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Introducción
El tomate (Solanum lycopersicum L.) es el cuarto vegetal cultivado en el mundo, con una superficie de más de 3 millones de hectáreas, solo por detrás del arroz, trigo y soya (FAOSTAT 2019). En México la superficie sembrada es de 52 374 ha, con una producción de 2 875 164 t; siendo el séptimo cultivo con mayor valor solo por detrás del maíz, caña de azúcar, aguacate, pastos, sorgo y chile verde. Pero el cultivo del tomate es afectado por hongos fitopatógenos como Fusarium oxysporum que causa el marchitamiento vascular, una de las enfermedades más destructivas en regiones donde se cultiva el tomate, pudiendo causar pérdidas de 80 a 100% si no es controlado (Ates et al. 2019). Su control actual- mente se realiza con productos sintéticos, pero el uso excesivo e indiscriminado de estos productos ha ocasionado resistencia de los microorganismos hacia los ingredientes activos; debido a esto se hace necesario el desarrollo de alternativas para el control de enfermedades vasculares como la causada por F. oxysporum (Jeong et al. 2017).
Los extractos vegetales con propiedades antifúngicas son una alternativa para el manejo de enfermedades en plantas, debido a metabolitos secundarios como flavonoides, fenoles, terpenos, aceites esenciales, alcaloides, lectinas y polipéptidos, los cuales presentan mecanismos de acción variable. En el caso de los fenoles la toxicidad sobre microorganismos se atribuye a inhibición enzimática por oxidación de compuestos. El modo de acción de los terpenos y aceites esenciales no ha sido dilucidado por completo, pero se postula que pueden causar rompimiento de la membrana a través de los compuestos lipofílicos; de los alcaloides se ha postulado que se intercalan con el ADN y lo degradan. Las lecitinas y polipéptidos se conocen que pueden formar canales iónicos en la membrana microbiana o causar la inhibición competitiva por adhesión de proteínas microbianas a los polisacáridos receptores del hospedero (Górniak et al. 2019).
En el caso de México, en el desierto Chihuahuense existen gran diversidad de plantas que producen compuestos con actividad antifúngica. Entre estas plantas se encuentran Agave lechuguilla, Carya illinoinensis y Lippia graveolens. A. lechuguilla produce saponinas, esteroides y compuestos fenólicos (Tucuch et al. 2020); de C. illinoinensis se han identificado moléculas bioactivas como compuestos fenólicos y compuestos antioxidantes (Rábago-Panduro et al. 2020); mientras que L. graveolens presenta compuestos como aceites esenciales, timol, carvacrol, flavonoides y monoterpenos (García-Pérez et al. 2012). En este sentido Messgo-Moumene et al. (2017) mencionan que extractos etanolicos de C. illinoinensis presentaron actividad antifúngica de hasta el 90% de inhibición sobre Phytophthora infestans. Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad biológica de extractos etanolicos de A. lechuguilla, C. illinoiensis y L. graveolens sobre F. oxysporum en plantas de tomate bajo condiciones de invernadero.
Materiales y métodos
Colecta de plantas con actividad antifúngica
La colecta de las especies A. lechuguilla, C. illinoiensis y L. graveolens se llevó a cabo en el municipio de General Cepeda, Coahuila, México. Las muestras se colocaron en bolsas plásticas y se trasladaron al Laboratorio de Micología y Biotecnología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. En el laboratorio, las muestras se lavaron con agua, se secaron, se cortaron en piezas de un 1 cm y se separaron las distintas partes de las plantas, en el caso de A. lechuguilla se utilizaron las hojas, para L. graveolens las hojas y tallos, y el ruezno de C. illinoiensis; el siguiente paso consistió en colocarlas en estufa de secado a 60 ◦C hasta peso constante; para posteriormente pulverizarla y tamizarlas con malla de poro de 0.2 mm (Castillo et al. 2010).
Obtención de la cepa de F. oxysporum
La cepa de F. oxysporum aislada de plantas de tomate fue proporcionada por el Laboratorio de Micología y Biotecnología del Departamento de Parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Esta cepa pertenece a la colección microbiológica de dicho laboratorio. La cepa está identificada con el código FoC1, con clave de acceso al GenBank KU533843.1; para asegurar la patogenicidad de dicha cepa, se realizaron pruebas de patogenicidad, las cuales resultaron positivas.
Preparación de los extractos vegetales
Se utilizó etanol como solvente; se agregaron 14 g del polvo en 200 mL de etanol, y se colocaron en agitación durante 72 h a 50 °C (Shami et al. 2013, Jasso de Rodríguez et al. 2015). Posteriormente el extracto se filtró con papel filtro Wathman No. 1, se rotoevaporó a 150 RPM a 60 °C; se colocó en una estufa de secado para posteriormente pulverizarlo y almacenarlo a -20 °C (Martins et al. 2013).
Inoculación de F. oxysporum
Se utilizaron plantas de tomate Saladette variedad Rio Grande, las cuales se trasplantaron en macetas de 4 kg. El sustrato utilizado consistió de una mezcla de tierra y peat moss previamente esterilizado en una relación 50/50; las plantas se fertilizaron con solución Steiner mediante fertirrigación. La cepa proporcionada se cultivó en medio de cultivo PDA y se incubo durante siete días a 28 °C. Se cosecharon las esporas de F. oxysporum y se concentraron en una solución a 1x106 esporas mL−1. La inoculación de las plantas se realizó mediante un corte en la parte apical de las raíces, sumergiéndolas en la solución de conidios durante 3 min; transcurrido el tiempo se trasplantaron a las macetas.
Aplicación de los tratamientos
Los tratamientos utilizados fueron: T1 = A. lechuguilla hoja (250 mg L−1), T2 = C. illinoinensis ruezno (250 mg L−1), T3 = L. graveolens hoja (500 mg L−1), T4 = L. graveolens tallo (125 mg L−1), T5= testigo químico (Benomilo 1 g L−1), T6 = Testigo absoluto (inoculado) y T7 = control; en relación al testigo químico este se eligió ya que esta reportado para control de F. oxysporum. Estos tratamientos se seleccionaron a partir de lo reportado por Tucuch et al. (2020), por ser plantas nativas del semidesierto mexicano, y de las cuales se tiene reporte de su actividad antifúngica. Los tratamientos se aplicaron por aspersión y se realizaron tres aplicaciones. La primera fue durante el trasplante antes de colocar las plántulas en las macetas directamente en el hoyo donde se colocaron las plántulas, asperjando tres veces 15 mL; las otras dos aplicaciones se realizaron a los 15 y 40 días después de la primera aplicación, directamente en la base del tallo.
Variables evaluadas
Se evaluó la incidencia y la severidad de la enfermedad; así como variables morfométricas a los 90 días después del trasplante. La incidencia se evaluó utilizando la fórmula:
En el caso de severidad del follaje se utilizó la escala propuesta por Marlatt et al. (1996), que mide en un rango del 1 al 5, donde: 1 = sin síntomas; 2 = clorosis ligera; 3 = clorosis moderada y marchitamiento; 4 = clorosis severa y marchitamiento y 5 = muerte de la planta. Las variables morfométricas fueron: peso seco de biomasa aérea, altura de planta, diámetro de tallo y clorofila en hojas.
Diseño experimental
La prueba de efectividad biológica se estableció bajo un diseño completamente al azar con siete tratamientos y seis repeticiones. Los datos de las variables evaluadas (incidencia, severidad, peso seco de biomasa aérea, altura de planta, diámetro de tallo y clorofila en hojas) se sometieron a ANVA y prueba de comparación de medias de Tukey (p≤0.05), con el programa estadístico Statistical AnalysisSys, versión 9.0., cumpliéndose los supuestos de normalidad.
Resultados y discusión
Incidencia y severidad de la enfermedad
No se observaron diferencias estadísticas entre los tratamientos en relación al testigo absoluto (inoculado); las plantas tratadas con A. lechuguilla hoja y L. graveolens tallo fueron las que presentaron menor incidencia en relación al testigo absoluto (inoculado) con 83.33 y 91.67%, respectivamente (Tabla 1). En relación a la severidad de la enfermedad, no se observaron diferencias estadísticas entre los extractos vegetales, solamente se presentó diferencia entre el extracto de L. graveolens tallo con el testigo absoluto (inoculado). De todos los extractos vegetales, en las plantas tratadas con L. graveolens tallo se observó la menor severidad de la enfermedad con 2.08, seguidas de las plantas tratadas con los extractos de A. lechuguilla, C. illinoinensis ruezno, el testigo químico y L. graveolens hoja con 2.17, 2.58, 2.58 y 2.67 respectivamente; siendo la severidad de todos los tratamientos menor a la presentada en relación al testigo absoluto (inoculado) (Tabla 1).
Tabla 1 Incidencia y severidad en follaje de plantas de tomate por F. oxysporum tratadas con diversos tratamientos
| Tratamiento | Incidencia (%) | Severidad en follaje* |
| 1. A. lechuguilla hoja | 83.33a | 2.17ab |
| 2. C. illinoinensis ruezno | 100.00a | 2.58ab |
| 3. L. graveolens hoja | 100.00a | 2.67ab |
| 4. L. graveolens tallo | 91.67a | 2.08b |
| 5. Químico | 100.00a | 2.58ab |
| 6. Testigo absoluto (inoculado) | 100.00a | 2.75a |
| 7. Control | 8.33b | 0.25c |
*Valores con misma letra son estadísticamente iguales (Tukey, p ≤ 0.05)
El análisis de varianza demostró que no existieron diferencias estadísticas en incidencia y severidad de F. oxysporum entre tratamientos, sin embargo, numéricamente los extractos de A. lechuguilla hoja y L. graveolens tallo lograron disminuir la incidencia y severidad de la enfermedad, este efecto pudo ser debido a los compuestos fitoquímicos presentes en los extractos vegetales. En el caso del extracto de A. lechuguilla, la disminución en el desarrollo de la enfermedad se puede adjudicar a las saponinas ya que forman complejos con esteroles, los cuales pueden afectar las proteínas y fosfolípidos de la membrana del patógeno; así como a los taninos que son capaces de inhibir el transporte de electrones de la membrana del patógeno, y alterar iones como el hierro y el cobre causando inhibición de algunas enzimas esenciales para los microrganismos (Stuardo y San Martin 2008, Jasso de Rodríguez et al. 2011). El extracto de L. graveolens tallo posee flavonoides, taninos y saponinas, los cuales pueden otorgar protección a las plantas frente a la enfermedad; en el caso de los flavonoides, estudios recientes demuestran que su actividad antioxidante afecta especies reactivas de oxigeno fúngicas procedentes de las mitocondrias del patógeno, las cuales intervienen en la formación del tubo germinal y de hifas, dilucidando así el modo de acción de su actividad antifúngica (Candiracci et al. 2012, Warris y Ballou 2019); estos compuestos también están presentes en las hojas, pero en el tallo es donde podría estar concentrada la mayor cantidad. Además de los compuestos mencionados la especie L. graveolens produce monoterpenos como el timol y carvacrol los cuales inducen la activación de genes de resistencia que podrían ser los responsables de proteger a la planta por lo que disminuye la severidad de la enfermedad (Banani et al. 2018). En este sentido Hanaa et al. (2011), observaron en plantas de tomate una reducción en la incidencia de la enfermedad de la marchitez causada por F. oxysporum de hasta un 30% con extractos de Azardiachta indica y Salix babylonica. En este trabajo se observó que para L. graveolens, el tallo puede ser una fuente potencial de flavonoides que podrían servir para desarrollar nuevos compuestos con aplicaciones agronómicas como lo mencionan Güereca et al. (2007).
Peso seco de biomasa aérea y altura de planta
Se observó diferencia significativa entre el tratamiento químico y el tratamiento correspondiente a C. illinoinensis. El mayor peso seco lo presentaron las plantas tratadas con el tratamiento químico con 32.17 g, seguidas de las plantas tratadas con el extracto de A. lechuguilla con 29.41 g, L. graveolens tallo con 26.53 g, y el extracto de L. graveolens hoja con 26.28 (Tabla 2). Para la variable altura de planta presentó diferencias estadísticas entre el tratamiento químico, y los extractos vegetales en relación al testigo absoluto (inoculado). Todos los tratamientos mostraron mayor altura que el testigo absoluto (inoculado), siendo el testigo químico el que otorgó mayor porte con 84.67 cm, seguido de las plantas tratadas con los extractos de L. graveolens hojas, A. lechuguilla hoja y L. graveolens tallo con 80.58 cm, 71.75 cm y 68.58 respectivamente; en el caso de las plantas tratadas con el extracto de C. illinoinensis ruezno se observó que presentaron mayor altura en relación al testigo absoluto (inoculado); pero fueron las de menor altura en comparación a los demás tratamientos (Tabla 2).
Tabla 2 Peso seco de biomasa aerea, altura de planta, diametro de tallo, clrofila en hojas, número y peso de frutos de plantas de tomate inoculadas con F. oxysporum y tratadas con diversos tratamientos bajo condiciones de invernadero. Valores con misma letra son estadísticamente iguales
| Tratamientos | Peso seco (cm) | Altura de planta (cm) | Diametro de tallo (mm) | Clorofila en hojas (Unidades SPAD) |
| 1. A. lechuguilla hoja | 29.41ab | 71.75bc | 10.15a | 18.72b |
| 2. C. illinoinensis ruezno | 20.47d | 67.83c | 8.83c | 14.00bc |
| 3. L. graveolens hoja | 26.28bc | 80.58ab | 9.40abc | 12.96b |
| 4. L. graveolens tallo | 26.53bc | 69.58bc | 9.57abc | 16.74bc |
| 5. Químico | 32.17a | 84.67a | 9.65abc | 14.76bc |
| 6. Testigo absoluto (inoculado) | 23.84dc | 52.17d | 8.94bc | 10.89c |
| 7. Control | 26.58bc | 73.42abc | 9.76abc | 26.87a |
*Valores con misma letra son estadísticamente iguales (Tukey, p ≤ 0.05)
A pesar de no haberse presentado diferencias estadísticas en el peso seco de biomasa aérea y altura de planta, de nueva cuenta los tratamientos a base de extractos de A. lechuguilla y L. graveolens otorgaron mayor peso seco y altura en relación al testigo absoluto (inoculado), pudiéndose atribuir a la protección que otorgaron estos mediante compuestos como saponinas y taninos, así como a la capacidad de inducir resistencia de flavonoides como la luteolina, naringenina, galangina y eriodictol presentes en L. graveolens los cuales modulan la actividad de auxinas induciendo a la planta a tener mayor crecimiento (García-Pérez et al. 2012, Cruz-García et al. 2013, Mierziak et al. 2014). También la presencia de micronutrientes como Ca, F, Mg, P, K, Na, Zn, Cu, Mn y Se presentes en L. graveolens; y de N, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn y Zn en A. lechuguilla reportados por otros autores (García-Pérez et al. 2012, Cruz-García et al. 2013) pueden influir en el aumento de la biomasa y altura de plantas. Con respecto a los azucares reductores se sabe que intervienen en el desarrollo de las plantas, debido a que inducen la activación de proteínas como las ciclinas; hormonas como las auxinas; además de inducir expresión de genes que permiten mayor crecimiento e incremento de biomasa (Fu et al. 2012, Lastdrager et al. 2014).
Diámetro de tallo y clorofila en hojas
En la variable diámetro de tallo, estadística- mente el tratamiento A. lechuguilla fue el único que presento diferencia significativa en relación al testigo absoluto (inoculado), siendo los demás tratamientos estadísticamente iguales entre ellos. Las plantas tratadas con el extracto de A. lechuguilla hoja fueron las que reportaron mayor grosor en el tallo con 10.15 mm, seguidas de las plantas tratadas con el químico, L. graveolens tallo, y L. graveolens hoja con 9.65 mm, 9.57 mm y 9.40 mm respectivamente (Tabla 2). En relación a la cantidad de clorofila en hojas, no se presentaron diferencias estadísticas entre los tratamientos correspondientes a los extractos vegetales y el químico, existiendo diferencias únicamente entre los tratamientos de A. lechuguilla hoja y L. graveolens hoja en relación al testigo absoluto (inoculado). La mayor cantidad de clorofila estuvo presente en las plantas sin inoculo ya que reportaron 26.87 unidades SPAD, a estas le siguieron las plantas que recibieron los tratamientos de A. lechuguilla hoja con 18.72 unidades SPAD, L. graveolens tallo, el químico y L. graveolens hoja con 16.74 unidades SPAD, 14.76 unidades SPAD y 14.00 unidades SPAD respectivamente (Tabla 2).
El mayor diámetro de tallo pudo deberse a que los extractos vegetales pueden contener hormonas y nutrientes que afectan de forma positiva el desarrollo de la planta, induciendo mayor crecimiento como lo menciona Khan et al. (2020) quienes realizando aplicaciones exógenas de extracto de moringa reportaron mayor desarrollo en variable morfométricas de plantas de trigo.
En su metabolismo F. oxysporum produce ácido fusarico, el cuales un metabolito fúngico que contribuye a colonizar la planta hospedero ocasionando marchitamiento; debido a que contiene la capacidad de alterar el metabolismo de las plantas lo que trae la degradación de pigmentos como la clorofila. Al respecto, se observó que aunque estadísticamente las plantas tratadas con los extractos de A. lechuguilla hoja y L. gravoelens tallo no fueron diferentes al testigo absoluto (inoculado), numérica- mente presentaron mayor cantidad de clorofila en hojas; lo que puede atribuirse al efecto protector que otorgaron a las plantas mediante los diversos compuesto fitoquímicos, que afectaron el desarrollo de F. oxyporum y por lo tanto la producción de metabolitos fúngicos como el ácido fusarico (Chávez-Arias et al. 2019).
Los extractos de A. lechuguilla y L. graveolens poseen compuestos fitoquímicos como azucares reductores, flavonoides, saponinas y taninos; los cuales mejoraron el desarrollo de las plantas mediante diversos modos de acción. Dichos extractos permitieron manejar la enfermedad causada por F. oxysporum de manera eficiente, y permitieron que el desarrollo de las plantas tratadas con estos extractos fuera superior a los demás tratamientos. Por lo que el uso de extractos vegetales de A. lechuguilla y L. graveolens pueden ser efectivos para un control natural del marchitamiento vascular del tomate causado por F. oxysporum bajo condiciones de invernadero.
