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Ecosistemas y recursos agropecuarios

versión On-line ISSN 2007-901Xversión impresa ISSN 2007-9028

Ecosistemas y recur. agropecuarios vol.8 no.3 Villahermosa sep./dic. 2021  Epub 31-Oct-2022

https://doi.org/10.19136/era.a8n3.2943 

Artículos científicos

Actividad nematicida de extractos foliares de cuatro especies de Piper contra Caenorhabditis elegans

Nematicidal activity of four Piper species foliar extracts against Caenorhabditis elegans

Oscar Carmona-Hernández1 
http://orcid.org/0000-0002-4439-0472

María de Jesús Martínez-Hernández1 
http://orcid.org/0000-0003-3049-5289

María del Socorro Fernández2 
http://orcid.org/0000-0001-6308-4625

Jorge Molina-Torres3 
http://orcid.org/0000-0003-2371-0307

Enrique Ramírez-Chávez3 
http://orcid.org/0000-0003-1689-7759

Carolina Barrientos-Salcedo4 
http://orcid.org/0000-0003-4023-8980

José Armando Lozada-García2  * 
http://orcid.org/0000-0001-9848-3722

1Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Veracruzana. Circuito Universitario Gonzalo Aguirre Beltrán s/n, Col. Zona Universitaria, CP. 91090. Xalapa, Veracruz, México.

2Facultad de Biología Xalapa, Universidad Veracruzana. Circuito Universitario Gonzalo Aguirre Beltrán s/n, Col. Zona Universitaria, CP. 91090. Xalapa, Veracruz, México.

3Departamento de Biotecnología y Bioquímica CINVESTAV-IPN Unidad Irapuato, Libramiento Norte Km 9.5. CP. 36500. Irapuato, Guanajuato, México.

4Facultad de Bioanálisis Veracruz, Universidad Veracruzana, Iturbide s/n, Col. Centro, CP. 91700. Veracruz, Veracruz, México.


Resumen:

Las especies del género Piper han mostrado potencial como biocidas naturales en diferentes organismos, lo cual es atribuible a la diversidad de metabolitos secundarios que sintetizan. Por lo cual, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto nematicida contra Caenorhabditis elegans de los extractos hidroacohólicos, etanólicos y metanólicos de cuatro especies del género Piper. Los resultados mostraron que el extracto de P. aduncum fue el que presentó mayor actividad con una concentración letal media (CL50) estimada en 0.650 mg mL-1. Se determinaron perfiles cromatográficos por HPTLC y en GC-EIMS de los extractos de mayor actividad. Los metabolitos identificados fueron alcaloides, flavonoides, terpenos, esteroles, cumarinas y saponinas. En la GC-EIMS se identificaron 67 compuestos potenciales en los extractos etanólicos. Se concluye que el extracto etanólico de Piper aduncum presentó mayor actividad nematicida (CL50 de 0.650 mg mL-1) y el de mayor número de compuestos identificados preliminarmente.

Palabras clave: Bioactividad; CG-EIMS; CL50; HPTLC; Probit

Abstract:

Piper spices haven showed a great biological potential as natural biocide, in different organism. This is attributed to the diversity bioactive metabolites present in tissue. In this research we evaluated the nematicidal activity of different foliar extracts from Piper spices against Caenorhabditis elegans. We evaluated the nematicide activity of the hydroalcoholic, methanolic and ethanolic extracts. Chromatography prolife by HTPLC and GC-EIMS of the extracts with mayor activity was obtained. The ethanolic extract from Piper aduncum displayed higher activity as lethal concentration 50 (LC50) estimated at 0.650 mg mL-1. The bioactive metabolites identified were alkaloids, flavonoids, terpenoids, steroids and coumarins. The GC-EIMS determinate 67 compounds in the higher activity extracts. Concluded the P. aduncum ethanolic extract has the higher activity and the mayor compounds diversity.

Key words: Bioactivity; CG-EIMS; HPTLC; LC50; Probit

Introducción

El género Piper comprende cerca de 1 500 especies distribuidas en las zonas tropicales, siendo más abundantes en bosques húmedos premontanos y tierras bajas, de éstas, 136 se encuentran en México y 89 en Veracruz (Jaramillo et al. 2008, Villaseñor 2016). Las especies a este género representan un recurso biotecnológico importante en la búsqueda de compuestos bioactivos. Al respecto, se ha reportado que poseen actividad bactericida, insecticida, antiprotozoaria, fungicida, antihelmíntica y nematicida, atribuibles a sus más de 700 compuestos fitoquímicos identificados (Scott et al. 2008, Carmona-Hernández et al. 2016).

Los nemátodos fitopatógenos cusan daño anualmente en aproximadamente un 7% de la producción agrícola mundial, lo cual equivale a 48 991.04 toneladas y en un estimado de 215 769.92 millones de dólares (Abd-Elgawad y Askary 2015). Algunos fitonemátodos responsables de los daños pertenecen a los géneros Melodoigyne y Globodera (Pehlivan et al. 2020), y son causantes de malformaciones en plantas de la familia Solanaceae, así como marchitamiento en algunas hortalizas y plantaciones de café (Del-Prado-Vera et al. 2018). Aunado a esto, muchas especies de estos géneros han mostrado resistencia o tolerancia a los nematicidas sintéticos (Roeber et al. 2013, Wram y Zasada 2020). Como alternativa al uso y aplicación de estos compuestos, se ha sugerido el uso de extractos naturales de plantas, en particular de las especies de Piper que se han evaluado como plaguicidas alternativos por su capacidad toxicológica. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue determinar el perfil fitoquímico y efecto nematicida de los extractos foliares de cuatro especies de Piper contra Caenorhabditis elegans, nemátodo ampliamente utilizado como modelo en bioensayos de actividad biológica por su amplia capacidad de resistencia toxicológica frente a extractos naturales y su estrecha relación filogenética con nemátodos fitopatógenos (Wang et al. 2012).

Materiales y métodos

Colecta e identificación de especímenes de Piper

Las especies utilizadas fueron: Piper amalago L., Piper aduncum L., Piper marginatum Jacq., y Piper umbellatum L., las cuales se colectaron en los municipios de Coatepec (19.436502, -96.955859) y San Andrés Tlalnelhuayocan (19.516908, -96976465), en el estado de Veracruz, México. La identificación se realizó en el Herbario XAL del Instituto de Ecología, y con la base de acceso abierto de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Intermountain Regional Herbarium Networky Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem (Carmona-Hernández et al. 2014).

Preparación de extractos

Aproximadamente 1.5 kg de hojas de cada especie se secaron a 50 ± 5 °C en una estufa, para posteriormente obtener un polvo fino (Soberon et al. 2006). A partir de este, se realizaron extracciones a reflujo continuo con etanol (EtOH), metanol (MetOH) y etanol-agua 50:50 (EtOH:H2O), en un equipo Soxhlet por 10 h continuas. Los extractos obtenidos se concentraron a presión reducida en un rotavapor a 50 °C y se estimó el rendimiento bruto (Moreno et al. 2000, Wiratno et al. 2009, Agyare et al. 2014).

Cultivo de Caenorhabditis elegans

La cepa N2 de C. elegans fue obtenida del laboratorio Evolution of Metabolic Diversity (LANGE-BIO) y se cultivó a temperatura promedio de 22 ± 2 °C, en cajas Petri con nematode medium growth (NMG) (17 g de agar bacteriológico, 2.5 g de peptona, 3 g de NaCl, 1 mL de CaCl2 1 M, 1 mL de MgSO4 1 M, 25 mL de KH2PO4 1 mL de solución de colesterol de 5 mg mL-1 en EtOH) e inoculadas previamente con Escherichia coli cepa OP50, la cual sirvió de alimento para los nemátodos ( Katiki et al. 2011, Sant’anna et al. 2013).

Bioensayos de toxicidad

Se usaron nemátodos en instar larvar L4, para ello se sincronizaron por el método de blancamiento alcalino, los gusanos se extrajeron de las cajas Petri con NMG y con solución Buffer M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 0.25 g MgSO4 7H2O en un litro de agua) (Porta de la Riva et al. 2012, Agyare et al. 2014, Ow y Hall 2015).

Se realizaron los ensayos en microplacas de 96 pozos, en cada microcelda se depositaron 10 larvas L4, con diferentes concentraciones de los extractos aleatorizados más un control (Buffer M9). El diseño experimental consistió en cinco concentraciones equidistantes del extracto de cada especie disuelto en Buffer M9, con cinco repeticiones, cada una de ellas correspondía a una placa. La exposición fue por 24 h a temperatura 22 ± 2 °C, transcurrido el tiempo se contabilizó el número de organismos sobrevivientes, mediante la inspección visual con ayuda de un microscopio estereoscópico (Roh y Choi 2007, Katiki et al. 2011, Agyare et al. 2014).

Análisis estadístico

El diseño experimental utilizado fue completamente al azar para cada extracto y se compararon entre las diferentes concentraciones, para determinar diferencias significativas y poder estimar una curva dosis-repuesta. Los resultados se expresaron en medias, graficadas en el programa Statistica 10. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, y para todos los casos se utilizó la prueba de Tukey para la comparación de medias. El cálculo de la CL50 se estimó mediante el modelo de regresión lineal Probit, donde la concentración de cada extracto fue la variable independiente y la mortalidad de las larvas en porcentaje, la variable dependiente (Finney 1987, Jensen et al. 2006), para lo cual se utilizó el programa estadístico BioStat V5.

Caracterización fitoquímica preliminar y perfiles por HTPLC

Los metabolitos secundarios se identificaron por pruebas fitoquímicas preliminares, para alcaloides, flavonoides, saponinas, cumarinas y triterpenos y esteroles, de acuerdo con una escala cualitativa (Domínguez 1979, Carmona-Hernández et al. 2014). Además, se realizaron perfiles químicos para alcaloides, terpenos, compuestos fenólicos, cumarinas y saponinas usando el equipo High Perfomance Thin Layer Chromatography (HTPLC) (CA-MAG Mutenz, Switzerland) (Lebot et al. 2014, Riffault et al. 2014). Las placas desarrolladas se digitalizaron con el software Wincats 1.4.3 y fueron tomadas con el equipo TLC Visualizar (CAMAG) a longitudes de onda de 360 y 260 nm, luz blanca visible superior e inferior. Con la ayuda del software Wincats 1.4.3 se estimaron los factores de retención (Rf) y se realizaron los perfiles gráficos mediante el modelado de bandas (Annegowda et al. 2013, Lebot et al. 2014, Upadhya et al. 2016).

Análisis por Cromatografía de Gases asociada a Espectrometría de Masas con ionización por Impacto Electrónico (CG-EIMS)

El análisis se realizó para los extractos de mayor actividad usando un equipo de GC-EIMS Agilent Technologies serie 7890A, acoplado a un detector selectivo de masas con ionización por impacto electrónico y separación por cuadrupolo de la marca Agilent Technologies serie 5979C. La separación de los compuestos se realizó en una columna DB1MS UI Agilent Technologies (60 m x 250 mm x 0.25 mm), se utilizó Helio de ultra alta pureza (99.9999) como gas acarreador a un flujo de 1 mL min-1; la temperatura de inyección fue de 250°C. La programación de la corrida fue: temperatura inicial 150 °C durante 3 min, 4 °C min-1 a 300 °C por 13 min. Los compuestos fueron identificados mediante la base de datos NIST 11 (National Institute Standard and Tecnology) (Robles-Zepeda et al. 2006).

Resultados

Actividad nematicida en C. elegans

En 11 de los 12 extractos evaluados se determinó actividad nematicida sobre C. elegans. Los extractos etanólicos fueron los de mayor actividad, seguidos de los hidroalcohólicos y los metanólicos. Los extractos etanólicos de las cuatro especies tuvieron mortalidades superiores al 90%. En los hidroalchólicos la actividad fue variada, mientras que para P. umbellatum la mortalidad fue del 100% a 3 mg mL-1, para P. amalago no superó el 40% de mortalidad. De los extractos metanólicos, el menos activo fue el de P. marginatum con 0% de mortalidad, en contraste el extracto de P. amalago presentó una mortalidad mayor a 90% seguido de P. umbellatum (Figura 1).

Figura 1 Mortalidad de Caenorhabditis elegans, después de 24 h de exposición a extractos de Piper spp. P < 0.05, a excepción del extracto metanólico de P. marginatum p > 0.05 EtOH-Etanol, MetOH-Metanol, EtOH:H2O: Hidroalcohólico al 70%. 

La CL50 estimada para el extracto etanólico de P. aduncum fue de 0.650 mg mL-1, siendo la de mayor toxicidad con menor concentración. Seguida del extracto etanólico de P. marginatum con 0.836 mg mL-1, P. umbellatum con una CL50 de 1.389 mg mL-1 y finalmente P. amalago tuvo una CL50 de 2.962 mg mL-1 (Tabla 1). Los extractos hidroalcohólicos presentaron actividad biológica en rangos no superiores al 80%; el de P. marginatum tuvo una CL50 en 2.214 mg mL-1, seguida de P. umbellatum con 3.101 mg mL-1 y P. amalago con una CL50 de 10.907 mg mL-1. Para P. aduncum la concentración letal media estimada fue de 58.677 mg mL-1, siendo el menos activo sobre C. elegans. Los extractos metanólicos fueron los de menor actividad comparados con los etanólicos y los hidroalcohólicos, donde las CL50 para P. aduncum fue de 168.741 mg mL-1, P. umbellatum de 4.630 mg mL-1, P. amalago de 4.161 mg mL-1 y P. marginatum no tuvo actividad en C. elegans.

Tabla 1 Concentración letal media (CL50) de los extractos de las especies de Piper en C. elegans

Extracto Concentración Letal Media (CL50) mg mL-1 Error estándar
EtOH 0.650 0.375
P. aduncum H2O+EtOH 50:50 58.677 10.782
MetOH 168.741 17.120
EtOH 2.962 0.202
P. amalago H2O+EtOH (50:50) 10.979 1.584
MetOH 4.161 0.456
EtOH 0.836 0.129
P. marginatum H2O+EtOH (50:50) 2.214 0.319
MetOH s/a N/D
EtOH 1.389 0.165
P. umbellatum H2O+EtOH (50:50) 3.101 0.449
MetOH 4.630 1.545

s/a: sin actividad, N/D: no determinada. EtOH-Etanol, MetOH-Metanol, EtOH:H2O: Hidroalcohólico al 70%.

Análisis fitoquímicos y perfiles por HTPLC

Mediante las pruebas fitoquímicas preliminares se identificó la presencia de alcaloides y flavonoides en los 12 extractos, las cumarinas estuvieron ausentes en los extractos de P. umbellatum, los terpenos y esteroles no se detectaron en los extractos etanólicos, y las saponinas solo se identificaron en los extractos hidroalcohólicos (Tabla 2). Por HT-PLC se identificaron las las bandas correspondientes a Rf = 0.5 y 0.6 pertenecientes a alcaloides en los tres extractos de P. amalago. Los extractos de P. marginatum tuvieron presencia de alcaloides, con Rf similar en las bandas 0.5 y 0.6; y en Piper umbellatum fue la banda de Rf = 0.6 (Tabla 3).

Tabla 2 Análisis fitoquímico preliminar de las cuatro especies de Piper

Extracto Compuesto Alcaloides Flavonoides Saponinas Cumarinas Terpenos y/o esteroles
Prueba Especie M D W A C S E SL C LB
Etanólico P. aduncum + ++ ++ + + + - n/d + -
P. marginatum + + ++ + ++ + - n/d + -
P. amalago ++ +++ +++ +++ ++ + - n/d + -
P. umbellatum ++ + ++ + + + n/d - -
Hidroalcohólico P. aduncum +++ +++ + ++ +++ +++ + n/d + +
P. marginatum +++ ++ + ++ +++ +++ + n/d + +
P. amalago +++ +++ ++ +++ ++ +++ + n/d + +
P. umbellatum + + + + + ++ + n/d - +
Metanólico P. aduncum ++ +++ + + +++ + - n/d + ++
P. marginatum ++ +++ + ++ ++ + - n/d + ++
P. amalago ++ +++ + + +++ + - n/d + ++
P. umbellatum + + + + + + - n/d - ++

Alcaloides: M = Prueba de Mayer, D = Prueba de Drangendorff y W = Prueba de Wagner. Flavonoides: A = Prueba del H2SO4, C = Prueba del FeCL2, S = Prueba de Shinoda. Saponinas: E = Prueba de la espuma, SL = Prueba de Lieberman. Cumarinas: C = Prueba de fluorescencia. Triterpenos y/o Esteroles: LB = Prueba de Lieberman-Bouchard. Intensidad: mayor +++, media++, baja +, nula - y n/d no determinada.

Tabla 3 Valores de Rf de los perfiles fitoquímicos de los extractos foliares de las cuatro especies de Piper por HPTLC. 

Extracto Compuesto Fase móvil Revelador Especie Alcaloides A D Flavonoides F PN Cumarinas C HS Saponinas S AA Terpenos T VS
Etanólico P. aduncum 0.874 0.7,0.781, 0.886 0.057, 0.17, 0.182, 0.287, 0.329, 0.44, 0.512, 0.514 0.681,0.746,0.788,0.795, 0.863, 0.969 0.04, 0.079, 0.119, 0.148, 0.184, 0.223, 0.268, 0.302, 0.707, 0.747, 0.93
P. marginatum 0.572, 0.649 0.541,0.813 0.656, 0.901 0.262, 0.37, 0.558, 0.614, 0.805, 0.951 0.025,0.096,0.106,0.179, 0.241,0.267, 0.292, 0.429, 0.485, 0.559, 0.697, 0.774
P. amalago 0.52, 0.588, 0.646, 0.786 0.752 0.648, 0.714, 0.768 0.170, 0.284, 0.239, 0.444, 0.478, 0.666 0.023, 0.099, 0.123 ,0.17, 0.197, 0.265, 0.487, 0.692
P. umbellatum 0.588, 0.648 0.739 0.646, 0.719, 0.869 0.162, 0.390, 0.685, 0.694 0.018, 0.58, 0.104, 0.126, 0.179,0.234,0.250,0.284, 0.703, 0.883
Hidroalcohólico P. aduncum 0.885 0.793, 0.802, 0878 0.514,0.681,0.795,0.864, 0.961 0.084,0.111,0.262,0.299, 0.692
P. marginatum 0.595, 0.648 0.693 0.487, 0.648, 0.759 0.116,0.167,0.649,0.805, 0.869, 0.954 0.094, 0.173, 0.212, 0.256
P. amalago 0.593, 0.632, 0.744, 0.824 0.752, 0.876, 0.886 0.648, 0.722, 0.769, 0.837, 0.847, 0.898, 0.937 0.165,0.284,0.319,0.377, 0.44, 0.67, 0.791,0.979 0.019,0.097,0.123,0.180, 0.199, 0.258 0.267, 0.484, 0.561,0.700
P. umbellatum 0.588, 0.642 0.646, 0.712, 0.761,0.863 0.397, 0.686, 0.786, 0.967 0.019,0.052,0.101,0.179, 0.14, 0.253, 0.273, 0.297
Metanólico P. aduncum 0.864 0.769, 0.878 0.180, 0.284, 0.321,0.448, 0.519, 0.68, 0.802, 0.864, 0.973 0.132, 0.18, 0.234, 0.267, 0.695
P. marginatum 0.638 0.898 0.661, 0.742, 0.797, 0.907 0.123,0.173,0,175,0.346, 0.626, 0.957 0.052,0.096,0.177,0.218, 0.712
P. amalago 0.558, 0.637 0.747, 0.886 0.653, 0.727, 0.768 0.157,0.289,0.317,0.383, 0.411,0.485 0.019,0.075,0.114,0.117, 0.197, 0.256, 0.417, 0.482, 0.697
P. umbellatum 0.597, 0.592, 0.646, 0.648 0.900 0.646, 0.761, 0.866 0.390, 0.688 0.023,0.060,0.104,0.179, 0.214, 0.272, 0.702

A: tolueno-cloroformo-etanol (28.5:57:41.5, v/v/v), F: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:26, v/v/v/v), C: acetato de etilo-tolueno (1:1 v/v) 10% ácido acético, S: cloroformo-ácido acético-metanol-agua (60:32:12:8 v/v/v/v), T: tolueno-acetato de etilo (93:7 v/v); D: Dragendorff, PNP: productos naturales polietilenglicol, HS: hidróxido de sodio 10% en etanol, AA; anisaldehído acético (115°C), VS: vainillina sulfúrica (115° C).

Los flavonoides estuvieron ausentes en el extracto hidroalcohólico de P. umbellatum, en cambio para metanol y etanol se encontró una sola banda cada una con Rf = 0.739 y 0.900, respectivamente. Los flavonoides en P. marginatum se presentaron en los tres extractos. En P. amalago, el extracto etanólico presentó el mayor número de bandas con Rf = 0.752, 0.876, 0.885. Finalmente, para los extractos de P. aduncum se determinó un Rf similar a 0.800.

Las cumarinas estuvieron presentes en todos los extractos, y el hidroalcohólico de P. amalago tuvo el mayor número de bandas con siete. Las saponinas fueron los compuestos de mayor abundancia después de los terpenos. El extracto etanólico de P. aduncum tuvo 14 bandas con Rf = 0.057, 0.17, 0.182, 0.287, 0.329, 0.44, 0.512, 0.514 0.681,0.746, 0.788, 0.795, 0.863, 0.969. Los terpenos estuvieron presentes en todas las muestras analizadas, estando mayormente representados en el extracto etanólico de P. marginatum con 12 bandas con Rf = 0.025, 0.096, 0.106, 0.179, 0.241, 0.267, 0.292, 0.429, 0.485, 0.559, 0.697, 0.774 (Tabla 3).

Análisis por GC-EIMS

En la caracterización química tentativa de los extractos etanólicos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-EIMS), se registró en su mayoría compuestos de origen terpénico y aceites esenciales, así como algunas cumarinas y compuestos fenólicos. Otros compuestos identificados tentativamente fueron cadaleno, δ cadineno, β copaeno, α-gurjuneno y calameneno para P. umbellatum (Tabla 4).

Tabla 4 Composición química del extracto etanólico de Piper marginatum determinado por GC-EIMS. 

Pico Compuesto Tiempo de Retención Área (%) Similitud
11 (Z) -Muurola-3,5-dieno 24.892 0.34 94
13 Ácido cinámico 25.935 0.48 93
14 α-Gurjuneno 26.605 0.67 99
15 Aloaromadendreno 27.337 0.66 91
17 Aromandendreno 27.849 0.3 95
18 α-Muurolene 28.086 0.58 98
19 β-Cubebeno 28.288 0.25 95
21 Biciclogermacreno 28.678 2.8 93
23 L-Calameneno 29.068 0.81 90
24 δ-Cadineno 29.159 0.54 98
25 α-Calacoreno 29.549 0.27 96
30 P-Celineno 30.713 0.56 96
31 Apiol 30.963 6.9 90
34 α-Cadinol 32.128 0.74 93
35 Cadaleno 32.487 0.2 98
41 Pineno 36.157 0.93 93
44 Ácido palmítico 38.339 11.14 99
46 Nerolidol 39.643 0.41 91
48 Ácido linoleico 41.496 10.78 99
49 α-Ácido linoleico 41.569 6.85 99
50 Ácido esteárico 41.966 3.31 99
52 Dipropil sulfito 43.489 0.69 94
59 Eicosano 51.462 0.66 94
52 α-Tocoferol 52.266 0.85 94
65 Campesterol 57.13 0.83 91

Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.

En P. aduncum se identificaron germacreno D, ácido (Z)-cinámico, γ sitosterol, estigmasterol, ácido mirístico y humuleno (Tabla 5); en P. marginatum: cadaleno, α calacoreno, aromandendreno, ácido cinámico, cis-muurol-3,5-dieno (Tabla 6); y para P. amalago: piranona, coumarano, piperonal y 2-nonadecano (Tabla 7). Finalmente, para todos los extractos analizados se identificaron tentativamente ácido esteárico, ácido linoleico y ácido palmítico.

Tabla 5 Composición química del extracto etanólico de Piper umbellatum determinado por GC-EIMS. 

Pico Compuesto Tiempo de Retención Área (%) Similitud
1 Pyranono 18.078 1.98 90
8 α-Gurjuneno 26.709 0.82 99
9 Aromandendreno 27.452 0.71 93
11 β-Cadineno 28.202 0.65 95
13 2,5-dimetil-3-metilen-hepta-1,5-dieno 28.787 3.06 90
14 β-Copaeno 29.122 0.51 92
15 Calameneno 29.183 0.81 90
16 δ-Cadineno 29.275 0.6 93
22 α-Selineno 31.305 1.24 95
23 2-isopropil-5-metil-9-metilen-biciclo-1-deceno (4.4.0) 31.951 0.45 90
24 α-Cadinol 32.255 0.85 98
25 Cadaleno 32.609 0.2 96
31 Ácido palmítico 38.485 12.2 99
32 Ácido palmítico, éster metil 39.064 0.29 96
34 Fitol 41.478 10.39 98
35 Ácido linoleico 41.654 11.57 99
36 α-Ácido linoleico 41.734 7.71 99
37 Ácido esteárico 42.160 3.17 99

Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.

Tabla 6 Composición química del extracto etanólico de Piper amalago determinado por GC-EIMS. 

Pico Compuesto Tiempo de Retención Área (%) Similitud
7 Pirano 18.066 1.38 93
8 Coumaran 20.278 1.21 93
9 Piperonal 23.417 0.47 91
21 Ácido palmítico 38.381 2.74 99
22 Ácido palmítico, éster metil 39.058 0.23 90
27 Fitol 41.502 18.77 96
28 Ácido linoleico 41.661 5.14 99
31 α-Ácido linoleico 42.191 0.39 95

Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.

Tabla 7 Composición química del extracto etanólico de Piper aduncum determinado por GC-EIMS. 

Pico Compuesto Tiempo de Retención Área (%) Similitud
6 Piperotona 21.583 0.56 96
9 Germacreno D 25.776 0.06 90
10 (Z)-ácido cinámico 26.050 0.13 95
11 Cariofileno 26.934 0.2 94
12 Humuleno 27.775 0.21 91
18 δ-adineno 29.275 0.19 95
40 Ácido mirístico 34.236 0.08 98
52 Ácido palmítico 38.503 3.07 99
53 Ácido palmítico, éster metil 39.064 0.08 95
55 Fitol 41.514 3.14 99
57 Ácido linoleico 41.788 1.53 98
58 α-Ácido linoleico 42.130 0.21 94
59 Ácido esteárico 42.192 0.78 99
69 Estigmasterol 47.433 0.03 95
73 γ-Sitosterol 51.151 0.43 91

Similitud: es el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.

Discusión

La mayoría de los extractos de las especies de Piper mostraron actividad nematicida contra C. elegans a bajas concentraciones, lo que coincide con lo reportado para otras especies del mismo género (Atjanasuppat et al. 2009). Los extractos etanólicos de las cuatro especies mostraron ser más activos que lo reportado para extractos de P. nigrum y P. betle en Schistosoma mansoni y Meloidogyne incógnita (Atjanasuppat et al. 2009, Wiratno et al. 2009, Dammini-Premachandra et al. 2014). El extracto etanólico de P. aduncum fue el de mayor actividad contra C. elegans con una CL50 estimada en 0.650 mg mL-1, similar a la reportada contra Haemonchus contortus y Melodoigyne incognita, además de tener efecto supresor en la formación de nódulos de plántulas de tomate infestadas con Melodoigyne sp. (Singh y Khuma 2006, Oliveira et al. 2014).

En contraste, se evidenció que el extracto metanólico de P. marginatum no presentó actividad en dosis de 500 mg mL-1, lo que coincide con lo reportado de que el extracto acuoso de esta especie no es efectivo contra Melodoigyne incógnita (Vinueza et al. 2006).

Los extractos etanólicos en este estudio presentaron efecto biocida mayor que el indicado en otros estudios, en los cuales los plaguicidas sintéticos como el clorpirifo, carbosulfan y deltramina, tuvieron CL50 estimadas en 19.4, 25.3 y 40 mg mL-1, respectivamente (Wiratno et al. 2009, Sant’anna et al. 2013). Esta función se puede atribuir a los diferentes compuestos secundarios presentes en los extractos, como terpenos y/o esteroles, ácidos grasos, flavonoides, compuestos fenólicos y alcaloides-amidas, las cuales actúan a nivel de sistema nervioso central en insectos y nemátodos (Scott et al. 2008, Suzuki y Yamato 2018). Compuestos como el dilapiol son agentes clastogénicos cuyo isómero apiol se encontró presente en el extracto etanólico de P. maginatum, lo que puede explicar su efecto tóxico en C. elegans (Razzaghi-Abyaneh et al. 2007, Rafael et al. 2008). Además de taninos, saponinas, glucósidos cianogénicos y otros compuestos reportados en extractos crudos de Piper que pudieran ser causantes de este efecto (Ejele et al. 2012, Varsha y Sonali 2014, Kumary Babu 2014, Shailesh 2015).

Los perfiles fitoquímicos determinados por HPTLC muestran que existe una diversidad de metabolitos secundarios presentes. Se encontró similitud en los valores de Rf, con una banda de Rf = 0.8, reportada anteriormente para P. nigrum, la cual corresponde a un flavonoide; esto puede indicar que este compuesto es químicamente similar, es decir un homólogo o isómero del mismo (Valencia 1995). Las bandas de alcaloides o alcamidas fueron escasas, y se encontraron en los extractos de tres especies de las cuatro en estudio, el compuesto más común fue el correspondiente al Rf = 0.6, que puede corresponder de manera similar a lo reportado por Rajopadhye et al. (2011), para una alcamida presente en P. nigrum (pimenta negra), P. nigrum (pimienta blanca), P. longum, P. retrofractum, P. cubeba y P. betle.

Los compuestos mayoritarios en los extractos etanólicos fueron el ácido palmítico y el fitol, ya reportados también para P. umbellatum, P. betle, P. aduncum, P. auritum, P. decurrens y P. methysticum (Parmar et al. 1997, Lee et al. 2004, Hezekiah et al. 2015). El cadineno fue identificado en sus formas β y δ, el cual fue reportado para P. marginatum, P. amalago y P. aduncum (Ferraz et al. 2010, Sant’anna et al. 2015) en el caso de β cadineno se ha reportado para P. nigrum (Bagheri et al. 2014).

Los monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos identificados como α-gurjuneno, aromandendreno, aloaromadendreno, L-calameneno, cadaleno, pineno, β-cubebeno, germacreno D, piperotona, cariofileno, piperonal, α-cadinol, β-copaeno, α-selineno y pirano estuvieron presentes en los extractos etanólicos analizados. Estos ya se han reportado para las especies de P. aduncum, P. maginatum, P. amalago y P. umbellatum (Ferraz et al. 2010, Souto et al. 2012, Oliveira et al. 2014, Brazão et al. 2104, Hezekiah et al. 2015). Por lo anterior se recomienda hacer estudios biodirigidos sobre los compuestos que pudieran ejercer el efecto tóxico o determinar si existe una asociación sinérgica entre los compuestos presentes.

Conclusiones

Los extractos etanólicos estudiados tienen efecto nematicida sobre C. elegans a bajas concentraciones, e inclusive superior a lo reportado en la bibliografía para plaguicidas sintéticos comerciales. Los extractos de Piper amalago mostraron efecto tóxico sobre Caenorhabditis elegans por debajo de 10 mg mL-1. Para las cuatro especies de Piper, los extractos metanólicos fueron los de menor actividad, seguidos de los hidroalcohólicos. El extracto metanólico de P. marginatum no tuvo actividad nematicida en las concentraciones evaluadas. Se determinó la presencia de alcaloides, terpenos, esteroles, flavonoides, saponinas y cumarinas de acuerdo con las pruebas fitoquímicas preliminares y los perfiles fitoquímicos por HTPLC. Por medio de la GC-EIMS se confirmó que cuentan con una diversidad de compuestos en su mayoría de origen terpénico y fenólico, así como componentes de aceites esenciales.

Agradecimientos

El autor del trabajo agrace al CONACYT por la beca 408116 otorgada para la realización de estudios de posgrado. Así mismo al Dr. Rafael Montiel y la Dra. Hilda Ramos del Evolution of Metabolic Diversity-LANGEBIO-CINVESTAV-IPN, Irapuato por la donación de las Cepas N2 y OP50 de C. elegans y E. coli.

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Recibido: 03 de Marzo de 2021; Aprobado: 29 de Octubre de 2021

* Autor de correspondencia: alozada@uv.mx

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