Introducción

En las últimas décadas el manejo para el control de plagas y enfermedades que afectan a los cultivos ha sido mediante el uso excesivo de plaguicidas que tienen un severo impacto negativo sobre la salud humana y el medio ambiente (^{Adnan et al. 2019}). Una alternativa efectiva para combatir los patógenos presentes en el suelo y mitigar los efectos adversos que ocasionan los compuestos organosintéticos es el empleo de microorganismos como biocontroladores (^{Al-askar et al. 2021}, ^{Ghoniem et al. 2021}). Al respecto, se sabe que Trichoderma, organismo simbionte de plantas de bajo costo, efectivo y amigable con el ambiente (^{Sood et al. 2020}) ejerce mecanismos de control por micoparasitismo, competencia, antibiosis, suprime la actividad de organismos patógenos por actividades enzimáticas, mantiene la micro flora del suelo y aumenta el crecimiento y producción de las plantas (^{Thapa et al. 2020}). Además de que induce resistencia y tolerancia contra estrés biótico y abiótico (^{Alfiky y Weiskopff 2021}).

Con el tiempo las plantas han desarrollado mecanismos de defensa, la presencia de patógenos es capaz de activar, mediante señales, múltiples respuestas protectoras tanto locales como sistémicas, que logran disminuir la posibilidad de infecciones y reducir el impacto de una plaga (^{Enebe y Babalola 2019}). Se sabe que Trichoderma posee la facultad de activar el sistema inmune de las plantas (^{Aamir et al. 2019}). La resistencia sistémica inducida (RSI), generalmente señalada como un método o un fenomeno para mejorar el sistema inmunológico inherente de la planta, también la resistencia sistémica adquirida (RSA), importante en la mejora de defensa de las plantas contra patógenos, que se refiere a una vía de transducción de señales (^{Murali et al. 2021}). Estos mecanismos de defensa son regulados por diferentes tipos de elicitores, como las proteínas Sm1 y su homóloga, Epl1 (^{Tanaka y Kahmann 2021}). Tanto Sm1 como Epl1 son proteínas no catalíticas que pertenecen a la familia de las ceratoplataninas, bastante comunes en microorganismos en los que realizan diferentes funciones (^{Ramírez-Valdespino et al. 2019}), en organismos patógenos son indispensables para lograr una patogenicidad, y también necesarias e importantes en la señalización de las moléculas que intervienen en la inducción de resistencia en las plantas (^{Chen et al. 2020}). La proteína Sm1 activa la resistencia sistémica inducida en las primeras etapas de la interacción planta-Trichoderma mediante la acumulación del ácido jasmónico (AJ) y etileno (ET) (^{Guzmán-Guzmán et al. 2019}), impulsada por la acción de los organismos necrotróficos, otorgándole a la planta mayor capacidad de respuesta frente a infecciones, lo que resulta en una estrategia de defensa efectiva (^{Salas-Marina et al. 2015}). Mientras que la proteína Epl1 producida de forma endógena en la planta y esencial para la señalización de las vías del ácido salicílico (AS), induce la resistencia sistémica adquirida como medida de defensa al ataque de patógenos biotróficos y hemibiotróficos, y se dispersa en toda la planta (^{Gomes et al. 2017}). Si bien, las vías de señalización del AS, AJ y ET para inducir la resistencia en las plantas son mutuamente antagonistas, se ha evidenciado que entre algunas especies de Trichoderma hay correlación entre estas fitohormonas debido a la sobreposición de genes relacionados a la RSI y RSA detectados en plantas tratadas con Epl1 y Sm1 (^{Cheng et al. 2018}), lo que sugiere que ambos elicitores funcionan de forma sinérgica en los dos sistemas de defensa inducido por Trichoderma (Salas-Marina et al. 2015). Con base en lo anterior el objetivo del presente trabajo fue identificar, por medio de biología molecular, cepas de Trichoderma spp.; además de evaluar, in vitro, la eficacia contra F. oxysporum y C. cassiicola, así como determinar los genes que codifican los elicitores Sm1 y Epl1 relacionados con la resistencia sistémica en las plantas.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

Con base a las características morfológicas y las secuencias internas ITS1-5.8S-ITS2 del ARN ribosomal, la identificación de los aislados corresponde a T. asperellum, T. erinaceum, T. ghanense y seis aislados de T. harzianum (Tabla 1). La variedad entre especies de Trichoderma ha sido reportada, siendo común aislar T. harzianum, la diversidad intra e interespecífica es generada por las diferentes condiciones en donde se ha desarrollado los aislados de Trichoderma, llegando a tener diferencias en sus características (^{Moo et al. 2018}).

De las 13 cepas de Trichoderma evaluadas contra la inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum y C. casiicola, T. erinaceum 10-15 fue la que mostró mayor inhibición contra F. oxysporum, con un 90.5%, seguido de las cepas T. asperellum 19-31 con 84.9%, y T. harzianum 05E-60 con 84.5%. Al respecto, ^{Aamir et al. (2019)} evaluaron la capacidad antagónica in vitro de diversas especies de Trichoderma contra F. oxysporum f. sp. lycopersici y reportaron que T. erinaceum registró la mayor capacidad inhibitoria micelial de F. oxysporum, seguido de T. asperellum y T. longibranchiatum, resultados que concuerdan con los de este estudio. Por otro lado, estudios previos indican que T. asperellum tiene una capacidad de inhibición micelial de hasta 81% para F. incarnatum e inhibición total de F. oxysporum al evaluar diferentes concentraciones de ácido cítrico obtenido de esta especie (^{Al-Askar et al. 2021}, ^{Intana et al. 2021}). En tanto que C. cassiicola, en la inhibición micelial T. virens 32-09 tuvo una capacidad de inhibición de 75.1%, seguido de la cepa T. virens 05-02 con 71.6% (Tabla 2); trabajos con especies de Trichoderma han demostrado la capacidad de inhibir el crecimiento de C. cassiicola, en particular con T. asperellum y T. harzianum (^{Maza et al. 2012}). Sobre lo mismo, ^{Baiyee et al. (2019)} reportan que T. spirale T76-1 inhibió el crecimiento micelial de C. cassiicola y Curvularia aeria, en un 84.68 y 93.03%, respectivamente, los cuales son hongos causantes de la mancha foliar en lechuga (Lactuca sativa). Esto podría sugerir que las cepas de Trichoderma secretan más, o producen metabolitos más fuertes que inhiben el crecimiento micelial de fitopatógenos (^{Li et al. 2019}), además de que las especies de Trichoderma fueron aislados de diferentes lugares, lo que puede interpretarse como un ejemplo de que las especies pueden desarrollarse mediante una selección forzada por el ambiente o las condiciones ecológicas particulares (^{Moo et al. 2018}). Trichoderma ha demostrado ser un hongo muy flexible, tiene una alta capacidad re- productiva, es muy eficiente en la toma y utilización de nutrientes, además de ser muy agresivo contra hongos fitopatógenos (^{Contreras-Cornejo et al. 2016}, ^{Adnan et al. 2019}).

En lo que se refiere a metabolitos volátiles, las 13 cepas de Trichoderma evaluadas contra F. oxysporum y C. cassiicola mostraron efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los hongos fitopatógenos, en relación al testigo. Sin embargo, T. harzianum 05E-60 tuvo mayor inhibición en el crecimiento micelial sobre C. cassiicola con 71.1%, seguido de T. erinaceum 10-15 con 58.5% (Tukey, p ≤ 0.05) (Tabla 2). Por otro lado, en relación al efecto inhibitorio de crecimiento de F. oxysporum, T. virens 27-08 tuvo una mayor inhibición micelial con 46.3%, seguido de T. ghanense 21-39 con 39.7% y T. harzianum 05E-60 con 38%. Se conoce que Trichoderma spp. tienen la capacidad de producir metabolitos que generan fungistasis, es decir, inhiben la germinación de esporas de sus competidores, lo que le otorga ventaja al competir por espacio y nutrientes (^{El-Sharkawy et al. 2018}).

Al respecto, ^{Osorio et al. (2016)} reportaron resultados similares al evaluar la inhibición de Trichoderma sp. sobre el crecimiento de Rhizoctonia solani con un efecto inhibitorio de entre 7.81 y 51.56%. Del mismo modo, ^{Baiyee et al. (2019)} evaluaron la capacidad inhibitoria de T. espirale T76-1 sobre C. cassiicola y Curvularia aeria y reportaron una inhibición del 41.29 y 42.35%, respectivamente, señalando que los compuestos volátiles, junto con la competición y las actividades enzimáticas, son mecanismos involucrados en el biocontrol. Esta capacidad de producir metabolitos secundarios le otorga a Trichoderma spp. Ventajas selectivas en procesos como competencia, simbiosis, transporte de metales, señalización y actividad micoparasítica (^{Manganiello et al. 2018}).

Para comprobar la presencia los genes Epl1 y Sm1 que codifican proteínas reportadas como promotoras de la RSI en plantas, se realizó el análisis de las secuencias de nucleótidos obtenidos de los fragmentos de PCR, donde las secuencias de T. asperellum 19-31 y T. erinaceum 10-15 mostraron homología con el gen Epl1; mientras que T. virens 27- 08 y T. virens 32-09 con el gen Sm1 (Tabla 3). Esto revela que los genes Sm1 y Epl1 tienen regiones conservadas entre las secuencias de un mismo grupo de hongos previamente reportados. Al respecto, se sabe que estos genes del género Trichoderma codifican proteínas que realizan diversas funciones en su interacción con las plantas. Sm1 se ha reportado principalmente en T. virens, lo que concuerda con los resultados hallados en este trabajo, cuya función en las plantas es la inducción de genes relacionados con la defensa, la producción de especies reactivas de oxígeno y compuestos fenólicos (^{Ramírez-Valdespino et al. 2019}); sin embargo, ^{Freitas et al. (2013)} evidenciaron la presencia de Sm1 en T. atroviride y T. harzianum, pero sin determinar su función. Por otro lado, se ha reportado que Epl1, proteína elicitora de la inducción de genes relacionados con la defensa de la planta y de la activación del sistema inmune (Ramírez-Valdespino et al. 2019), está presente en un mayor número de especies de Trichoderma, en el presente trabajo se detectó en la especie T. erinaceum y, en la especie T. asperellum resultado similar a lo reportado por ^{Yu et al. (2018)}, además de que estudios previos lo reportan en T. longibrachiatum (^{Vargas et al. 2008}), T. atroviridae (^{Salas-Marina et al. 2015}), T. harzianum (^{Gomes et al. 2017}) y T. formosa (^{Cheng et al. 2018}). Tanto Sm1, como su ortóloga Epl1 son moléculas señalizadoras esenciales para lograr la aceleración en la resistencia, local y sistémica, de las plantas. De manera general, Sm1 interviene en la inducción de la RSI que se basa en la señalización del AJ y ET, mientras que Epl1 participa en la señalización del AS, necesario para la RSA (Gomes et al. 2017, Ramírez-Valdespino et al. 2019).

Las especies T. erinaceum 10-15, T. asperellum 19-31 y T. harzianum 05E-60 inhibieron en mayor porcentaje el crecimiento micelial de F. oxysporum; mientras que T. virens 32-09 y T. virens 05-02 tuvieron los mejores porcentajes de inhibición contra C. cassiicola. Los metabolitos volátiles de T. virens 27-08, T. ghanense 21-39 y T. harzianum 05E- 60 mostraron mayor efecto inhibitorio contra F. oxysporum, pero solo T. harzianum 05E-60 destacó en la inhibición de crecimiento micelial contra C. cassiicola. Cuatro cepas presentaron genes que codifican para proteínas relacionadas con la resistencia sistémica; en T. asperellum 19-31 y T. erinaceum 10-15 se identificó a Epl1, mientras que en T. virens 27-08 y T. virens 32-09 a Sm1. Por lo que estas cepas son una opción para el control de fitopatógenos como Fusarium oxysporum y Corynespora cassiicola y con el potencial de activar la respuesta sistémica en las plantas.