | KU097274 | 97% |
| FCA-5 | F. solani | 432 | KU325529 | 99% |
| FHA-6 | F. oxysporum | 450 | KT366736.1 | 97% |
x = Número de nucleótidos de la secuencia comparada, y = Índice de similaridad de la secuencia comparada con las bases de datos, y z = Número de acceso en la base de datos del NCBI.
Se corroboró la identidad de las mismas, a través de la técnica de ITS-PCR, obteniendo productos amplificados de aproximadamente 500 pb (Figura 2), resultando los aislamientos FRR-1, FRG-2 y FCA-5 como la especie Fusarium solani y los aislamientos FAF-3, FRE-4 y FHA-6 como Fusarium oxysporum, con un porcentaje de identidad del 97 al 100% (Figura 3).
Figura 2: Gel de extracción de ADN de aislamientos de Fusarium (A). Gel de agarosa de productos de PCR obtenidos a partir de ADN de aislados de Fusarium utilizando ITS1 e ITS4 (B).
Pruebas de patogenicidad
Se determinó que las cepas identificadas como FRR-1, FRG-2 y FCA-5, de Fusarium solani, fueron altamente patogénicas ubicándose en la escala de severidad en el nivel 5, al igual las cepas FAF-3 y FRE-4 de Fusarium oxysporum, mientras que la cepa FHA-6 se situó en el nivel 4 y el testigo no presentó daños visibles (Figura 4).
Actividad antagonista
El porcentaje de inhibición entre microorganismos evaluados in vitro (Tabla 3), muestran que Trichoderma asperellum, fue el que presentó mayor efectividad biológico contra los distintos aislamientos de Fusarium aisladas de melón, alcanzando porcentaje de inhibición del 54.9 al 74.1%, seguido de T.harzianum con antagonismo del 54.9 al 64.7%. El aislamiento FHA-6 de F. oxysporum, fue el que presentó mayor susceptibilidad y FRR-1, identificada como F. solani, mostró menores porcentajes de inhibición a las diferentes especies de Trichoderma. En las evaluaciones con Bacillus spp., se encontró que B. amyloliquefaciens presentó los niveles más altos de control, con niveles del 37.8 al 55.2% en los aislamientos FAF-3 y FHA-6, respectivamente Los menores porcentajes de inhibición fueron en el aislamiento FCA-5, del 28.2 y 34.6%, con B. liquefaciens y B. subtillis, y FAF-3 con 37.8% en B. amyloliquefaciens (Tabla 3). Al evaluar las cuatro especies de Streptomyces como alternativa de control in vitro, se encontró bajos niveles de actividad contra las especies de este fitopatógeno. S. mutabilis alcanzó los mayores efectos antagonistas con 35.5% de inhibición contra el aislamiento FHA-6, la más susceptible, y S. longisporoflavus el controlador que presentó los niveles más bajos de antagonismo. La inhibición promedio más alta con respecto a los seis aislamientos de Fusarium se obtuvo que las tres especies de Trichoderma que mostraron porcentajes de inhibición del 62.4 al 54.8%, seguido de Bacillus spp. en un rango de 44.5 al 36.9% y Streptomyces spp. de 23.6 al 1.1% (Figura 5).
Tabla 3: Porcentaje de capacidad antagónica de diferentes organismos biológicos contra cepas de Fusarium spp.
| *Cepas de Fusarium spp. | ||||||
| Organismos antagónicos | FRR-1 | FRG-2 | FAF-3 | FRE-4 | FCA-5 | FHA-6 |
| B. liquefaciens | 46.9 Ax ba y | 38.4 B abc | 31.4 BC bc | 34.8 CD bc | 28.2 CD c | 41.6 DE ab |
| B. amyloliquefaciens | 51.4 AB ab | 38.9 B c | 37.8 B c | 42.9 BC bc | 41.2 BC bc | 55.2 C a |
| B. subtillis | 45.7 B a | 38.6 B a | 37.2 B a | 42.4 B ca | 34.6 C a | 46.4 D a |
| T. asperellum | 57.2 A b | 61.5 A ab | 64.3 A ab | 62.3 A ab | 54.9 A b | 74.1 A a |
| T. harzianum | 54.9 AB b | 55.4 A b | 56.1 A ab | 60.5 A ab | 57.9 A ab | 64.7 B a |
| T. viride | 49.8 A ba | 58.3 A a | 54.9 A a | 51.1 A ba | 50.3 BC a | 64.7 B a |
| S. mutabilis | 19.8 C bc | 27.5 B ab | 21.5 CD bc | 21.0 D ebc | 16.4 DE c | 35.5 E a |
| S. griseus | 3.7 D a | 4.3 C a | 2.4 E a | 5.2 F a | 4.4 EF a | 3.4 F a |
| S. longisporoflavus | 0.7 D a | 0.2 C a | 2.2 E a | 2.0 F a | 0.6 F a | 0.8 F a |
| Streptomyces sp. | 8.0 D b | 4.8 C b | 12.9 D ab | 16.3 E a | 6.2 EF b | 5.1 F b |
x = Letras mayúsculas indican comparación por columna, y = Letras minúsculas indican comparación por fila, porcentajes de inhibición con diferentes letras representan diferencias (p ≤ 0.05).
Discusión
Las especies F. oxysporum y F. solani son los agentes causales de la pudrición de raíces y tallos en el cultivo de melón, lo que coincide con investigaciones realizadas previamente (Chehri et al. 2011, Seo y Kin 2017). En la presente investigación, las tres especies de Trichoderma alcanzaron niveles del 49 al 74% de inhibición, valores que son similares a lo reportado por García (2015) y El-Komy et al. (2015) quienes reportan hasta el 72% de inhibición del crecimiento de Fusarium spp. En este contexto Yanet y Cabrales (2016) en evaluaciones in vitro, encontraron que dos cepas de T. asperellum y una de T. longibrachiatum, confrontadas con diferentes cepas de Moniliophthora roreri, al sexto día lograron el 100% de antagonismo y concluyeron una manifestación microscópica de micoparasitismo sobre los fitopatógenos. Al respecto, Song et al. (2014) reportan que B. amyloliquefaciens inhibe un 85% el crecimiento de Fusarium, aislado del cultivo de ginseng (Panax ginseng Meyer). Se tiene evidencia que la bacteria B. velezensis produce tres compuestos de lipopéptidos (surfactina, iturina y fenginina), que son responsables de una fuerte actividad antagonista, contra F. oxysporum f. sp. cubense y F. oxysporum f. sp. cucumerinum (Cao et al. 2018), y además son promotoras del crecimiento vegetal, y forman esporas que son fáciles de formular y conservar hasta su inoculación (Pila 2016, Khan et al. 2017). Para el caso de S. mutabilis, Thakur et al. (2007) y Pérez et al. (2015) al evaluar Streptomyces spp. Contra Fusarium encontraron bajos porcentajes de antagonismo, lo que concuerda con la variabilidad inhibitoria que se observó en este trabajo (Figura 6). La lentitud en el desarrollo del crecimiento de las especies de Streptomyces en medios de PDA pudiera ser el punto limitante por el que existe baja actividad de estas bacterias in vitro, ya que es común que el fitopatógeno se desarrolle más rápido que Streptomyces, de ahí la baja actividad antagónica (Dávila et al. 2013). Al respecto Kanini et al. (2013) reportan que la especie Streptomyces rochei, aislada de la rizósfera de la planta Pinus brutia, tienen potencial para inhibir el crecimiento in vitro de Fusarium oxysporum, aislado del cultivo de tomate, mientras que Martínez et al. (2017) mencionan que los actinomicetos tienen actividad inhibitoria en el crecimiento de fitopatógenos del cultivo del chile.
Conclusiones
Se aisló e identificó a las especies Fusarium oxysporum y F. solani como agentes causales de la pudrición de raíces y tallos en el cultivo de melón. Ambas especies fueron susceptibles al antagonismo in vitro de Trichoderma asperellum y Bacillus amyloliquefaciens, en porcentajes de capacidad inhibitoria que requieren evaluarse en condiciones de campo para el control de la enfermedad. Mientras que las especies de Streptomyces no presentaron efectividad biológica para Fusarium.
