Localización

El estudio se realizó en cinco municipios del estado de Coahuila, y dos del estado de Durango, ubicados en la región conocida como Comarca Lagunera (25^o 05’ y 26^o 54’ LN y 101^o 40’ y 104^o 45’ LO), caracterizada por una precipitación anual de 235 mm, altitud de 1 139 msnm, clima seco semiárido, y temperatura promedio anual de 22 °C, con máximas y mínimas de 33 y 9 °C, respectivamente (^{INEGI 2017}).

Colecta de las muestras

De 66 apicultores registrados en el Comité Sistema Producto Apícola de la Región Lagunera A.C., se seleccionaron 43 apicultores, bajo el criterio de contar con al menos 10 colonias y disponibilidad de participar en el proyecto. Las muestras de las abejas adultas y el panal con miel y cera fueron tomadas del alza de las mismas colonias, realizándose de junio-septiembre de 2017 y mayo-julio de 2018 mediante un muestreo aleatorio del 20% de las colonias de cada apiario, obteniendo un total de 132 muestras para el primer año (2017) y 125 para el segundo año (2018).

Para obtener el panal con miel y cera, se cortó un pedazo de panal de aproximadamente de 12 cm² con un cúter desechable y se colocó en una bolsa de plástico con su respectiva identificación. Para la obtención de las abejas, se realizó de los bastidores del alza en un frasco con alcohol al 70%, cada muestra fue de aproximadamente 200 abejas adultas (^{Traynor et al. 2016}). Las muestras identificadas se trasladaron al laboratorio de Biología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Unidad Laguna en Torreón, Coahuila para su análisis. Otra parte de las muestras de miel y cera se conservaron a -20 °C hasta su análisis en el laboratorio de servicios Analíticos del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A. C. (CIATEJ) sede Noreste, ubicado en Apodaca, Nuevo León. Para el análisis de plaguicidas, solo se tomaron las muestras del primer año, elegidas al azar se seleccionaron 12 muestras de miel y 12 de cera, a las cuales se les determinó la posible presencia de plaguicidas.

Productos químicos y estándares analíticos

Los estándares analíticos de los plaguicidas se obtuvieron de ChemService, Inc. (West Chester, PA, USA): Sigma-Aldrich-Fluka (St. Louis, MO, USA), Sigma-Aldrich-Supelco (Bellefonte, PA, USA), Accustandard (New Haven, CT, USA), y ULTRA Scientific (N. Kingstown, RI, USA). El ácido fórmico (grado espectrometría de masas) y formiato de amonio (base metal traza) se adquirieron en Sigma-Aldrich. El acetonitrilo, agua y metanol, todos en grado HPLC fueron adquiridos en Tedia High Purity Solvents (Fairfield, OH). Las sales de extracción Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe (QuEChERS) (Método AOAC) y los kits dSPE de dispersión (Bond Elut), fueron adquiridos en Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA). El helio de ultra alta pureza (99.999%) se obtuvo de grupo INFRA (México).

Preparación y extracción de muestras

De cada muestra se tomaron 7 g de miel y 3 g de cera. La extracción se realizó de residuos de plaguicidas con una modificación del método analítico “QuEChERS” (^{Valdovinos-Flores et al. 2017}) validado en el Laboratorio de Servicios Analíticos de la Sede Noreste del CIATEJ. El cual consta de dos pasos: (1) la partición de plaguicidas de la matriz con acetonitrilo acidificado al 1% (v/v) con ácido acético, acetato de sodio y sulfato de magnesio (estos dos últimos contenidos en las sales QuEChERS método AOAC), y (2) limpieza de una alícuota del extracto con sorbentes en fase sólida dispersiva, que contienen amina primaria-secundaria (PSA) y sulfato de magnesio. Los extractos resultantes de cada paso se sedimentaron con una centrifuga de mesa de trabajo Hermle Z 206 (Hermle Labortechnik, Alemania). Se prepararon curvas de calibración en matrices de cera y miel, libres de residuos de plaguicidas; los analitos y el estándar interno (trifenilfosfato) se agregaron después de pesar las muestras, antes de añadir solvente de extracción. Se transfirieron 300 µL del extracto final a viales de 2 mL con insertos, inyectándose todos los extractos tanto en un sistema de Cromatografía de líquidos acoplado a un espectrómetro de masas en tiempo de vuelo (LC-QTOF) y otra en un Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (GC-MS/MS). La extracción específica para cada matriz se detalla a continuación.

Extracción de plaguicidas en miel

Para el paso de partición, en un tubo de polipropileno para centrífuga de 50 mL se pesaron 7 g de miel, a los cuales se agregaron 10 mL de agua desionizada, para luego agitar de forma manual las muestras durante un minuto, se agregaron 15 mL de acetonitrilo acidificado al 1% con ácido acético (v/v) y se agitó nuevamente durante un minuto. Posteriormente se agregaron 6 g de MgSO4 y 1.5 g de acetato de sodio a las muestras y agitaron durante un minuto y se centrifugaron a 4 000 rpm por 5 minutos.

Para hacer la limpieza del extracto en fase sólida dispersa se utilizaron 8 mL del sobrenadante y se transfirieron a un tubo de 15 mL con 400 mL de amina primaria-secundaria (PSA), 1200 mg MgSO₄ y 400 mg de EC-C18 para luego agitar durante un minuto y se centrifugar a 4000 rpm por 5 minutos.

Extracción de plaguicidas en cera

Para la extracción de esta matriz se utilizó el método de ^{Niell et al. (2014)}. En un tubo de polipropileno para centrifuga de 50 mL se pesaron 3 g de cera y se agregaron 15 mL de acetonitrilo acidificado al 1% con ácido acético (v/v). No se utilizaron sulfato de magnesio y acetato de sodio para el paso de partición en esta matriz. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 80 °C hasta la fundición de la cera, una vez fundida la cera se agitó de forma manual por 20 s y se colocó nuevamente en el baño para que se fundiera, se repitió el proceso de fundición y agitación tres veces más, las muestras se colocaron a temperatura ambiente y luego se llevaron a un congelador a -20 °C durante dos horas. Una vez removidas del congelador las muestras se centrifugaron a 4000 rpm por 5 minutos. Para hacer la limpieza del extracto se extrajeron 8 mL del sobrenadante y se transfirieron a tubos de 15 mL con 400 mg de amina primaria-secundaria (PSA), 1200 mg de MgSO₄ y 400 mg de EC-C18, se agitaron durante un minuto y se centrifugaron a 4 000 rpm por 5 minutos.

Análisis cromatográfico acoplado a espectrometría de masas

Debido a la gran variedad química de sustancias plaguicidas empleadas hoy en día, con un rango muy amplio en propiedades fisicoquímicas, además de su origen (biológico o sintético), no es posible el uso de una sola técnica cromatográfica, volviéndose necesario el uso complementario de técnicas como cromatografía de gases (CG) y cromatografía de líquidos (CL); como ejemplos de dicho uso complementario se encuentran el método multirresidual QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) (^{Anastassiades et al. 2003}) o el método SweEt (Swedish Ethyl Acetate) (^{Pihlstrom et al. 2007}). En general, considerando la detección por espectrometría de masas (EM), se utiliza cromatografía de líquidos para compuestos de media a alta polaridad y de bajo a alto peso molecular (que tienden a ser menos volátiles), mientras que la cromatografía de gases se utiliza para compuestos de bajo a medio peso molecular (que tienden a ser más volátiles) y de baja polaridad. Utilizando ambas técnicas cromatográficas se evita la derivatización y se disminuye el procesamiento de las muestras (^{Stachniuky Fornal 2016}). En el presente estudio, la detección y cuantificación de plaguicidas se realizó por medio de curvas de calibración en matriz, preparadas por fortificación con mezclas de estándares analíticos.

CL-Q-TOF

Para el análisis de cromatografía de líquidos, se utilizó un sistema HPLC de la serie 1200 de Agilent (Agilent Technologies) con una bomba binaria acoplada a un espectrómetro de masas 6530A Q-TOF (Agilent Technologies). La separación cromatográfica se realizó en una columna Eclipse Plus C18 (100 mm x 2.1 mm x 1.8 µm, Agilent Technologies). Las fases móviles consistieron en agua con 0.01% de ácido fórmico + 10 mM de formato de amonio (fase A) y metanol con 0.01% de ácido fórmico + 10 mM formato de amonio (fase B). La inyección se realizó programando en el automuestreador una mezcla de 3 µL de extracto con 15 uL de fase A. El gradiente de elución se corrió a 0.35 mL/min de la siguiente manera de 0-3.25 minutos se partió con 80:20 (fase A: fase B) hasta llegar a una relación 50:50 de ambas fases 50:50 (desde 3.25 minutos) hasta 10:-90 (a 8.81 minutos de tiempo de corrida), llegando a 100% fase B (a 10 minutos de tiempo de corrida), se mantuvo 100% B de 10-12.8 minutos (tiempo de corrida) y re-equilibró a condiciones iniciales (80:20 A:B) desde 12.9 minutos hasta finalizar la corrida (18 minutos tiempo total). Para el análisis de espectrometría de masas, se utilizó una fuente de ionización por electrosplay Agilent Jet-Stream que operó en modo polaridad positiva con los siguientes parámetros de operación: modo de adquisición TOF MS, rango de adquisición de 50-950 m/z, N2 a 180 °C y 13 L/min como gas de secado, presión del nebulizador a 40 psi, tensión de la boquilla a 0 V, gas de vaina a 300 °C y 10 L/min, voltaje de capilar a 4000 V, voltaje de skimmer a 65 V, voltaje fragmentador a 150 V, octapole RF at 750 V. El software Agilent MassHunter, Workstation se utilizó para la adquisición y análisis de datos cromatográficos.

CG-EM/EM

Para la cromatografía de gases, se usó un cromatógrafo de gases 7890A acoplado a un espectrómetro de masas triple cuadrúpedo 7000B con ionización de impacto de electrones (EI), equipado con un automuestreador 7693A (Agilent Technologies). La separación cromatográfica se realizó utilizando dos columnas capilares DB-5 MS UI (15 m x 0.250 mm x 0.25 µm de espesor de película; Agilent Technologies). Se utilizó una unión purgada para conectar las dos columnas y se realizó un contraflujo después de cada inyección, al final de la elución. Se inyectaron 2 µL del extracto en modo sin divisiones (5 min a 21.1 psi), con un flujo constante de 1.0 mL/min (columna 1) y 1.2 mL/min (columna 2). Se utilizó helio de ultra pureza (99.9995) como gas portador. Para mejorar la volatilización de las muestras en el inyector y disminuir la degradación de analitos, se utilizó una rampa de temperatura en el puerto de inyección, partiendo de 65 °C (manteniendo por 0.2 minutos) y llegando hasta 310 °C a 600 °C/minuto. La temperatura del horno se programó iniciando de 60 ^°C (mantenida por 1 minuto) hasta 170 °C, a 40 °C/minuto a 310 °C, a una velocidad de 10 °C/minuto, manteniendo la temperatura final por 4 minutos. El espectrómetro de masas se operó en el modo de ionización de impacto de electrones (energía de ionización 70 eV), mientras que la línea de trasferencia y las temperaturas de la fuente de iones se fijaron a 300 ^°C. Para la selección y cuantificación de análisis se utilizó el modo monitoreo de reacciones múltiples (MRM), seleccionando de dos a tres transiciones por segundo, con el fin de obtener un mínimo de 10 puntos de muestreo por pico. El software Agilent MassHunter Workstation se utilizó para la adquisición y análisis de datos cromatográficos.

Determinación de patógenos

Para determinación de Nosema spp. las muestras se analizaron mediante la técnica de Cantwell, determinando la presencia y cuantificando el número de esporas. Para reportar la intensidad de infección en millones de esporas por abeja (^{OIE 2017}, ^{Shimanuki y Knox 2000}). Mientras que la presencia del ácaro (Varroa destructor), se determinó de acuerdo a la técnica del agitado (^{Shimanuki y Knox 2000}) y el nivel de infestación se calculó con el número de ácaros por cada 100 abejas y se reportó como porcentaje de infestación (^{OIE 2017}). En tanto que la presencia y nivel de infestación de Acarapis woodi se realizó en 20 abejas adultas con la técnica del disco mesotorácico (^{OIE 2017}, ^{Shimanuki y Knox 2000}).

Análisis estadístico

Para determinar si los datos cumplían con criterios de normalidad se realizó la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov (^{Pirk et al. 2013}). Los niveles de infestación de Varroa se transformaron a raíz cuadrada y los niveles de infección de Nosema se transformaron en base Log₁₀. Para la comparación entre años de los niveles de infestación de Varroa e infección de Nosema, se realizó un ANOVA seguido por una prueba de Tukey (a = 0.05). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SAS versión 9.0.

Residuos de plaguicidas en miel y cera

En la cera se encontraron 22 residuos de plaguicidas: insecticidas (59.1%), fungicidas (27.3%), herbicidas (9.1%) y acaricidas (4.5%). En la miel ocho: insecticidas (75.0%) y fungicidas (25.0%). El neonicotinoide acetamiprid se encontró en todas las muestras de cera y miel, observándose en mayor cantidad en la miel con rango 0.101 a 0.787 y promedio 0.385 mg kg^-1, mientras que en la cera el rango fue de 0.062 a 0.735 y promedio de 0.316 mg kg^-1 (Tabla 1). Mientras que el insecticida malatión se encontró en el 92% de las muestras, sin embargo, las cantidades fueron bajas con un promedio de 0.015 mg kg^-1; Asimismo, en un 75% de las muestras de cera se encontró en la presencia de pentaclorofenol con un promedio del 0.005 mg kg^-1; y en 50% de las muestras de cera se encontró la permetrina cis con un promedio de 0.058 mg kg^-1.

Presencia de patógenos en las abejas

El microsporido Nosema spp presentó una prevalencia del 100% para los dos años de estudio, con un promedio de infección de nueve y ocho millones de esporas por abeja, respectivamente, con diferencias significativas entre los años, siendo el segundo año el de menor cantidad de esporas (p = 0.004). Para el ácaro Varroa la prevalencia del primer año fue de 82.6% y el segundo año de 79.2%. Pero, para el nivel de infestación no se encontraron diferencias significativas (p = 0.266) entre los años (Tabla 2); mientras que el ácaro Acarapis woodi no se encontró presente en las muestras analizadas.

Residuos de plaguicidas en miel y cera

La mayor diversidad de residuos de plaguicidas detectados fueron los insecticidas, los cuales representaron en las muestras de miel (75.0%) y cera (59.1%). Lo que coincide con ^{Ostiguy et al. (2019)} quienes mencionan que éstos representan el mayor riesgo para los insectos polinizadores. La cera presentó la mayor cantidad de plaguicidas comparado con la miel, el cual se debe que la mayoría de los plaguicidas son hidrofóbicos con alta estabilidad y pueden transferirse con mayor facilidad a la cera de abejas (^{Calatayud-Vernich et al. 2018}), todo esto aunado a un manejo inadecuado de la cera por parte de los apicultores, como el bajo reemplazo y el reciclarla para volverla a introducir a la colmena.

En lo referente al insecticida neonicotinoide acetamiprid fue detectado en todas las muestras en niveles bajos en la cera (0.062 mg kg^-1) y altos niveles en la miel (787 mg kg^-1), valores similares también se han encontrado en muestras de miel (^{Gawel et al. 2019}). Mientras que las concentraciones de acetamiprid detectadas en la miel y cera rebasó el Límite Máximo de Residuo (LMR) de la Unión Europea (UE) de 0.05 mg kg^-1, el cual al consumirse a dosis subletales de 0.1 µg por abeja puede afectar su comportamiento (^{El Hassani et al. 2008}), lo que causa debilitamiento inmunológico, deterioro de la fortaleza de la colmena y favorece la infección de Nosema (^{Pettis et al. 2012}), la propagación de Varroa y por consiguiente la transmisión de virus (^{Di Prisco et al. 2016}). Además, el acetamiprid puede presentar efectos sinérgicos cuando se combina con otros plaguicidas (^{Wang et al. 2019}), todos estos efectos posiblemente fueron la causa de la disminución masiva del número de colonias de abejas en la región.

El malatión fue el segundo insecticida encontrado en el 92% de las muestras de cera, con niveles de 0.005 hasta 0.041 y promedio de 0.015 mg kg^-1, cifra que no rebasa los LMR de la UE de 0.05 mg kg^-1. En cambio, ^{Valdovinos-Flores et al. (2017)} para el norte de México reportan la presencia del insecticida en el 100% de las muestras de cera, con niveles que van de 0.006 a 1.532 mg kg^-1, con promedio de 0.018 mg kg^-1. El malatión, se utiliza como insecticida, acaricida y para el control de plagas urbanas, presenta baja persistencia y alta toxicidad en insectos (^{NLM 2021}). Los resultados de este estudio demuestran alta incidencia del organofosforado malatión en la Región Lagunera donde fueron recolectadas las muestras, y aunque presenta baja persistencia, es de alta incidencia en las muestras analizadas. Lo anterior probablemente se explique por la aplicación del organofosforado cerca de las colmenas ya que la mayoría son movilizadas en busca de floración y se ubican principalmente cerca de los cultivos agrícolas.

En cuanto al organoclorado pentaclorofenol es un insecticida que se encontró con alta frecuencia en 75% de las muestras de cera con un promedio de 0.005 mg kg^-1, sin embargo, su uso se encuentra restringido en México y otros países, la Agencia de Protección del Medio Ambiente de EE. UU (EPA) menciona que el uso del pentaclorofenol como plaguicida se encuentra restringido en todas sus formulaciones y usos, debido al daño para la salud humana y el medio ambiente. No se encontró la presencia de LMR en cera de abeja en el agua potable, el nivel máximo de contaminante es de 0.001 mg L^-1 (^{NCBI 2021}). Aun cuando su uso se restringió al público en general como plaguicida, está autorizado en México para uso forestal, urbano e industrial como preservador de madera en el alumbrado público, rieles de ferrocarriles y en pilotes de muelles (^{INECC 2018}). Por lo tanto, no debería encontrarse en las muestras de cera de abeja, lo que indica que el pentaclorofenol probablemente se utiliza para otros fines.

La permetrina se encontró en el 50% de las muestras de cera, con promedio de 0.058 mg kg^-1, sin embargo, la UE no específica su LMR. De igual manera ^{Johnson et al. (2010)}, reportan valores similares en cera de 0.133 mg kg^-1. No obstante, este insecticida piretroide es altamente tóxico para las abejas, con una DL50 tópica de 0.024 µg por abeja (^{Piccolomini et al. 2018}). La exposición prolongada de los piretroides puede afectar la inmunidad celular y humoral en las abejas, además de que están relacionados con la pérdida de movimiento y coordinación ocasionando parálisis y convulsiones en las abejas (^{Qi et al. 2019}). Debido al amplio uso de la permetrina en lo agrícola y forestal (^{NLM 2021}) puede ser la razón de la presencia en las muestras de cera analizadas.

En cuanto a los fungicidas, fue el segundo grupo de plaguicidas que se encontraron tanto en la cera como en la miel, los cuales pueden aumentar la toxicidad de los insecticidas al reducir la capacidad de desintoxicación de las abejas (^{Botías y Sánchez-Bayo 2018}). Además están relacionados con la prevalencia de enfermedades infecciosas (^{Simon-Delso et al. 2014}) con importantes consecuencias para la nutrición y estado de salud de las abejas.

Mientras que los herbicidas y acaricidas se encontraron en menor presencia en las muestras de cera analizadas. El uso de los herbicidas afecta de manera indirecta a las abejas al eliminar gran cantidad de plantas silvestres y reducir la diversidad floral utilizada como fuente principal de alimento (^{Bohnenblust et al. 2016}). En lo referente a los acaricidas, estos se utilizan en su mayoría dentro de la colmena para el control del ácaro V. destructor, además pueden actuar de manera sinérgica con los residuos de insecticidas en las colonias de abejas (^{Johnson et al. 2013}). Al respecto La Comarca Lagunera es referente en siembra de algodón, y actualmente, predomina el cultivo de forrajes para el ganado bovino y la producción de hortalizas (^{SIAP 2019}), por lo que es una región donde se han utilizado y se utiliza una gran diversidad de plaguicidas muchos de los cuales presentan efecto residual prolongado (^{Vargas-González et al. 2016}). Por lo que las prácticas agrícolas inadecuadas y, el uso y manejo ineficiente de los plaguicidas (^{Esquivel-Valenzuela et al. 2019}) han creado un serio problema a la apicultura por su relación con el colapso de las colmenas.

Presencia de patógenos en las abejas

La prevalencia de Nosema en ambos años fue del 100%, similar a lo reportado por ^{Tapia-González et al. (2017)} en colmenas de México, lo que demuestra que es una enfermedad presente en la región. En cuanto a los niveles de infección presentaron diferencias significativas para los dos años (p ≤ 0.05) con promedio para 2017 y 2018 de 9.358 y 8.012 millones de esporas por abeja, respectivamente, y un rango de 1.2 a 89.6 millones y de 1.6 a 55.2 millones de esporas por abeja, respectivamente. Al repecto, ^{Papini et al. (2017)} reportaron un promedio de 2.07 millones de esporas por abeja y un rango de 125,000 a 4.1 millones de esporas por abeja, así mismo ^{Smart y Sheppard (2012)} reportan un promedio de 2.38 millones y un rango de 0 hasta 87 millones de esporas por abeja. Las altas prevalencias y niveles de infección encontrados en el presente estudio pueden deberse a la presencia de la especie N. ceranae, que a diferencia de N. Apis es más virulenta, presenta mayor gasto de energía, supresión inmunológica y es resistente a altas temperaturas (^{Martín-Hernández et al. 2009}). Además, es catalogada como una de las principales causas en la pérdida de colonias (^{Higes et al. 2008}). Sin embargo, las colmenas infectadas con Nosema pueden mantener la eficiencia y la productividad de la colonia (^{Kurze et al. 2016}), pero tendrán mayor probabilidad de daño al estar expuestas a plaguicidas (^{Broadrup et al. 2019}).

La presencia del ácaro V. destructor se encontró con una alta prevalencia en los dos años de estudio en proporciones del 82.6 y 79.2%, respectivamente; con niveles de infestación del 3.2 y 2.8%, respectivamente (Tabla 2). Prevalencias similares son reportadas por ^{Traynor et al. (2016)} con valores de 82.4 hasta 94.3%, y niveles de infestación de 3.3 a 5.8%. También, ^{Genersch et al. (2010)}, reportan niveles de infestación que van de 3.1% a 5.1%. La alta prevalencia encontrada puede estar relacionada por la cercanía entre apiarios y la sobresaturación de colonias en un área (^{Herrera et al. 2017}) y con la aplicación inadecuada de tratamientos para el control de este ácaro (^{Meana et al. 2017}); además de su difícil erradicación. En cuanto a la dinámica poblacional de V. destructor, esta puede variar por diversas causas, como los factores ambientales que alteran las condiciones microclimáticas dentro de la colonia (^{Rosenkranz et al. 2010}); o la genética y el detectar y remover las crías afectadas (^{Meixner et al. 2015}). Por lo que la combinación de éstas enfermedades con los neonicotinoides contribuyen al colapso de las colmenas (^{Sánchez-Bayo et al. 2016}), lo que posiblemente ocasionó el colapso de las colonias en esta región.

El ácaro traqueal A. woodi no se encontró en las muestras analizadas, lo que indica que no se encuentra presente. Al respecto, se reporta que en lugares donde está presente, se observa una prevalencia y nivel de infestación bajo (^{Figueroa y Arechavaleta-Velasco 2018}), al parecer se ha establecido un equilibrio entre el parásito y las abejas, debido a la aplicación de diversos métodos de control de V. destructor, los cuales tienen efecto indirecto sobre A. woodi (^{OIE 2017}).