nueva página del texto (beta)
Español (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
Introducción
La pudrición del tallo, la mazorca y la raíz del maíz causada por Fusarium verticillioides afecta la producción de cultivos en las regiones tropicales y subtropicales (Figueroa-López et al. 2016, Kuki et al. 2020); se transmite por el suelo y es responsable de las principales pérdidas de rendimiento además de causar pérdidas de calidad debido a la acumulación de micotoxinas en los granos (Einloft et al. 2021). Las micotoxinas son un grupo de metabolitos secundarios producidas por hongos filamentosos, las cuales causan daños a la salud humana y animal (Caglayan et al. 2020).
Una de las toxinas mayormente producidas por F. verticillioides son las fumonisinas (Kamle et al. 2019), que inducen toxicidad pleiotrópica en animales, incluyendo neurotoxicidad, nefrotoxicidad y hapatotoxicidad con un impacto relevante en la salud humana (Liu et al. 2019). En humanos están asociadas con apoptosis, cáncer de esófago y defectos del tubo neural (Ahangarkani et al. 2014). La falta y escasa accesibilidad de métodos de control eficaces y ambientalmente seguros han llevado a un mayor interés en alternativas prácticas y biológicas para reducir la ingesta de fumonisinas; los métodos químicos y agronómicos que previenen la pudrición de la mazorca de maíz no son eficientes debido a que F. verticillioides infecta sistemicamente sin producir síntomas, pudiéndose propagar desde la semilla al grano (Wang et al. 2016).
El control biológico es una alternativa prometedora y ecológicamente amigable en el manejo de enfermedades de las plantas, se reportan varios agentes de control biológico como posibles biofungicidas (Nasir et al. 2018). Los microorganismos endófitos se asocian con plantas hospederas compatibles y brindan beneficios a través de la producción de fitohormonas, la suplementación de nutrientes y la supresión del acceso de patógenos al hospedero (Singh et al. 2020). El género Bacillus es uno de los más predominantes que se encuentra en el suelo, y se han reportado diferentes especies en diversos nichos ecológicos; se sabe que los miembros de este género tienen múltiples rasgos benéficos que ayudan a las plantas directa o indirectamente a través de la adquisición de nutrientes, inducción del crecimiento mediante la producción de fitohormonas, protección contra patógenos y otros factores abióticos (Saxena et al. 2019). Las especies de Bacillus muestran actividad antimicrobiana de amplio espectro y se han utilizado como agentes de control biológico en la agricultura (Chen et al. 2020). Recientemente, se ha reportado que B. amyloliquefaciens posee actividad de biocontrol y es eficaz para controlar patógenos como: Erysiphe cichoracearum, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Fusarium avenaceum f. sp. fabae, Streptomyces scabies, Monilinia fructigena, F. graminearum, Gaeumannomyces graminis, Setosphaeria turcica, Verticillium dahliae, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum f.sp. lycoperisci, Botrytis cinerea y F. solani (Jiao et al. 2020). Por lo cual, el objetivo de esta investigación fue conocer la actividad antifúngica de dos aislamientos endófitos de Bacillus amyloliquefaciens contra Fusarium verticillioides bajo condiciones de laboratorio e invernadero.
Materiales y métodos
Aislamiento de bacterias endófitas
El aislamiento se realizó de plantas de papa variedad Fiana de acuerdo con la metodología de Pérez et al. (2010). Las cepas se caracterizaron bioquímicamente de acuerdo con las características reportadas por Schaad et al. (2001) y se mantuvieron en refrigeración a 4 ◦C hasta su corroboración molecular.
Aislamiento e identificación del fitopatógeno
F. verticillioides se aisló de plantas de maíz con síntomas de marchitez y acame. El hongo se identificó por sus características morfológicas y fenotípicas en medio de cultivo PDA y Carnation Leaf Agar (CLA) (Leslie y Summerell 2006).
Corroboración molecular de las cepas
La cepa de F. verticillioides fue cultivada durante 12 días en medio Czapek-Dox (Correll et al. 1989), las bacterias en caldo LB durante 48 h en un agitador rotatorio a 26 ◦C. La extracción del ADN genómico se realizó con la metodología de Nicholson et al. (2001). La secuenciación de las regiones parciales del gen 16S rRNA e ITS1-ITS4 se llevó a cabo por el laboratorio Macrogen. Las secuencias obtenidas se compararon con las reportadas en la base de datos del NCBI del GenBank.
Capacidad antagonista in vitro
Se estableció un ensayo en cultivo dual por triplicado (Hernández-Castillo et al. 2014). La inhibición, se calculó con la siguiente ecuación: PI = 100 - [(Cr * 100) /]. Dónde: PI = inhibición del crecimiento del hongo, Cr = crecimiento micelial del hongo y Rp = radio de la placa (Hernández- Castillo et al. 2008).
Efecto del biocontrol in planta bajo condiciones de invernadero
El cultivo de maíz (UA-Vanta) se desarrolló en un invernadero con cubierta de polipropileno. Se utilizaron macetas de 10 Kg de capacidad con suelo pasteurizado. Al momento de la siembra se inocularon 25 mL de la suspensión de 1 x 109 conidios mL−1 de F. verticillioides y simultáneamente aspersión de 1 x 108 ufc mL−1 de B. amyloliquefaciens al momento de la siembra, la segunda aplicación cuando las plantas alcanzaron 15 cm de altura y la última 15 días después de la segunda. Los tratamientos evaluados fueron: (Fv +Ba 21) F. ver ticillioides + B. amyloliquefaciens cepa 21, (Fv+Ba 53) F. verticillioides + B. amyloliquefaciens cepa 53, (Ba 21) B. amyloliquefaciens cepa 21, (Ba 53) B. amyloliquefaciens cepa 53, (Fv) Fusarium verticillioides, (T) Testigo absoluto. El experimento se estableció en un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por tratamiento. La incidencia de la enfermedad se evaluó como porcentaje; la severidad con una escala arbitraria de seis clases reportada por Castro et al. (2017).
Análisis estadístico
Las diferencias en inhibición, incidencia de la enfermedad, el peso del fruto, diámetro de tallo, peso seco del follaje y el contenido de clorofila se determinaron por la prueba de medias de Tukey (P = 0.05). La severidad fue analizada con la prueba de Kruskall-Wallis. Los análisis se realizaron con el programa SAS versión 9.0.
Resultados y discusión
Aislamiento e identificación de las cepas
Se aislaron 28 cepas de bacterias endófitas, de las cuales Bacillus amyloliquefaciens cepa 21 y B. amyloliquefaciens cepa 53 presentaron el más alto porcentaje de inhibición; las cuales se identificaron con tinción de Gram positiva, presencia de flagelos perítricos, prueba de RYU y oxidasa negativa, resultado positivo en catalasa, oxidación, fermentación y motilidad. La espora se encontró al centro del cuerpo bacteriano. Crecieron a temperaturas de 45 °C-65 °C, en pH 5.7 y en concentraciones de NaCl a 7%, pero no en 5% y 3%. Tuvieron crecimiento anaeróbico en glucosa. Produjeron ácido a partir de arabinosa y negativo en manitol. Fueron positivas en la reacción Voges-Proskauer, hidrólisis de almidón y citrato. La corroboración molecular se basó en el análisis de la secuencia del gen 16S rRNA, mostrando 99% de homología con las secuencias contenidas en la base de datos del GenBank con clave de acceso KU570451.1 y KX665550.1, respectivamente.
F. verticillioides se aisló de tallos de maíz infectados y se identificó en base a la formación de microconidios y macroconidios (Leslie y Summerell 2006, Sameer et al. 2018); la corroboración molecular arrojó 99.60% de identidad con las secuencias de F. verticillioides cepa QN0629 contenida en el Genbank con clave de acceso MN121060. El hongo F. verticillioides se identificó como el agente causal de pudrición de tallo y acame en el cultivo del maíz lo que coincide con reportes realizados por Figueroa-López et al. (2016).
Capacidad antagonista in vitro
Los resultados de la actividad antifúngica se reportan visualmente en la Figura 1, representa la experimentación con clara indicación de la zona de inhibición que fue medida en centímetros y comparados con el testigo. La inhibición de crecimiento radial del patógeno causado por las cepas antagonistas osciló de 59 a 62%. La máxima inhibición de crecimiento radial se detectó con la cepa B. amyloliquefaciens cepa 53 contra F. verticillioides con 62% de inhibición, seguida de la cepa 21 (59%). Otros aspectos de la interacción entre los antagonistas y el fitopatógeno durante el ensayo de cultivo dual fue notorio que a partir del sexto día se detuvo el crecimiento del hongo, indicando una alta competencia por el espacio y los nutrientes (Figura 2).
Figura 1 Antagonismo in vitro de Bacillus amyloliquefaciens cepa 21 (a) y B. amyloliquefaciens cepa 53 (b) sobre el crecimiento micelial de F. verticillioides en cultivos duales, evaluado a los 11 días de incubación.
La capacidad de inhibición de Bacillus se atribuye a la producción de compuestos antimicrobianos, como policétidos; síntesis de enzimas líticas, producción de hormonas, de compuestos orgánicos volátiles, competencia por espacio y nutrientes e inducción de resistencia sistémica (Pedraza et al. 2020). Bacillus amyloliquefaciens puede actuar contra F. verticillioides, F. oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum, F. proliferatum, Colletotrichum gloeosporioides, F. equiseti y F. semitectum (Xu et al. 2021). Otros géneros como Bacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Paenibacillus y Terribacillus también son antagonistas de F. verticillioides (Figueroa-López et al. 2016).
Efecto de biocontrol in planta
B. amyloliquefaciens redujo significativamente la incidencia y severidad del fitopatógeno (P < 0.0001). La cepa 53 presentó 20% de incidencia, mientras que la cepa 21 presenta 80% en comparación con las plantas inoculadas solo con el patógeno (100%). La severidad fue de 2.5 en los tratamientos de la cepa 53 y de 14.38 en la cepa 21 con relación al patógeno (40.83). Al respecto Martínez-Álvarez et al. (2016) reportan una formulación a base de Bacillus capaz de controlar F. verticillioides en invernadero. El recubrimiento de semillas de tomate con bacterias endofíticas redujo la incidencia y severidad de F. oxysporum en campo y estimularon el crecimiento de las plantas (Koohakan et al. 2020). En adición a lo anterior, se puede mencionar que las cepas de los antagonistas endófitos estudiados son promisorios para reducir la severidad de la enfermedad contra F. verticillioides.
B. amyloliquefaciens en la promoción de crecimiento
El análisis en la actividad de las cepas de B. amyloliquefaciens contra F. verticillioides incrementó significativamente el contenido de clorofila en comparación con el testigo (Tabla 1). La clorofila es un pigmento fotosintético importante para la planta, que determina en gran medida la capacidad fotosintética y, por lo tanto, el crecimiento de la planta (Li et al. 2018). La inoculación de plantas con B. cereus, B. subtilis y B. amyloliquefaciens influyó positivamente en el desempeño del mecanismo fotosintético en plantas de pimiento para aumentar la fluorescencia de la clorofila y los parámetros de intercambio de gases (Samaniego et al. 2016). La aplicación de B. thuringiensis y quitosano mejoró el crecimiento de plantas de pimiento y aumentó significativamente el contenido de clorofila, el parámetro de fluorescencia de la clorofila y el rendimiento de frutos (ALKahtani et al. 2020). La degradación de la clorofila se reduce en hojas de arroz por el efecto de Xanthomonas oryzae pv. oryzae durante la infección (Atta et al. 2018), lo que demuestra que las plantas enfermas por algún fitopatógeno tienen menos clorofila que las sanas. Por su parte, Cunha et al. (2015) mencionan que el período de más necesidad de nitrógeno es establecido en función del SPAD, comprobado al realizar la fertilización nitrogenada. Es importante mencionar que el experimento se mantuvo libre de fertilización química y los valores más altos del contenido de clorofila es por el efecto de la inoculación de las bacterias endófitas.
Tabla 1 Inducción de crecimiento de los agentes de control biológico en el ensayo de invernadero.
| Tratamiento | Clorofila (spad) | Peso fresco de fruto (gr) | Diametro de tallo (cm) | Peso seco de biomasa (gr) |
| Fv+Ba 21 | 37.5 ab | 7.3 a | 5.2 a | 7.6 a |
| Fv+Ba 53 | 37.6 ab | 9.2 a | 5.0 a | 9.5 a |
| Ba 21 | 37.9 ab | 8.9 a | 5.3 a | 9.7 a |
| Ba 53 | 40.3 a | 10.5 a | 5.4 a | 10.8 a |
| FV | 28.1 ab | 5.7 a | 4.8 a | 5.8 a |
| T | 25.4 b | 6.9 a | 4.1 a | 7.0 a |
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Tukey, P = 0.05.
Dentro de las bondades del genero Bacillus se encuentra la promoción del crecimiento vegetal; por lo que las plantas de maíz inoculadas con las cepas endófitas de B. amyloliquefaciens en ausencia del fitopatógeno se observó un incremento del peso fresco del fruto, diámetro de tallo y peso seco de biomasa aérea en comparación con el testigo (Tabla 1). La mejora de estas variables fue notoria por la cepa 53 al sobreponerse sobre el testigo y el resto de los tratamientos. Bacillus produce 1-aminociclopropano- 1-carboxilato (ACC) desaminasa que confiere la inducción de tolerancia al estrés por sequía y promoción del crecimiento vegetal en Solanum lycopersicum (Gowtham et al. 2020). La altura y el peso fresco de biomasa de plántulas de S. lycopersicum se pueden incrementar con la aplicación de filtrados libres de células de B. subtilis (Cabello et al. 2019). El género Bacillus exhibe propiedades bioquímicas como la solubilización de fosfatos, producción de ácido indolacético y actividad ACC deaminasa, relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal (Chávez-Ambriz et al. 2016). Por lo que es importante mencionar que el experimento se mantuvo libre de la aplicación de agroquímicos (fertilizantes y plaguicidas). Por lo que la cepa 53 sobresalió por su efecto estimulador del crecimiento y desarrollo de las plantas de maíz en invernadero.
Se aisló e identificó a F. verticillioides como agente causal de pudrición y acame del cultivo de maíz. La cepa 53 de Bacillus amyloliquefaciens exhibió una alta actividad antagonista contra F. verticillioides en cultivos duales. La incidencia y severidad de F. verticillioides se redujo en las plantas inoculadas con las cepas de B. amyloliquefaciens. Las cepas endófitas tuvieron efecto positivo en la inducción de crecimiento del cultivo de maíz bajo condiciones de invernadero.
