Material biológico

Hojas y flores de muérdago (P. calyculatus) se recolectaron en el Área Natural Protegida del Cerro del Palenque de Purísima del Rincón Guanajuato, México. Las recolecciones de muérdago parasitando dos hospederos identificados mediante sus características morfológicas: mezquite (P. laevigata) (^{Rodríguez-Sauceda et al. 2014}) y palo dulce (E. polystachya) (^{González y Camacho 2000}). Las cuales luego se transportaron al laboratorio a 4 °C.

El fitopatógeno C. gloeosporioides se aisló de trabajos realizados por ^{Xoca-Orozco et al. (2017)}, mientras que Fusarium sp. y Curvularia sp. se aislaron de muestras de fruto y hoja de vid, respectivamente, de un viñedo ubicado en Purísima del Rincón Guanajuato, México. La identificación se basó en el análisis de sus características macroscópicas y microscópicas de la colonia y se determinó el género con la ayuda de claves dicotómicas (^{Barnett y Hunter 1998}).

Obtención de extractos

Para obtener los extractos de hojas (EH) y flores (EF) de muérdago de mezquite (MZ) y palo dulce (PD), de manera independiente, se secaron a temperatura de 60 °C hasta peso constante en un horno Ecoshel HV-20. Para luego triturarlas en una licuadora industrial hasta tener un polvo fino que pasó por un tamiz 0.25 mm para tener una mayor superficie de contacto. Las muestras trituradas se mantuvieron en congelación a -20 °C hasta su uso.

Los extractos de muérdago de hojas y flores se obtuvieron mediante la metodología propuesta por ^{Saura-Calixto et al. (2007)} la cual se describe a continuación: se agregó metanol acidificado (8 mL L⁻¹ HCL) - agua (50-50 v/v) en una proporción de 50 mL g⁻¹ de muestra, durante 60 min a temperatura ambiente. Después se centrifugó a 3000 g (15 min, 25 °C). Posteriormente se separaron las fases, conservando el sobrenadante a 4 °C. El precipitado se lavó con acetona-agua (70:30 v/v) (50 mL g⁻¹ de muestra) durante 60 min y se centrifugó en las mismas condiciones, se combinaron los sobrenadantes obtenidos de cada lavado. A esta mezcla de sobrenadantes se eliminaron los disolventes en atmósfera reducida durante 120 min a 65 °C en un rotavapor DLAB RE100-Pro. Los extractos se almacenaron a 4 °C, en la oscuridad. Se realizó el mismo procedimiento, utilizando las mismas mezclas de solventes, pero sin la muestra de muérdago (SC) para utilizarlo como testigo en la evaluación in vitro.

Perfil fitoquímico

El perfil fitoquímico se determinó de manera cuantitativa para fenoles totales (^{Xoca-Orozco et al. 2018}) y flavonoides de acuerdo con la metodología propuesta por ^{Gajula et al. (2009}), para ello se utilizó una curva de calibración de ácido gálico (de 0 a 0.25 mg de ácido gálico ml⁻¹) para fenoles totales y catequina (de 0 a 0.1 mg catequina mL⁻¹). Además, se determinó el perfil fitoquímico de manera cualitativa evaluando la presencia de los siguientes compuestos: antocianinas, glucósidos cianogénicos, esteroles, cumarinas, alcaloides, quinonas y antraquinonas, grupos funcionales, azucares reductores, compuestos grasos y anillos aromáticos mediante los métodos especificados en la Tabla 1. Se determinó la concentración del extracto en base seca por diferencia de peso.

Evaluación de la actividad antifúngica in vitro

Por cada uno de los diferentes extractos (EH-MZ, EH-PD, EF-MZ y EF-PD) se utilizaron tres concentraciones: 10 mL de agar papa dextrosa (PDA) + 5 mL de extracto (C1 = 0.33 mL extracto mL⁻¹ medio), 11.5 ml PDA+ 3.5 mL extracto (C2 = 0.23 mL extracto mL⁻¹ medio) y 13 mL PDA+ 2 mL extracto (C3 = 0.13 mL extracto mL⁻¹ medio). Los extractos fueron mezclados con el medio PDA (∼40 °C) en cajas petri de 90 mm de diámetro. Después de que el agar se solidificó, se inocularon con discos de 5 mm de diámetro del medio PDA conteniendo crecimiento del fitopatógeno de una colonia con 8 días de incubación, en medio PDA, a 26 °C. Todos los tratamientos se incubaron a 26 ± 2 °C, hasta que las cajas de petri testigo (sin adición de extracto) ocuparan el 100% de crecimiento. Se utilizó un testigo positivo (C) el cual consistió en el fitopatógeno solo en PDA y otro testigo negativo (EC) adicionando 10 mL PDA + 5 mL de SC. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Las variables medidas fueron: crecimientos micelial, porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (%ICM), esporulación final, germinación y la determinación del efecto fungicida o fungistático, de acuerdo a la metodología propuesta por ^{Xoca-Orozco et al. (2019)}.

Crecimiento micelial y %ICM

A cada una de las cajas de petri conteniendo los tratamientos y testigos se les realizó la medición del diámetro del crecimiento con ayuda de un vernier, la medición se realizó diario hasta que el testigo EC ocupara el 100% del crecimiento en la cada de petri. Para calcular el %ICM se utilizó la siguiente relación: (Diámetro colonia testigo EC - diámetro colonia tratamiento) / (Diámetro colonia testigo EC diámetro sacabocados de inoculación) * 100.

Esporulación final

Cuando el testigo EC alcanzó el 100% de crecimiento para cada caja de petri (incluyendo los testigos) se obtuvo una suspensión de esporas, adicionando 10 mL de agua destilada estéril y raspando la superficie con una varilla de vidrio estéril, estas suspensiones se filtraron a través de gasas estériles, depositándose en tubos de ensaye estériles. Para el conteo de esporas se tomaron 50 µL de las distintas soluciones colocándolas sobre la cámara de Neubauer, visualizándose a través de un microscopio utilizando el objetivo 40X. Una vez obteniendo el conteo de esporas se transformaron los datos a logaritmos (base 10) y se calculó la reducción de esporas respecto al testigo EG.

Porcentaje de germinación

A partir de cajas petri conteniendo el fitopatógeno con 8 días de crecimiento, en medio PDA, se realizó una suspensión de esporas. Se tomaron alícuotas para tener una concentración de 1 x 10⁶ esporas mL⁻¹ y se colocaron en tubos eppendorf de 2 mL conteniendo las mismas concentraciones de extractos y medio papa-dextrosa líquido. Los tubos se incubaron en agitación constate a 26 ± 2 °C, hasta que el testigo EC tuviera un 100% de germinación. Se consideró una espora germinada cuando el tubo germinativo fuera igual al tamaño de la espora. Posteriormente se realizó un conteo de esporas germinadas y no germinadas con ayuda de una cámara de Neubauer y determinando el porcentaje de germinación.

Determinación del efecto fungicida o fungistático

Transcurrido el periodo de incubación del ensayo del porcentaje de germinación, los tubos eppendorf se centrifugaron a 2000 g por 5 minutos a 26 °C, se retiró el sobrenadante y se le adicionó 1 mL de agua destilada estéril, este lavado se repitió 3 veces. Finalmente se tomaron 200 µL y se colocaron en cajas con medio PDA para registrar el crecimiento micelial. Las cajas que presentaron crecimiento igual que el control se determinaron que tienen efecto fungistático y aquellos que no presentaron crecimiento el efecto fungicida.

Análisis estadístico

Para determinar si los datos obtenidos cumplen con una distribución de normalidad, se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk (p < 0.05) (Tabla 2). Las diferencias entre medias de los datos no paramétricos fueron analizadas mediante la prueba de Kruskal-Wallis (p < 0.05), mientras que para los datos que cumplen con el supuesto de normalidad se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y comparaciones de medias por una prueba de Tukey (p < 0.05), empleando el paquete estadístico Rstudio.

Perfil fitoquímico

El perfil fitoquímico cualitativo y cuantitativo mostro que el contenido de fenoles totales (Tabla 1), se presenta en mayor cantidad en el extracto EH-MZ mientras que los flavonoides tuvieron una mayor concentración en EF-PD. El perfil fitoquímico mostró que las antocianidinas fueron positivas en EF-MZ, mientras que esteroles, anillos aromáticos y alcaloides (determinados por los métodos de Mayer y Erdman) solo en EH-MZ, siendo este extracto el de mayor cantidad de positivos en el análisis cualitativo. Para el resto de los componentes no se encontraron diferencias.

Actividad antifúngica in vitro

La cinética de crecimiento in vitro muestra que no hubo afecto significativo entre los testigos C y EC (Figura 1), así mismo la C1, en todos los extractos presentaron mayor actividad para inhibir el desarrollo in vitro de los tres fitopatógenos evaluados. El mayor %ICM se presentó para EF-PD en C. gloeosporioides y Fusarium sp., y en EH-MZ para Curvularia sp., en los tres casos en los tratamientos de mayor concentración (Figura 2). Curvularia sp., fue el que presentó mayor sensibilidad a bajas concentraciones presentando un %ICM mayor al 50% con respecto a los testigos.

Figura 1 Cinética del Crecimiento micelial in vitro de C. gloeosporioides (A, B, C), Curvularia sp., (D, E, F) y Fusarium sp., (G, H, I) ante las diferentes concentraciones y extractos de muérdago. Gráficos izquierda concentración C1 (4.9 mg mL⁻¹), centro C2 (3.4 mg mL⁻¹) y derecha C3 (0.7 mg mL⁻¹). Eje y = crecimiento en mm; eje x = días de incubación. 

Figura 2 Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de las diferentes concentraciones de extractos utilizados. A = C. gloeosporioides, B = Curvularia sp. y C = Fusarium sp. Letras iguales no presentan diferencia significativa entre los diferentes tratamientos evaluados (Tukey, p < 0.05, n = 3). 

En cuanto a la esporulación final, C. gloeosporioides presentó una reducción de 1.2 logaritmos en C1-EF-MZ, siendo esta la menor reducción de logaritmos alcanzada por los extractos. Mientras que, para Fusarium sp., se logró la reducción de 2.4 logaritmos con C1-EH-PD y finalmente Curvularia sp., presentó una reducción de más de 3 logaritmos utilizando extractos provenientes de flores de muérdago (Figura 3).

Figura 3 Reducción de logaritmos respecto al control (EC-) (Eje X) de los diferentes tratamientos para (A) C. gloeosporioides, (B) Curvularia sp. y (C) Fusarium sp. Letras minúsculas iguales no presentan diferencia significativa entre los diferentes extractos para cada concentración evaluada (p < 0.05, n = 3). 

En cuanto a la germinación de los conidios por tratamiento, C. gloeosporioides presentó un máximo de 7% de germinación ante EF-M, Curvularia sp., 16% ante EF-PD mientras que, en Fusarium sp., no presentó germinación en ningún tratamiento (Tabla 3). Una vez eliminado los extractos y volviendo a poner las esporas en medio PDA, el crecimiento radial tuvo la misma cinética que el control por lo que se determinó que el efecto de inhibición es un efecto fungistático. Considerando los resultados, sin tomar en cuenta las características de susceptibilidad de cada fitopatógeno, el análisis estadístico muestra que no existe diferencia significativa (Tukey, p < 0.05, n = 9), en las diferentes concentraciones de los extractos evaluados (EHMZ, EHPD, EFMZ y EFPD) en la evaluación del %ICM (Tabla 4).