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INTRODUCCIÓN
Las lactonas macrocíclicas (LM) son ampliamente usadas en la ganadería bovina para el control de endo y ectoparásitos (Rodríguez-Vivas et al. 2019a, Pérez-Cogollo et al. 2018). Estos endectocidas se dividen en tres familias, a) avermectinas (ivermectina, doramectina, eprinomectin), b) milbemicinas (moxidectina) y c) espinosinas (spinosad), siendo la ivermectina (IVM) y la moxidectina (MOX) las más utilizadas en la ganadería bovina. Una vez administrada al bovino, tanto la IVM como la MOX se eliminan en las heces conservando su actividad insecticida (Prichard et al. 2012). Numerosos estudios han demostrado que las heces de bovinos tratados con IVM o MOX tienen efectos letales (mortalidad) y subletales sobre diferentes especies de escarabajos estercoleros (EE), como Euoniticellus intermedius (Reiche) (Krüger y Scholtz 1997), Aphodius constans (Duftschmid) (Errouissi et al. 2001), Copris ochus (Motschulsky), C. acutidens Motschulsky, y Caccobius jessoensis Harold (Iwasa et al. 2007) y Onthophagus landolti Harold (Pérez-Cogollo et al. 2017). Recientemente, Rodríguez-Vivas et al. (2019a) encontraron que las heces de bovinos tratados con MOX al 10% tienen efectos subletales sobre Onthophagus landolti.
Los EE son uno de los grupos más importantes dentro de los ensambles asociados al estiércol, debido a su número de especies y abundancia, así como los servicios que brindan al agroecosistema de los pastizales al degradar el estiércol y al incorporarlo al suelo (Steinfeld et al. 2006, Nichols et al. 2008). El uso de LM en la ganadería bovina podría conducir a reducciones en las densidades poblacionales de EE, especialmente si los tratamientos coinciden con el período de reproducción de estos insectos, cuando los estadios más sensibles (en general huevos y/o larvas) entran en contacto y/o consumen el estiércol que contiene residuos de estos endectocidas (Errouissi y Lumaret 2010, Pérez-Cogollo et al. 2018). Esta reducción poblacional podría repercutir sobre los procesos de degradación del estiércol bovino de la superficie de las praderas a largo plazo, lo que implica alteración de los servicios ecológicos que estos insectos realizan y que son esenciales para la sustentabilidad de la ganadería (Dadour et al. 1999, Lee y Wall 2006, Steinfeld et al. 2006).
Canthon indigaceus chevrolati Harold es una especie importante en la degradación del estiércol bovino ya que es un escarabajo que rueda su bolanido para poner un huevo en ella y enterrarla en el suelo (Martínez y Cruz 1990). Esta especie es de amplia distribución en climas tropicales ya que soporta altas temperaturas, insolación directa y baja humedad (Martínez y Montes de Oca 1994, Morón 2003), es abundante en pastizales ganaderos (Basto-Estrella et al. 2014) y contribuye notablemente a la incorporación del estiércol al suelo (Basto-Estrella et al. 2016). Recientemente, Rodríguez-Vivas et al. (2019b) reportaron que C. i. chevrolati es una especie fuertemente atraída a las heces de bovinos tratados con IVM, lo que podría ser negativo para su sobrevivencia y reproducción. Por tal motivo, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto letal y subletal del estiércol de bovinos tratados con IVM (1% y 3.15%) o MOX (1% y 10%) sobre C. i. chevrolati.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tratamiento de animales y recolección de heces
Para los experimentos, se conformaron cuatro grupos de tres vacas cruzas de Bos taurus × Bos indicus seleccionadas al azar para su asignación a cada grupo. Ninguna de las vacas había recibido tratamiento antiparasitario cuatro meses antes del comienzo del experimento y no se encontraban en etapa de lactancia. Dos grupos recibieron una dosis única de MOX y dos grupos recibieron una dosis única de IVM todos por inyección subcutánea en la región del cuello como se describe a continuación: Grupo 1, tres vacas con peso promedio de 552.7 kg fueron tratadas con MOX-1% solución inyectable (Cydectin NF® . Lote No. 019/16) a dosis de 0.2 mg kg-1 p.v. Grupo 2, tres vacas con peso promedio de 559.1 kg tratadas con MOX-10% solución inyectable (Cydectin Onix® No. 002/15) a dosis de 1.0 mg kg-1 p.v. Grupo 3, tres vacas con peso promedio de 548.7 kg tratadas con IVM-1% solución inyectable (Ectosin mp® lote A117308) a dosis de 0.2 mg kg-1 p.v., y Grupo 4, tres vacas con peso promedio de 560.3 kg tratadas con IVM-3.15% solución inyectable (Ivomec Gold® Lote BD164/16) a dosis de 0.63 mg kg-1 p.v.
Todos los animales pastorearon en el rancho bovino del Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Yucatán (CCBA-UADY), México (20° 51’ 49" LN, 89° 37’ 12" LO). El rancho está dedicado a la cría semiintensiva de ganado bovino de doble propósito cuya alimentación principal es a base de pastos Cynodon plectostachyus-Cynodon nlemfuensis, cortes de Leucaena leucocephala y agua ad libitum.
Para evitar que las muestras fecales recolectadas de los animales de los grupos se mezclen o contaminen con tierra, plantas u invertebrados coprófilos, los bovinos de cada grupo se colocaron cada mañana en corrales limpios con piso de cemento y separados. Las heces de ambos grupos (15 kg/día/grupo) se recolectaron del suelo después de la defecación entre las 8 y 10 horas, en los días -1, 5 y 14 postratamiento (DPT). Las heces se colectaron manualmente y homogeneizaron durante 10 minutos y almacenaron a -20 °C durante al menos tres semanas antes de su uso con el objetivo de mantenerlas viables para el consumo de los escarabajos y para evitar la sobrevivencia de otros invertebrados coprófilos que hayan podido contaminar el excremento durante la colecta. Las heces colectadas el día -1 se usaron como grupo control en los bioensayos.
Obtención de los escarabajos para el bioensayo
Los bioensayos se realizaron con base en los protocolos modificados de Pérez-Cogollo et al. (2017) y Rodríguez-Vivas et al. (2019b). Para lo cual se recolectaron 1 000 individuos de la especie C. i. chevrolati en los potreros de un rancho de la zona ganadera del municipio de Tizimín, Yucatán, México (21° 15’ 8.44” LN, 88° 6’ 4.65” LO), dedicado a la cría semi-extensiva de ganado bovino cuya alimentación principal es con pastos de las especies Urochloa brizantha y Megathyrsus maximus y no se usa LM para el control de parásitos. La colecta se realizó en el momento en que una pareja (macho/hembra) se encontraba rodando una bola de estiércol, ya que se considera que son un macho y una hembra sexualmente maduros para que al llevarlos al laboratorio comiencen a nidificar en 3 a 4 días (Montes de Oca et al. 1991, Martínez y Montes de Oca 1994).
Los EE recolectados se transportaron al laboratorio del CCBA-UADY, en donde cada individuo fue limpiado, sexado y valorado físicamente. Posteriormente, en grupos de tres parejas se colocaron en terrarios de plástico cilíndricos transparentes de 8 cm en el diámetro en la base x 11 cm en el diámetro de la boca x 14.5 cm de altura, tapados con una malla fina para permitir la ventilación. A cada terrario se le añadió 500 g de tierra tamizada y esterilizada en autoclave (20 psi durante 15 min) y humedecida, para la obtención de una generación de individuos F1 en el laboratorio.
Las parejas permanecieron en los terrarios durante 21 días donde recibieron seis alimentaciones de 90 g de heces de bovino libres de LM recolectadas previamente. Previo a cada alimentación, las heces remanentes fueron retiradas. Al término del período de 21 días se recuperaron las bolas-nido construidas (crías) por las parejas y se colocaron en nuevos terrarios cilíndricos de plástico transparente (con las mismas especificaciones descritas anteriormente) que fungieron como maternidades. Del día 20 al 45 de incubación, las maternidades fueron inspeccionadas cada tercer día para obtener a los escarabajos emergidos (generación F1). La generación F1 emergida se separó por sexo y colocó en terrarios con las mismas especificaciones descritas anteriormente, donde permanecieron hasta alcanzar la madurez sexual (30 días) (Martínez y Cruz 1990), y ser aptos para los bioensayos.
Todos los bioensayos se realizaron bajo condiciones controladas de laboratorio: 27 ± 3°C, 60-70% de humedad relativa, fotoperiodo de 14 h de luz más 10 h de obscuridad. Los escarabajos se alimentaron dos veces a la semana (martes y viernes) con estiércol de bovino. Previo a cada alimentación, las heces remanentes fueron pesadas y retiradas.
Bioensayo
Para evaluar el efecto de las heces de bovinos tratados con IVM-1%, IVM-3.15%, MOX-1% y MOX-10% sobre la supervivencia y reproducción de C. i. chevrolati se realizaron dos bioensayos con cinco grupos cada uno. En el primer bioensayo se evaluó el efecto de las heces recolectadas al 5 DPT. En el segundo se evaluaron las heces recolectadas a los 14 DPT. Para esto, se emplearon 100 terrarios con las mismas especificaciones descritas anteriormente. Por cada grupo se utilizaron 10 terrarios como réplicas, donde cada terrario tuvo un macho y una hembra de 30-40 días de edad, sexualmente maduros. El ensayo duró 21 días, donde cada pareja se alimentó con 30 g de heces (tanto en los controles como en los tratados), dos veces a la semana, por 3 semanas. Al día 21, se extrajeron los EE y se contabilizaron las bolas-nido construidas por las parejas. Las bolasnido se depositaron en nuevos terrarios iguales a los descritos y distribuidos en distintos niveles del espesor de la tierra. Del día 20 al 45 los terrarios se inspeccionaron cada tercer día para obtener a los escarabajos emergidos (generación F2) y cuantificar el número de imagos emergidos y días a la emergencia, para determinar la reproducción.
Análisis estadísticos
El número de bolas nido construidas, de imagos emergidos por bolas nido y de días a la emergencia de imagos por terrario de cada uno de los tratamientos evaluados se analizaron con un modelo lineal generalizado con la distribución Poisson para los efectos principales (Friendly y Meyer 2016). Los gramos totales de excremento consumido en cada uno de los tratamientos evaluados se analizaron mediante un modelo lineal generalizado usando la distribución normal para los efectos principales. Los contrastes post hoc de ambos modelos se realizaron por mínimos cuadrados con ajuste del error por el método de Bonferroni (Friendly y Meyer 2016). Para determinar la diferencia entre la proporción de escarabajos emergidos en cada uno de los diferentes tratamientos evaluados se utilizó una prueba de Kruskal-Wallis (Quinn y Keough 2002). Todos los análisis se consideraron con una significancia estadística del 0.05 y fueron realizados con el paquete estadístico R versión 3.6 (R Core Team 2019).
RESULTADOS
No se observó efecto letal en los C. i. chevrolati adultos al exponerlos a las heces de vacas tratadas con IVM-1%, IVM-3.15%, MOX-1% y MOX-10% ni a 5 ni a 14 DPT.
Tampoco se observaron efectos subletales, ya que no hubo diferencias significativas entre la media del número de bolas-nido construidas (MOX F4;55 = 0.586, P = 0.67; IVM F4;55 = 0.689, P = 0.6), la media del número de imagos emergidos de las bolas-nido construidas (MOX F4;55 = 0.529, P = 0.71; IVM F4;55 = 0.527, P = 0.72), la mediana del porcentaje de emergencias (MOX K-W = 2.62, gl = 4, P = 0.62; IVM K-W = 0.785, gl = 4, P = 0.94), la media de días alcanzados a la emergencia (MOX F4;179 = 0.471, P = 0.76; IVM F4;181 = 0.288, P = 0.89) y la media de gramos de excremento consumidos por los EE (MOX F4;55 = 0.879, P = 0.48; IVM F4;55 = 0.088, P = 0.99) entre los grupos tratados ni respecto a los grupos controles (Tablas 1 y 2).
Tabla 1 Efecto de las heces de vacas tratadas con moxidectina sobre parámetros biológicos del escarabajo estercolero Canthon indigaceus chevrolati, evaluados en bioensayos de laboratorio.
| Moxidectina Tratamientos |
Media ±error estándar | |||||
| Producción bolas-nido |
Número EE emergidos |
Consumo (gr) |
Proporción de emergencia |
Días a la emergencia |
Grupos | |
| Control | 2.85 ± 1.14 | 2.6 ± 1.1 | 81.7 ± 1.7 | 0.901 ± 0.036 | 27.35 ± 1.02 | a |
| 1% - día 5 PT | 3.6 ± 1.18 | 3.1 ± 1.2 | 83.2 ± 2.41 | 0.844 ± 0.051 | 26.58 ± 1.04 | a |
| 1% - día 14 PT | 3.5 ± 1.18 | 3.2 ± 1.2 | 82.4 ± 2.41 | 0.912 ± 0.054 | 26.9 ± 1.04 | a |
| 10% - día 5 PT | 3.9 ± 1.17 | 3.6 ± 1.2 | 87.1 ± 2.41 | 0.933 ± 0.054 | 27 ± 1.03 | a |
| 10% - día 14 PT | 3.6 ± 1.18 | 3.3 ± 1.2 | 83.6 ± 2.41 | 0.937 ± 0.051 | 27.52 ± 1.03 | a |
EE: Escarabajos estercoleros.
PT: postratamiento. .
Tabla 2 Efecto de las heces de vacas tratadas con ivermectina sobre parámetros biológicos del escarabajo estercolero Canthon indigaceus chevrolati, evaluados en bioensayos de laboratorio.
| Ivermectina Tratamientos |
Media ± error estándar | |||||
| Producción bolas-nido |
Número EE emergidos |
Consumo (gr) |
Proporción de emergencia |
Días a la emergencia |
Grupos | |
| Control | 2.85 ± 1.14 | 2.6 ± 1.1 | 81.7 ± 1.8 | 0.901 ± 0.053 | 27.35 ± 1.02 | a |
| 1% día 5 PT | 3.9 ± 1.17 | 3.5 ± 1.2 | 83.5 ± 2.59 | 0.806 ± 0.076 | 27.37 ± 1.03 | a |
| 1% día 14 PT | 3.5 ± 1.18 | 3.2 ± 1.2 | 82.4 ± 2.59 | 0.824 ± 0.076 | 27.09 ± 1.03 | a |
| 3.15% día 5 PT | 3.8 ± 1.17 | 3.4 ± 1.2 | 82.1 ± 2.59 | 0.904 ± 0.076 | 27.74 ± 1.03 | a |
| 3.15% día 14 PT | 3.5 ± 1.18 | 3.2 ± 1.2 | 82.5 ± 2.59 | 0.922 ± 0.076 | 27 ± 1.03 | a |
EE: Escarabajos estercoleros.
PT: postratamiento.
DISCUSIÓN
No se encontró efecto letal (mortalidad) sobre los EE adultos por el consumo del estiércol proveniente del ganado desparasitado con IVM (1 y 3.15%) ni MOX (1 y 10%), lo que concuerda con lo reportado en diversas investigaciones con otras especies de EE (Doherty et al. 1994, Krüger y Scholtz 1997, Pérez-Cogollo et al. 2017). Sin embargo, lo que llama la atención es el hecho de no encontrar evidencia de algún efecto tóxico subletal, aún con las dosis más altas de IVM-3.15% y MOX-10%, ya que no se encontró diferencia significativa entre los promedios de bolasnido construidas (oviposición), los promedios de imagos emergidos a partir de esas bolas-nido, el promedio de días para la emergencia de los imagos, el porcentaje de emergencia y la utilización de excretas en todos los grupos tratados con respecto a los grupos controles. Con respecto, a la MOX-1% (subcutánea 200 μg kg-1) se han realizado trabajos que reportan no haber encontrado efectos tóxicos letales sobre los EE adultos ni subletales sobre su oviposición, como el realizado por Rodríguez-Vivas et al. (2019a), con la especie Onthophagus landolti, donde no se encontraron diferencias en la mortalidad de los escarabajos adultos, en la construcción de masas-nido, ni en la emergencia de los imagos de esas masanido construidas en los grupos tratados al compararlos con los grupos control.
Al respecto, Fincher y Wang (1992) reportaron que el estiércol de ganado tratado con la formulación subcutánea de MOX (0.2 mg / kg) no tuvo ningún efecto sobre la mortalidad y el porcentaje de emergencia de Euoniticellus intermedius y Onthophagus gazella. Lo que fue corroborado por Strong y Wall (1994) quienes tampoco reportan efectos inhibitorios en el desarrollo de Aphodius spp. en estiércol de bovinos tratados con MOX. Mientras que Doherty et al. (1994) al comparar el efecto de MOX contra la abamectina en la especie D. gazella, encontraron que la MOX, no afectó a los EE adultos ni redujo la oviposición. Además, estimaron que, en el estiércol de ganado bovino, la MOX evaluada a concentraciones de 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 y 512 μg kg-1 en el excremento era aproximadamente 64 veces menos tóxica para las larvas de moscas y escarabajos que la abamectina y concluyeron que era poco probable que la MOX tuviera efectos nocivos sobre la fauna del estiércol, si se aplica al ganado de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
Con respecto a la MOX-10% (pour-on 500 μg/kg), Iwasa et al. (2008), reportaron no encontrar diferencia significativa en el número y peso de las bolas-nido construidas por los escarabajos de la especie Caccobius jessoensis entre los grupos tratados con respecto a los controles y el porcentaje de emergencia de los imagos de C. jessoensis de los días 1, 3, 7, 14 PT, no fue significativamente diferente entre los grupos control y los tratados; no obstante, en el trabajo realizado por Rodríguez-Vivas et al. (2019a), con la especie O. landolti con estiércol del ganado tratado con MOX-10% (subcutánea 1.0 mg/kg), encontraron que tanto la fecundidad (masasnido construidas) como la emergencia de imagos presentaron una notable reducción con respecto al grupo control. Por lo tanto, la especie O. landolti sí se vio severamente afectada por las heces del ganado tratado con MOX-10%.
En cuanto a la IVM, son numerosos los estudios que reportan una notable disminución de la sobrevivencia larval de diversas especies de escarabajos pertenecientes a los géneros Onthophagus, Euoniticellus, Aphodius, Onitis, y Copris al exponerlas o criarlas con heces de vacas tratadas con IVM o abamectina en diferentes partes del mundo (Roncalli 1989, Madsen et al. 1990, Fincher 1992, 1996, Lumaret et al. 1993, Krüger y Scholtz 1997, Dadour et al. 2000, Errouissi et al. 2001, Wardhaugh et al. 2001, Pérez-Cogollo et al. 2017).
Dada la respuesta negativa en la fecundidad de diferentes especies de escarabajos ante la exposición a IVM, los resultados obtenidos en los bioensayos con C. i. chevrolati inducen a plantear dos hipótesis para la falta de efecto observada. La primera hipótesis se dirige a que esta especie posee tolerancia natural a la IVM, definida esta como la falta de susceptibilidad innata y que no es el resultado de selección por algún fármaco (Shoop 1993).
La segunda explicación plantea que la población estudiada de este escarabajo presenta algún grado de resistencia, definida como el cambio en la frecuencia génica de una población, la cual es generada por la selección inducida por la exposición a un fármaco (Shoop 1993).
Los resultados obtenidos muestran que C. i. chevrolati es la primera especie de escarabajo tropical en manifestar tolerancia letal y subletal a la IVM y considerando los dos escenarios planteados, se requiere analizar a mayor detalle los mecanismos biológicos involucrados en ambos.
De acuerdo con la definición de Shoop (1993) la tolerancia natural es invariable ya que la población de esta especie expresa mecanismos genéticos y fisiológicos que desintoxican a los individuos como se ha documentado en estudios con otros insectos y su exposición a la IVM (Amanzougaghene et al. 2018). Sin embargo, en el caso de la resistencia a la IVM vista como un proceso de tolerancia adquirida, esta se da por la continua exposición al fármaco, aunque aún no es del todo entendida (Amanzougaghene et al. 2018).
Se sabe que el mecanismo de acción contra los organismos susceptibles depende de su efecto sobre los canales de cloro en la membrana celular ya que la IVM se une a los canales de cloro regulados por glutamato y por el ácido gamma aminobutírico (GABA) en la membrana de las células musculares y nerviosas causando una hiperpolarización, y con ésta, la parálisis y muerte del organismo (Burkhart 2000). Adicionalmente se ha documentado en insectos que existen de forma natural genes, como el transportador casete de unión a ATP o transportador ABC (en inglés ATP binding cassette) y el citocromo P450, que inducen la desintoxicación metabólica de la IVM, lo que se traduce en tolerancia gradual dentro de la población (Yoon et al. 2011).
La acción de estos genes sobre el metabolismo de la IVM podría tener un efecto desintoxicante más eficiente de manera innata en esta especie debido a que la IVM y la MOX son estructuralmente muy similares, pertenecen a familias químicas que comparten un modo de acción similar (Shoop 1992) y la co-resistencia a estos dos fármacos se ha documentado en otros grupos de invertebrados (Conder et al. 1993, Shoop 1992).
Por otra parte, la razón por la cual puede tratarse de una tolerancia adquirida radica en el hecho de que la IVM lleva más de 20 años empleándose en México y en Yucatán (Rodríguez-Vivas et al. 2014), región de donde el pie de cría de C. i. chevrolati para los bioensayos fue obtenido, lo que implica que las poblaciones de este escarabajo se encuentran bajo una intensa presión de selección en las áreas ganaderas debido al uso de éstas LM, lo que pudiera estar provocando selección de mutaciones como las documentadas en otros organísmos en los genes codificantes de la P-glicoproteína o de la familia de genes que codifican los canales de cloro regulados por glutamato (Pouliot et al. 1997, Xu et al. 1998). Los resultados obtenidos no pueden ser considerados definitivos para responder a estas hipótesis, ya que es la primera vez que se reporta la tolerancia de esta especie de escarabajo tropical a la IVM y a la MOX, sin embargo este hallazgo abre nuevas preguntas de investigación de relevancia para la interacción entre las LM y la fauna benéfica de los pastizales ganaderos.
CONCLUSIONES
Los bioensayos realizados con parejas de C. i. chevrolati expuestas al excremento de vacas tratadas con IVM (1% y 3.15%) o MOX (1% y 10%) no mostraron efectos letales ni subletales, lo que sugiere que alguna forma de tolerancia (natural o inducida) a estos fármacos ocurre en las poblaciones de este escarabajo estercolero.
