INTRODUCCIÓN

Los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) son nutrientes claves para múltiples funciones biológicas en el organismo, desde el almacén de energía, componente de membranas celulares, precursores de sustancias metabólicamente activas, y la activación de genes o factores de transcripción (^{Yang et al. 2012}). Sin embargo, no pueden ser sintetizados por los tejidos animales, por lo tanto, deben ser incorporados en la dieta y se les denomina como esenciales (^{Jenkins et al. 2008}). En caso específico del ovocito, forman parte importante de la membrana celular (en forma de fosfolípidos) y del fluido folicular, lo que les permite afectar notablemente el microambiente del ovocito y jugar un papel fundamental en la calidad (^{Meza et al. 2014}). A nivel ovocitario, los AGPI son incorporados en la membrana celular o pueden ser incorporados a través de gotas lipídicas sintetizadas en el citoplasma, estas gotas de grasa se originan de los ácidos grasos extracelulares (provenientes de la circulación sanguínea) o de los sintetizados de novo. En el caso del ovocito, el origen de los ácidos grasos (AG) permanece incierto, aunque cada día existen más evidencias que permiten aseverar que esta célula es capaz de incorporar AG provenientes de su alrededor (^{Aardema 2014}).

La composición de los AG almacenados en el ovocito, se correlacionan con el desarrollo de las capacidades de esta célula. Los AG en líquido folicular pueden mediar e influenciar el nivel de expansión de células del cumulus y tiempo de reanudación de la maduración nuclear en los ovocitos, aspectos críticos para el desarrollo embrionario después de la fecundación in vitro (^{Marei et al. 2010}). Sin embargo, una acumulación excesiva de AG provoca hiperlipidemia reduciendo su desarrollo a estadios embrionarios avanzados debido a que aumentan su vulnerabilidad al estrés oxidativo (^{Leroy et al. 2010}). Durante su crecimiento y maduración, el metabolismo energético se acelera e incrementa la presencia de especies reactivas al oxigeno (^{Bradley y Swan 2019}). Se ha demostrado que el ácido linoleico conjugado (CLA) posee actividad antioxidante cuando es comparado con antioxidantes sintéticos convencionales.

Estudios in vitro demuestran que la adición en los medios de cultivo del isómero de CLA (cis-9, trasn-11, trans-10, cis-12) reducen la acumulación excesiva de lípidos, disminuyendo la hiperlipidemia que caracteriza a los embriones cultivados in vitro, mejorando su resistencia y tolerancia a la manipulación aumentando la competencia de ovocitos para convertirse en embriones de mejor calidad (^{Lapa et al. 2011}, ^{Batista et al. 2014}). Sin embargo, se sabe poco acerca de la captación especifica de AG al interior del folículo y cómo éste puede ser alterado por la dieta. Es importante resaltar que bajo condiciones in vitro el CLA no está expuesto al metabolismo propio del animal, factor que pudiera condicionar su efecto biológico, por lo que es necesario estudiar los aspectos intrínsecos del animal cuando son suplementados con CLA. Por lo que el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del ácido linoleico conjugado sobre la calidad y acumulación de lípidos en ovocitos de ratonas de la cepa CD-1.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El número total y calidad de ovocitos obtenidos se presentan en la Tabla 1. Se observó un incremento del 25% (p ≤ 0.05) de ovocitos recuperados a favor del grupo alimentado con CLA en comparación al grupo control. El grupo TCLA presentan un 63% de ovocitos de excelente y buena calidad contra un 37% del grupo TC, y un menor porcentaje de estructuras ovocitarias de mala calidad. Hasta donde sabemos, el presente estudio es el primero en evaluar el efecto del CLA sobre calidad y concentración de lípidos en ovocitos bajo condiciones in vivo, y los resultados que soporten esta evidencia en modelos murinos son escasos. Pero hay varios reportes del efecto de uso de los ácidos grasos poliinsaturados sobre el desarrollo folicular, aumento del número de folículos y ovocitos (^{Zeron et al. 2002}, ^{Meza et al. 2014}) y calidad (^{McEvoy et al. 2012}, ^{Meza et al. 2013}) en algunas especies de rumiantes (Ovinos y Bovinos). Los resultados pueden atribuirse a los componentes de la dieta, ya que se ha demostrado que los componentes dietarios tienen influencia sobre el desarrollo folicular y la composición del líquido folicular (LF), ya que estos una vez son metabolizados por el sistema digestivo e integrados al torrente sanguíneo, para luego ser transportados al LF (^{Aardema 2014}). Lo que impacta en la calidad ovocitaria (^{Meza et al. 2014}), ya que el ovocito tiene la capacidad de seleccionar ciertos AG y activar determinadas rutas metabólicas que influyen en la maduración y desarrollo de las competencias necesarias para su fertilización (^{Kim et al. 2001}).

Lo que puede mediar e influenciar el nivel de expansión de células del cúmulus y tiempo de reanudación de la maduración nuclear en los ovocitos, aspectos críticos para el desarrollo después de la fecundación (^{Marei et al. 2010}). El LF también contiene AG libres (^{Jungheim et al. 2011}), con los cuales las células del cumulus tienen contacto directo, siendo la única barrera entre el LF y el ovocito. La expresión del ácido graso translocasa CD36 en este tipo celular indica que son capaces de incorporar los AG en su interior proveniente de su entorno (^{Aardema et al. 2013}).

La presencia de ácido linoleico es inofensiva en altas concentraciones y puede compensar los efectos lipotóxicos de los ácidos grasos saturados mejorando la competencia de los ovocitos (^{Aardema et al. 2013}). Sin embargo, una acumulación excesiva de ácidos grasos provoca hiperlipidemia reduciendo su desarrollo a estadios embrionarios avanzados, debido a que aumentan su vulnerabilidad al estrés oxidativo (^{Leroy et al. 2010}). Durante su crecimiento y maduración, el metabolismo energético se acelera e incrementa la presencia de especies reactivas al oxígeno (^{Bradley y Swan 2019}). Pero la presencia de CLA (cis-9, trans-11 y trans-10,) en LF pudiera poseer capacidad atrapante de radicales libres (^{Yu 2001}), inhibiendo su efecto y favoreciendo la calidad ovocitaria in vivo (^{Meza et al. 2013}, ²⁰¹⁴).

La concentración general de lípidos expresada como unidades arbitrarias de fluorescencia, sin considerar la calidad de los ovocitos, fue menor en el grupo TCLA (145.8 ≤ 17.8) en comparación al grupo TCON (246 ± 13.1) (p < 0.05). La concentración de lípidos de acuerdo a la calidad ovocitaria dentro de tratamientos y entre tratamientos (Tabla 2) presenta diferencia significativa (p < 0.05). En la Figura 1 se observa menor concentración de lípidos en ovocitos de excelente calidad para el grupo TCLA en comparación con el grupo TCON. Conforme la calidad de las estructuras decrece presentan menor concentración de lípidos, los ovocitos del grupo TCLA presentan una menor concentración de lípidos en cada una de las calidades en comparación con el que el grupo TCON (p < 0.05). Los resultados del estudio concuerdan con lo reportado por ^{Lapa et al. (2011)}, quienes demuestran que la suplementación de CLA reduce la acumulación excesiva de lípidos en el ovocito bajo condiciones in vitro, dando lugar a un incremento del 60.7% de ovocitos de excelente calidad, mejorando su resistencia y tolerancia a la manipulación, aumentado las probabilidades del ovocito para convertirse en embriones de mejor calidad y disminuyendo la deposición citoplasmática de lípidos (^{Pereira et al. 2007}). Los lípidos intracelulares en los ovocitos se almacenan principalmente en gotas lipídicas (GL) que proporcionan energía (^{Jin et al. 2017}), a través de la β-oxidación (^{Paczkowski et al. 2013}), para un crecimiento y desarrollo adecuado, moléculas que actúan en los procesos de señalización implicados en los mecanismos de regulación del proceso de maduración y competencia del ovocito (^{Prates et al. 2014}). La suplementación de CLA durante las diferentes etapas de la producción in vitro de embriones bovinos ha demostrado alterar el perfil de lípidos de la membrana con respecto a los fosfolípidos, lo que puede deberse a alguna supuesta emodelación y/o renovación (^{Leão et al. 2015a}, ^{Borges y Vireque 2019}). Al respecto, se han identificado especies de fosfolipidos como marcadores de la criotolerancia de los blastocitos bovinos (^{Sudano et al. 2012}) y la abundancia de fosfatidilcolinas en los embriones parecen funcionar como un biomarcador prospectivo para la crioconservación (^{Leão et al. 2015b}, ²⁰¹⁷). La suplementación con CLA durante todo el proceso de cultivo de embriones bovinos, muestran una reducción de los niveles de lípidos y mayor crioresistencia (^{Pena et al. 2019}), efectos que pueden deberse a la modulación y ralentización de agua, y crioprotectores mediados por el CLA (^{Matos et al. 2015}). Por otra parte, el CLA es capaz de cambiar el perfil de los ácidos grasos, influyendo en los niveles de triglicéridos o afectando los niveles de AG tanto saturados como insaturados, posiblemente inhibiendo la expresión de los genes que codifican la síntesis de las enzimas lipogénicas y la actividad de la lipoproteína lipasa (^{Park et al. 1997}). Embriones bovinos cultivados con diferentes AGPI muestran reducción en los niveles de transcripción del gen desaturasa de ácido graso 2 (FADS2) sin afectar los niveles de transcripción de otros genes asociados con el metabolismo lipídico, esta baja regulación del FADS2 puede inducir la reducción del contenido de lípidos en los embriones, debido a que la enzima cataliza la biosíntesis de los precursores utilizados en la síntesis de los ácidos grasos poliinsaturados (^{Al Darwich et al. 2010}).

Figura 1 Contenido de lípidos en ovocitos de excelente calidad obtenidos de ratonas de la cepa CD-1 alimentadas con CLA. Imagen representativa de los ovocitos (A) grupo control, (B) grupo tratado con CLA y teñidos con Rojo de Nilo. La fluorescencia fue observada en objetivo 40X. 

El mecanismo exacto a través del cual el CLA impacta la concentración de lípidos en el presente estudio podría ser a través de la vía de transducción de la proteína kinasa A PKA y la cascada de reacciones de Adenosín monofosfato cíclico (cAMP) (^{Ashwell et al. 2010}). En adipocitos humanos cultivados en presencia de CLA, se identificó un aumento en la lipolisis y perilipina citosólica asociada a GL de menor tamaño (^{Chung et al. 2005}). Por lo tanto, es posible que la proteína kinasa A (PKA) y las rutas de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), quinasas extracelulares reguladas por señales (ERK) pudieran estar reguladas por el CLA, interfiriendo con la lipólisis de la GL y el contenido de AG de los ovocitos. Un análisis de la composición AG y plasmalógenos (DMA) en complejos cúmulos ovocito de porcinos, mostraron que independientemente el tipo de célula, que el tratamiento con CLA, reduce las proporciones de diversos AG de manera individual y plasmalógenos (DMA 16:0, c9-16:1, 18:3 n-6) (^{Prates et al. 2013}). El AG liberado o la acumulación de CLA puede seguir la β-oxidación mitocondrial para producir energía para la maduración progresiva o la síntesis de AG puede ser usada en la formación de células durante el desarrollo embrionario (^{Dunning et al. 2014}).

Los resultados preliminares del CLA sobre la calidad y acumulación de lípidos en ovocitos de ratonas de la cepa CD-1, como perspectivas, merece la pena seguir explorando el efecto del CLA sobre crioconservación de los ovocitos y su desarrollo post crioconservación, así como la expresión de genes ligados a la calidad ovocitaria. La adición de ácido linoleico conjugado en la dieta de ratones hembra de la cepa CD-1 favorece el número, y calidad de ovocitos, y disminuye la acumulación de lípidos en los mismos bajo condiciones in vivo. Por lo que el CLA puede ser una estrategia favorable para aumentar la crioresistencia de los ovocitos, en los sistemas de producción de embriones in vitro.