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Introducción
El cultivo de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.), es un producto de importancia económica, debido a su consumo fresco y como materia prima para la elaboración de productos industriales. Tradicionalmente su manejo agronómico se basa en el uso de fertilizantes de origen químico, así como en el control de plagas y enfermedades (Castillo-Aguilar et al. 2015). Un manejo de cultivo con menor impacto ambiental podría lograrse con el uso de microorganismos rizosféricos, que son benéficos para las plantas; por ejemplo, varias especies de Bacillus son rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (RPCV). Dentro de los mecanismos involucrados en la promoción del crecimiento vegetal, se encuentra la producción de fitorreguladores como las auxinas; principalmente el ácido indolacético (AIA). El AIA induce la deformación y el aumento de pelos radicales logrando mayor captación de nutrientes, promoviendo el crecimiento y el rendimiento de los cultivos (Park et al. 2005). Al respecto Bacillus produce AIA en niveles de entre 3.1 y 21.6 µ mL-1 a las 16 h de incubación (Ji et al. 2014), lo que permite considerarlos como potenciales RPCV. Se ha observado que B. subtilis aumenta el porcentaje de emergencia y promueve el crecimiento de la planta de tomate (Cabra-Cendales et al. 2017) y el crecimiento de chile (Peña-Yam et al. 2016).
Las RPCV tienen la capacidad de inducir mecanismos de resistencia sistémica inducida (RSI), que depende de la señalización de ácido jasmónico y etileno, y la resistencia sistémica adquirida (RSA) mediada por el ácido salicílico, cuya acción principal se refleja en la disminución de síntomas de las enfermedades (Samaniego-Gámez et al. 2017). En el caso de Bacillus las evidencias indican que puede activar la RSI, B. cereus activa mecanismos de RSI y RSA en Arabidopsis thaliana por medio de la señalización simultánea del jasmonato y el etileno, y la activación de la ruta del ácido salicílico (Niu et al. 2011). Por otra parte, Bacillus también induce acumulación de proteínas relacionadas con patogénesis (PR), en ensayos enzimáticos en remolacha tratada con B. mycoides incrementó la actividad de las proteínas PR, como las quitinasas, β-1, 3-glucanasas y peroxidasas, lo que es un indicador de resistencia sistémica (Bargabus et al. 2002). Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de tres aislados nativos de Bacillus como promotores del crecimiento en plántulas de chile habanero y determinar su efecto en la actividad enzimática de las glucanasas.
Materiales y métodos
Microorganismos utilizados
Se utilizaron cinco cepas de Bacillus aisladas de muestras de suelos en el estado de Yucatán, México. Las bacterias se resembraron en agar nutritivo (AN) y se verificó las características de la clase Bacilli, morfología de forma bacilar, Gram positivas, formación de esporas y reacción catalasa positivo.
Producción de ácido indolacético
Se determinó la producción de auxinas, como equivalente de ácido indolacético (AIA) de cinco aislados de Bacillus spp., las bacterias se cultivaron en caldo nutritivo (CN) suplementado con L-triptófano a una concentración final de 1 mg mL-1, a 30 °C y 200 rpm durante 72 h. Posteriormente, se recuperó el sobrenadante cada 24 h por centrifugación a 10 000 rpm durante 15 min. Al sobrenadante obtenido se le cuantificó la producción de AIA utilizando el reactivo de Salkowski (98.5 mL de H2SO4 y 1.5 mL de 0.5 M FeCl3). A 1 mL del sobrenadante se le adicionó 2 mL del reactivo y se incubó en condiciones de obscuridad a temperatura ambiente durante 30 min (Meudt y Gaines 1967). Se realizaron tres repeticiones por aislado bacteriano. La concentración se determinó en un espectrofotómetro UV-VIS a una longitud de onda de 535 nm utilizando una curva estándar de AIA.
Pruebas de germinación de semillas de chile habanero
Para la prueba de germinación, las semillas se sumergieron en 2% de HClO4 durante 3 min seguido de tres lavados con agua destilada estéril. Las semillas se inocularon con la suspensión de cada aislado bacteriano (1 x 108 UFC mL-1) y se mantuvo en agitación a 120 rpm durante 1 h, se retiró y dejó secar. Se utilizaron tres aislados bacterianos y un testigo sin inoculación bacteriana que consistió de solución salina estéril. Posteriormente, se colocaron 20 semillas en cajas Petri de 90 x 15 mm con papel filtro humedecido con agua destilada estéril, considerando 10 repeticiones por tratamiento y la caja como la unidad experimental. Con el conteo de semillas que presentaron protrusión se calculó el porcentaje de germinación, tiempo medio de germinación y la velocidad media de germinación de acuerdo con Ranal et al. (2009). Los tratamientos se distribuyeron bajo un diseño completamente al azar, para el análisis de los datos los resultados en porcentaje se transformaron con la formula arcoseno x /100.
Promoción de crecimiento en chile habanero
Para las pruebas de promoción del crecimiento, las semillas de chile habanero se inocularon por inmersión en una suspensión de bacteriana (1 x 108 UFC mL-1) a 30 °C y 120 rpm durante 1 h. Las semillas inoculadas se sembraron en charolas de poliestireno de 200 cavidades con una mezcla estéril de suelo y cosmopaet (50:50), a los 30 días se determinó el diámetro del tallo, altura de la planta, biomasa seca y el área foliar con un Medidor de Área Li-Cor 3100. Posteriormente, las plántulas se trasplantaron de forma individual en vasos de poliestireno de 900 mL que contenía 120 g de la mezcla de suelo y cosmopaet (50:50), realizando una segunda inoculación en la base del tallo de la plántula con 5 mL de suspensión bacteriana (1 x 108 UFC mL-1). Como testigo se utilizaron plántulas sin inoculación bacteriana, en todos los tratamientos se utilizaron cinco repeticiones. Estas plantas se utilizaron para determinar los índices de calidad y la producción de B-glucanasas.
Índice de calidad
Para integrar los valores obtenidos en el crecimiento de las plantas, a los 45 días después del trasplante se determinó el Índice de Calidad de Dickson (ICD) calculado como el cociente entre el peso seco total y la sumatoria del índice de esbeltez (IE, cociente entre la altura y el diámetro del tallo), y el peso seco aéreo/peso seco radical (Dickson et al. 1960).
Determinación de actividad B-glucanasas
El contenido de proteínas y la actividad enzimática de glucanasas en las plántulas de chile habanero se realizó a las 24 y 72 h después de la segunda inoculación. Para la extracción del extracto proteico se utilizó 1 g de hojas frescas que se maceró con nitrógeno líquido, adicionando 2 mL del amortiguador de extracción (0.1 M de acetato de sodio, pH 5.2) (Rodríguez et al. 2004). El macerado se centrifugó a 14 000 rpm por 10 min a 4 °C y se recuperó el sobrenadante. La actividad de la β-1,3-Glucanasa se determinó con la medición de azucares reductores con 1% de laminarina como sustrato (Abeles y Forrence 1970), se utilizó 100 pL de sustrato a un volumen final de 500 pL en 0.05 M de citrato de sodio pH 5.0. Para el blanco el extracto se incubó a baño maría a 100° C durante 5 min. Las muestras se incubaron a 37° C, por 1 h. Posteriormente, se determinaron azúcares reductores (Miller et al. 1959), agre gando 1.5 mL de DNS (ácido 3, 5-dinitrosalicilico), las muestras se colocaron a baño maría a ebullición por 5 min y se enfriaron en hielo. Se leyó la absorbancia a 492 nm y la concentración se calculó con una curva estándar de glucosa. La cuantificación de proteínas se realizó por el método de Bradford (1976) utilizando como curva estándar albumina sérica bovina. Una unidad de actividad enzimática (UE) se expresó como µmol de glucosa producido por mg-1 de proteína. Se utilizó un diseño completamente al azar, los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza (ANAVA) y pruebas de comparación de medias de Tukey (α = 0.05).
Resultados y discusión
Se utilizaron cinco cepas de Bacillus, las cuales produjeron AIA entre 4.84 y 8.59 pg mL-1 (Tabla 1). Los aislados CBRF12, CBCC57 y CBRF5 fueron los que mostraron mayor producción de AIA. La producción de AIA se observó desde las 24 h de incubación, en donde se mantuvo de forma constante, sin embargo, en el caso del aislado CBRF5 se observó una disminución significativa a las 72 h con relación a las 48 h. Los valores obtenidos están dentro del rango reportado para cepas de Bacillus (Luna et al. 2013). El AIA es uno de los metabolitos secundarios producidos por bacterias y es abundante durante la fase estacionaria del crecimiento celular (Wahyudi et al. 2011), la producción de AIA se detectó desde las 24 h de incubación, este tiempo puede ser suficiente para estudios preliminares en la detección de Bacillus productores de AIA. La producción de AIA es un indicador del potencial de las rizobacterias como promotores de crecimiento, ya que estimula el desarrollo del sistema radical de la planta hospedera (Patten y Glick 2002).
Tabla 1: Cuantificación de ácido indol acético producido por aislados de Bacillus spp. en medio agar nutritivo suplementado con L-triptófano.
| Aislado | Ácido indolacético (µg mL-1) | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| CBRF12 | 7.95 ± 0.55 a | 8.59 ± 0.27 a | 7.83 ± 0.73 a |
| CBCC57 | 7.05 ± 0.98 a | 8.36 ± 1.86 a | 7.57 ± 1.51 a |
| CBRM19 | 4.91 ± 0.47 b | 4.90 ± 0.09 b | 5.20 ± 0.07 b |
| CBMT2 | 4.84 ± 0.83 b | 4.73 ± 0.13 b | 4.13 ± 0.32 b |
| CBRF5 | 6.66 ± 0.11 a | 6.77 ± 0.29 ab | 5.93 ± 0.42 ab |
Medias con letras iguales en la misma columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).
El porcentaje de germinación fue significativamente mayor en las semillas inoculadas con el aislado CBRF12 y el testigo, comparado con lo observado en las semillas tratadas con los aislados CBCC57 y CBFRF5 en los que se detectó disminución del porcentaje de germinación. La inoculación con CBRF12 mostró menor tiempo de germinación y mayor velocidad de germinación en comparación con la inoculación de los aislados CBCC57 y CBFRF5 (Tabla 2). Al respecto, Luna et al. (2013) reportan que la aplicación de Bacillus sp. MA06 en pimiento aumentó el porcentaje de germinación en un 8.0%, pero tres cepas de Bacillus no mostraron diferencia significativa con relación a las semillas sin inocular. Mientras que Díaz-Vargas et al. (2001) reportaron el efecto de rizobacterias en la germinación de semillas de lechugas, incrementando la germinación el 76.6% de las cepas, 10% no tuvieron efecto y 13.3% la redujeron, por lo que las rizobacterias podrían tener otros mecanismos o metabolitos que afecten la germinación de semillas. En tanto que Wahyudi et al. (2011) reportan que las cepas de Bacillus spp. productoras de AIA podrían tener efectos negativos en la germinación de semillas, debido a la complejidad de la interacción entre la bacteria productora de AIA y el proceso de germinación, lo que puede dar estos resultados diferenciales en la germinación de semillas por la aplicación de rizobacterias. Al respecto, Shu et al. (2016) mencionan que el balance entre giberelinas y ácido abscísico determina principalmente la inducción de la germinación de semillas y que el AIA inhibe la germinación al reprimir la acción del ácido giberélico (AG). Por lo que coinciden los resultados de inhibición de la germinación observados con los aislados CBCC57 y CBFRF5. Esto puede deberse, a que las semillas no latentes como las utilizadas en este estudio (93% de germinación en el testigo), responden de manera diferente a la presencia de con centraciones externas de AIA y otros reguladores de crecimiento vegetal. Sin embargo, las pruebas de geminación nos permiten seleccionar cepas que no afecten de forma negativa este proceso y presentar un efecto posterior a la germinación de semillas.
Tabla 2: Efecto en la germinación de semilla de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
| CEPAS | G (%) | 𝑡 (d) | 𝑣 (d-1) |
| CBCRF12 | 96.5 ± 4.1 a | 5.86 ± 0.44 c | 0.172 ± 0.013 a |
| CBCC57 | 67.0 ± 15.1 b | 7.16 ± 0.77 ab | 0.141 ± 0.015 bc |
| CBFR5 | 44.0 ± 15.6 c | 7.37 ± 0.42 a | 0.136 ± 0.008 c |
| Testigo | 93.5 ± 8.5 a | 6.52 ± 0.81 bc | 0.155 ± 0.018 b |
G= germinación, 𝑡 = tiempo medio de germinación, 𝑣 = tasa media de germinación, Medias con letras iguales en la misma columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).
En los ensayos de promoción de crecimiento a nivel de plántulas de chile habanero, se observó diferencia significativa (p < 0.05) entre los tratamientos, los aislados CBCC57 y CBRF12 promovieron el crecimiento en altura de planta y área foliar. Para la producción de biomasa seca se observó efecto signi ficativo en el aislado CBCC57 con respecto al testigo (Tabla 3). Al respecto, Kokalis-Burelle et al. (2002) encontró que la formulación LS256 (Bacillus subtilis GBO3 y B. pumilis INR7) promovió el crecimiento del tallo, raíz y parte aérea en plántulas de chile. Con respecto al aislado Bacillus CBCC57 se observó un incremento del 33% en peso seco.
El índice de calidad de Dickson, es un parámetro que combina información del índice de es beltez y la relación parte aérea y raíz con el peso total de la planta, por lo que un mayor índice representa plantas de mejor calidad (Díaz et al. 2013). En los aislados CBCC57 y CBRF12 que tuvieron un índice de Dickson mayor al testigo, indica que estos aislados promovieron el crecimiento (Tabla 3). Por lo que los índices de calidad podrían dar una estimación más confiable para determinar el efecto de bacteria en la promoción de crecimiento, ya que el peso fresco de la planta es impreciso (Huang et al. 2017). En la determinación de B-glucanasas, no se observaron diferencias significativas entre las plántulas inoculadas con Bacillus spp. y las plántulas testigos. Pero se observó un aumento significativo en la actividad enzimática de glucanasas con la inoculación del aislado CBCC57 en comparación con los aislados CBRF5 y CBRF12, a las 24 y 72 h después de la segunda inoculación (Tabla 4). Se tuvo mayor cambio en la glucanasas en los aislados CBCC57 y CBFRF5 entre las 24 y 72 h, al respecto Seo et al. (2012) indica que las enzimas PR tienen variación con el tiempo. La inoculación de Bacillus modifica la actividad de las enzimas PR en diferentes cultivos, incrementó la actividad de glucanasas en remolacha (Bargabus etal. 2002). Mientras que Neher etal. (2009) observaron que Bacillus mycoides indujo un 105% la actividad de las quitinasas y un 135% la glucanasas en pepino.
Tabla 3: Variables de crecimiento e índice de calidad en plántulas de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
| Cepa | DT (mm) | AP (cm) | AF(cm2) | BS (mg) | IE | ICD1 |
| CBCRF12 | 1.84 ±0.05 a | 3.60 ± 0.07 ab | 6.19 ± 0.59 a | 52.5 ± 8.13 ab | 4.35 ± 010 ab | 0.53 ± 0.07 a |
| CBCC57 | 1.86 ± 0.19 a | 3.66 ± 0.21 a | 5.72 ± 0.49 a | 56.14 ± 9.80 a | 4.50 ± 0.36 a | 0.55 ± 0.05 a |
| CBFR5 | 1.56 ± 0.09 b | 3.56 ± 0.18 ab | 5.23 ± 0.55 ab | 47.68 ± 8.06 ab | 3.52 ± 0.51 c | 0.24 ± 0.04 b |
| Testigo | 1.68 ± 0.08 ab | 3.26 ± 0.33 b | 4.42 ± 0.54 b | 42.00 ± 3.92 b | 3.96 ± 0.27 bc | 0.30 ± 0.06 b |
Diámetro del tallo (DT), Altura de la planta (AP), Área foliar (AF), Biomasa seca (BM), Índice de esbeltez (IE), Índice de calidad de Dickson (ICD). Medias con letras iguales en la misma columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05), 1(Kruskal-Wallis, 0.05).
Tabla 4: Actividad de B-glucanasas en plántulas de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
| Actividad enzimática B-glucanasas (UE mg proteína-1) | |||
| Cepa | 24 h | 72 h | |
| CBRF12 | 8.41 ± 0.23 b | 7.25 ± 1.94 b | |
| CBCC57 | 12.82 ± 0.19 a | 10.52 ± 0.11 a | |
| CBRF5 | 9.15 ± 0.93 b | 6.98 ± 0.84 b | |
| Testigo | 10.36 ± 1.76 ab | 8.36 ± 0.58 ab | |
Medias con letras iguales en la misma columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).
De acuerdo con los resultados obtenidos los aislados CBRF12 y CBCC57 (Bacillus) son bacterias productoras de AIA, aunque no incrementan de forma significativa el porcentaje y tiempo de germinación, tienen un efecto en el crecimiento de chile habanero en altura de la planta, área foliar y biomasa seca, por lo que la inoculación con Bacillus mejora la calidad de las plántulas, pero se requieren estudios a nivel de campo para valorar el efecto en el desarrollo y producción de chile habanero.
