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Introducción
La producción de rumiantes en México se lleva a cabo principalmente bajo condiciones de pastoreo extensivo en las regiones tropicales y se utiliza forraje de corte o en pastoreo, en ambos casos, el forraje es de gramíneas nativas e introducidas (Hernández-Medrano y Corona 2018). Así mismo, en sistemas de producción de leche en pequeña escala en los valles altos del centro de México el pastoreo se lleva a cabo en praderas cultivadas principalmente de festuca alta (Lolium arundinaceum), ballico (Lolium perenne), entre otras (López-González et al., 2020). Tanto en las zonas templadas como tropicales las gramíneas son la fuente principal de alimentación para los rumiantes (Torres-Salado et al. 2020). Sin embargo; la literatura sugiere que se pueden encontrar diferencias en los productos de la fermentación entre las especies forrajeras consumidas por los rumiantes (Eugène et al. 2021). Durante el proceso se producen diversos compuestos tales como: ácido acético, propiónico, butírico, CH4 y CO2 Los pastos fermentados en el rumen presentan diferentes valores de digestibilidad, concentración de ácidos grasos volátiles (AGV), producción de metano (CH4) y bióxido de carbono (CO2) (Camacho-Escobar et al. 2020). Archimède et al. (2011), reportaron diferencias en la producción de CH4 en gramíneas C3 (gramíneas de clima templado) y C4 (gramíneas de clima tropical) de 33.7 vs 30.5 L. kg MS consumida-1en gramíneas C3 y C4 respectivamente. Sobre lo mismo Kamra et al. (2010) sugieren que la mayor producción de CH4 asociados con la alimentación de gramíneas C4 puede atribuirse a un mayor contenido de carbohidratos estructurales y lignina, menor con- sumo y tasa de pasaje más lenta. Tanto CH4 como CO2 están estrechamente relacionados con el calentamiento global del planeta (Ku Vera, 2020). El CH4 producido durante la digestión de los rumiantes es eructado a la atmosfera y contribuye con el 30% a las emisiones diarias de este compuesto (Black et al. 2021). Así mismo, también se produce una cantidad sustancial de dióxido de carbono (CO2), con una relación CH4: CO2 de 4:1 (Clauss et al. 2020). Los sistemas de alimentación de rumiantes basados en forrajes de alta calidad pueden disminuir la contribución de los gases efecto invernadero derivados de la agricultura y ganadería (Eugène et al. 2021). Por lo tanto, la identificación de estas características en las gramíneas que son la principal fuente de forraje puede ofrecer alternativas de alimentación más sustentables para los rumiantes. El objetivo de esta investigación fue: Evaluar la producción in vitro de metano (CH4), dióxido de carbono (CO2), y variables fermentativas de gramíneas templadas y tropicales.
Materiales y métodos
Localización del área de estudio
Las praderas templadas estuvieron establecidas en los Campus Puebla y Montecillo, y las tropicales en el área de praderas del Campus Veracruz, del Colegio de Postgraduados. La fase de laboratorio se realizó en el Laboratorio de Microbiología Ruminal del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo; localizado en la carretera México-Texcoco Km. 36.5, Montecillo, Texcoco, 56230, Estado de México.
Muestras
Los pastos templados que se colectaron en Montecillo fueron: Lolium perenne (Ballico perenne), Festuca spp. (Festuca), Pennisetum clandestinum (kikuyo) y los del Campus Puebla fueron: Dactylis glomerata (ovillo), Lolium multiflorum (Ballico anual). Las praderas de ambos lugares contaban con riego, se colectarón muestras a los 30 días del rebrote, cortando la parte aérea a 5 cm del ras del suelo utilizando un cuadrado de madera de 50 cm x 50 cm para hacer una muestra compuesta de cada especie. Las parcelas eran de 500 m2, aproximadamente y se colectaron 10 muestras al azar en cada parcela. Los pastos de zonas tropicales fueron: Brachiaria brizantha (Insurgente), (Cynodon nlemfuensis (estrella), (Panicum máximum (Guínea) cv. Tanzania, (Pennisetum purpureum (elefante), Andropogon gayanus (llanero) y Cynodon dactylon (bermuda). Las praderas tenían cuatro años de establecidas, de temporal, y se aplicó el mismo método de muestreo que para los pastos tropicales. Estos pastos tenían entre 35 y 40 días de rebrote.
Análisis químico
Las muestras de las gramíneas se secaron a 60°en una estufa de aire forzado, aproximadamente 48 h. Después se molieron a 1mm en un molino Willey (Arthur H. Thomas, Philadelphia, PA®). La composición química de las gramíneas se determinó por los métodos de la AOAC (2005); materia seca (MS; método 930.15), cenizas (método 942.05), y proteína cruda (PC; método 984.13. El contenido de fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA) y hemicelulosa se determinó con el método de Van Soest et al. (1991).
Producción in vitro de biogás
Se pesaron 0.5 g de materia seca (MS y se colocaron en viales serológicos de 120 mL, se agregaron 45 mL de medio de cultivo para bacterias totales (Cobos y Yokoyama 1995). Las fuentes de energía se sustituyeron por las gramíneas a evaluar. Los viales con el pasto y el medio de cultivo se usaron como biofermentadores y se consideraron como una unidad experimental. Se incubaron a baño María a 39°C y se inocularon con líquido ruminal fresco centrifugado a 1 257 xg por 3 minutos. Al finalizar la inoculación se tomó como la hora 0 de fermentación.
Inóculo
El líquido ruminal se colectó (250 mL) de una vaca Holstein con cánula en el rumen, dos horas después de la alimentación de la mañana, la cual se alimentó con alfalfa 40 g, ensilado de maíz 30 g y alimento concentrado para vacas en lactancia (30 g), por cada 100 g de dieta.
Medición in vitro de biogás
Se midió a las 24, 48 y 72 h y se sumó la cantidad de biogás total de 72 h de fermentación. La captura de biogás fue con el método de trampas de solución salina saturada (36 g de NaCl por 100 mL de agua destilada) a pH 2 descritas por Cobos et al. (2018). A las trampas que capturaron el biogás por las 72 h se les determinó la proporción de los gases (CH4 y CO2), la cual se midió con un cromatógrafo de gases de Perkin Elmer® Se utilizó una columna empacada Porapack y un detector de conductividad térmica; las condiciones de trabajo fueron: temperatura del horno, 80°C, columna empacada (PKD), 170°C y Detector de Conductividad Térmica, 130°C. Los tiempos de retención fueron: 0.71 min para CH4 y 1.05 para CO2. El gas acarreador de la columna (PKD) fue helio a un flujo de 23 mL min-1.
Análisis de las variables de fermentación
A las 72 h de fermentación se tomaron muestras de 1 mL de la fase líquida fermentada en tubos Eppendorf® de 2 mL; se fijaron con ácido metafosfórico al 25% en una proporción 4:1, y se congelaron a -4°C, con el fin de conservar la muestra para posteriormente medir la concentración de ácidos grasos volátiles (acético, propiónico y butírico) por cromatografía de gases (Erwin et al. 1961), el análisis se realizó en un cromatógrafo de gases Clarus 500 Perkin Elmer®, con un detector de ionización de flama, y columna capilar Elite FFAP Perkin Elmer®. Las condiciones del análisis fueron las siguientes: temperatura del horno; 115°C por 0.25 min, 125°por 0.5 min y 130°C por un min, la temperatura de la columna fue: 250°C, se utilizó nitrógeno como gas acarreador con un flujo de 23.3 mL por minuto y aire e hidrógeno para combustión de la flama, la inyección se realizó de manera automática con un volumen de 1 µL. Los tiempos de aparición fueron de 1.3 min para el ácido acético, 1.6 min para el ácido propiónico y 2.15 min para el ácido butírico. El pH se midió directamente del fermentador con un potenciómetro marca ORION®, calibrado a pH 4 y 7. Para determinar la concentración de bacterias ruminales, se tomó una muestra de 1 mL de la fase liquida del biofermentador y fijada con formaldehído al 10%. Se realizó el conteo directo en una cámara Petrroff Houser® en un microscopio Olympus® a una magnificación de1000X con la técnica de Harrigan, y MacCance, (1976) . Para calcular la concentración final se usó la siguiente formula:
Donde: X = media de los conteos de bacterias en los cuadros de la cámara PetroffHausser®. FD = factor de dilución. 2 x 107 = factor de corrección de la cámara Petroff-Hausser® para una conversión de datos a un volumen de 1 mL.
Diseño experimental, variables evaluadas y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar, con cinco repeticiones por tratamiento. Las variables pH, concentración molar total de AGV, producción acetato, propionato y butirato, concentración de bacterias totales, producción de biogás total, CH4 y CO2 acumulados se midieron a las 72 h. Los resultados se analizaron con GLM de SAS (2011) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). Para cumplir con la normalidad y homogeneidad de varianzas, los datos de concentración de bacterias se transformaron a Log 10, previo al análisis estadístico.
Resultados y discusión
La composición química de las gramíneas evaluadas se muestra en la Tabla 1. El pH de las gramíneas a las 72 h de fermentación (Tabla 2) estuvo dentro del rango 6.0-6.9, en el cual se desarrollan las bacterias ruminales de manera óptima (Kamra 2010). Sin embargo, fue diferente entre las gramíneas (P< 0.05); C. nlemfuensis y C. dactylon tuvieron el pH más alto (6.9) en comparación con L. perenne (6.5). Se ha reportado que el pH cambia según el tipo de fermentación que se lleve a cabo; sustratos altos en carbohidratos estructurales incrementan la producción de hidrógeno y CO2, precursores de la producción de CH4, en contraste sustratos altos en carbohidratos solubles disminuyen el pH, pero reducen la producción de CH4 (Poulsen et al. 2012). Los resultados son similares a los publicados por Camacho-Escobar et al. (2020) quienes evaluaron pastos tropicales in vitro en la Costa de Oaxaca, México y obtuvieron un pH promedio de 6.5 y Dillard et al. (2017) reportaron el pH de 6.8 en la fermentación de Dactylis glomerata.
Tabla 1 Composición química de gramíneas templadas y tropicales (%)
| Gramínea | MO | Cenizas | PC | FDN | FDA |
|---|---|---|---|---|---|
| Lolium perenne | 88.06 | 11.94 | 11.15 | 67.87 | 44.59 |
| Pennisetum clandestinum | 85.33 | 14.67 | 24.90 | 57.72 | 33.55 |
| Festuca sp. | 85.29 | 14.71 | 22.86 | 50.72 | 32.70 |
| Lolium multiflorum | 85.12 | 14.88 | 13.61 | 57.52 | 38.16 |
| Dactylis glomerata | 86.29 | 13.65 | 24.83 | 56.27 | 35.00 |
| Cynodon nlemfuensis | 87.88 | 12.12 | 10.69 | 73.40 | 41.21 |
| Brachiaria brizantha | 89.60 | 10.40 | 8.42 | 71.66 | 49.33 |
| Andropogon gayanus | 90.99 | 9.01 | 15.01 | 69.84 | 34.08 |
| Pennisetum purpureum | 89.47 | 10.53 | 8.12 | 76.25 | 46.14 |
| Panicum máximum cv Tanzania | 87.09 | 12.91 | 8.17 | 72.65 | 42.30 |
| Cynodon dactylon | 89.69 | 10.31 | 11.36 | 75.67 | 41.06 |
MO: Materia orgánica, PC: Proteína cruda, FDN: Fibra detergente neutro, FDA: Fibra detergente ácido.
Tabla 2 Características de fermentación de gramíneas templadas y tropicales.
| Tratamiento/variable | pH | Bacterias totales | Acético | Propiónico | Butírico | AGV totales |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 109 mL-1 | mM por 100 mM producidos | Mm | ||||
| Lolium perenne | 6.69 ab | 7.2 a | 61.14 cb | 26.14 a | 12.71 c | 95.95 a |
| Pennisetum clandestinum | 6.49 b | 11 a | 63.89 b | 22.20 b | 13.91 b | 85.19 ab |
| Festuca sp. | 6.79 ab | 4.6 a | 63.81 b | 21.87 b | 14.31 ab | 83.15 bc |
| Lolium multiflorum | 6.79 ab | 7.4 a | 58.61 c | 28.75 a | 12.63 c | 89.178 ab |
| Dactylis glomerata | 6.86 ab | 9.5 a | 63.51 b | 21.36 b | 15.12 a | 72.66 c |
| Cynodon nlemfuensis | 6.9 a | 6.2 a | 70.38 a | 21.43 b | 8.190e | 34.96 d |
| Brachiaria brizantha | 6.79 ab | 7.8 a | 70.04 a | 21.45 b | 8.50de | 36.46 d |
| Andropogon gayanus | 6.8 ab | 7.5 a | 69.91 a | 22.09 b | 7.98e | 41.62 d |
| Pennisetum purpureum | 6.75 ab | 4.2 a | 70.57 a | 21.09 b | 8.33e | 38.69 d |
| Panicum máximum cv Tanzania | 6.71 ab | 4.4 a | 69.07 a | 23.01 b | 7.90 e | 39.85 d |
| Cynodon dactylon | 6.66 a | 7.3 | 62.91 b | 27.57 a | 9.31 d | 44.9 d |
| EEM | 0.78 | 0.71 | 0.56 | 0.18 | 2.28 | |
a,b,c Valores con literales diferentes en una columna son diferentes estadísticamente (Tukey; P < 0.05), mM: concentración milimolar, AGV; ácidos grasos volátiles, EEM: Error estándar de la media.
Otro de los factores que intervienen en la formación del CH4 en el rumen es la producción de ácidos grasos volátiles (AGV; acético, propiónico y butírico) (Tabla 2). Las gramíneas templadas produjeron mayor cantidad de AGV (P < 0.05) lo que representa más del doble que las tropicales (86.27 mM y 39.42 Mm gramíneas templadas y tropicales, respectivamente). Especies como el L. perenne, Dactylis glomerata, L. multiflorum y Pennisetum clandestinum tuvieron mayor producción de AGV (P < 0.05). El pasto Dactylis glomerata produjo mayor cantidad de ácido propiónico y biogás total, estas características están asociadas e influyen de manera inversa; la ruta de formación de propionato compite directamente por el uso de hidrógeno en el rumen (Lascano et al. 2011), quedando una menor disposición de este para la producción de CH4 (Martin et al. 2010), por el contrario la producción de ácido acético y butírico en el rumen resulta en una liberación neta de hidrógeno y favorece la producción de CH4 (Lascano et al. 2011). Dillard et al. (2017) reportaron una fermentación similar para Dactylis glomerata (68.4, 21.9 mol por 100 mol producidos de acético propiónico y butírico), y 2.13 mg de CH4 por g de materia orgánica consumida.
La producción de ácido acético se incrementó (P < 0.05) en gramíneas tropicales, las cuales también mostraron una disminución en ácido propiónico y butírico. Cabe señalar que los productos de la fermentación C. nlemfuensis considerada como una gramínea tropical tuvo un comportamiento similar a las gramíneas templadas. Aunque los metabolitos de la actividad bacteriana fueron diferentes, la población microbiológica fue similar (70 x 109 mL-1, P > 0.05).
La producción de biogás (Tabla 3) fue mayor en las gramíneas tropicales 182.61 mL g MS-1 comparado con las templadas las cuales produjeron 89.84 mL g MS-1, este mismo comportamiento se observó en la producción de CH4 (66.93 y 26.73 mL MS-1 respectivamente; Tabla 3), y CO2 (121.58 y 49.52 mL g MS-1). Pennisetum purpureum fue la gramínea con mayor producción de biogás (P< 0.05), CH4 y CO2 (282.17, 82.90, 174.66 mL, respectivamente) y Dactylis glomerata la que produjo menor (P < 0.05) cantidad (55.88, 23.28 y 36.87 mL, respectivamente). Este comportamiento puede ser explicado por la cantidad de FDN que en promedio contenían las gramíneas tropicales de este estudio 73.24% comparado con las templadas 58.02% lo que se relaciona directamente con la producción de CH4, por la cantidad de paredes celulares. Sin embargo, la cantidad de CH4 fue menor a la reportada por Ley de Coss et al. (2018) quienes evaluaron gramíneas tropicales y reportaron en promedio 353.9 mL por gramo de MS fermentada. Resultados presentados por Archimède et al. (2011) indican que animales alimentados con plantas C3, (de clima templado producen menos CH4 que las C4 (de clima tropical) (30.0 L Kg MS-1 consumida y 33.7 L Kg MS-1 consumida).
Tabla 3 Producción de biogás, metano y bióxido de carbono acumulado a 72 h (mL).
| Tiempo de fermentación, h | Biogás | Metano | Dióxido de carbono |
|---|---|---|---|
| Tratamiento | |||
| Lolium perenne | 71.18 d | 24.00 e | 51.05 d |
| Pennisetum clandestinum | 79.44 d | 34.85 d | 54.04 d |
| Festuca sp. | 172.16 c | 28.47 de | 50.3 d |
| Lolium multiflorum | 70.56 d | 23.09 e | 55.34 d |
| Dactylis glomerata | 55.88 e | 23.28 e | 36.87 d |
| Cynodon nlemfuensis | 194.24 b | 53.60 b | 124.5 b |
| Brachiaria brizantha | 200.51 b | 53.07 b | 120.5 bc |
| Andropogon gayanus | 189.95 b | 57.77 b | 111.18 bc |
| Pennisetum purpureum | 282.17 a | 82.90 a | 174.66 a |
| Panicum máximum cv Tanzania | 157.7 c | 43.23 cd | 97.75 c |
| Cynodon dactylon | 170.65 c | 44.10 c | 100.9 bc |
| EEM | 5.96 | 3.03 | 8.44 |
a, b, c Valores con literales diferentes en una columna son diferentes estadísticamente (Tukey; P < 0.05), EEM: Error estándar de la media.
El Pennisetum purpureum produjo mayor cantidad de ácido acético y menor de ácido propiónico características fermentativas que influyeron en la producción de biogás (CH4 y CO2) resultando la formación de H2 disuelto en el rumen, factor clave que determina las vías de formación de AGV y los productos finales formados por los metanógenos ruminales que transforman el H2 a CH4 (Sun et al. 2022). Sawatdeenarunat et al. (2021) reportaron una producción similar de AGV de 63.85 donde también se reflejó mayor cantidad de ácido acético y menor de ácido propiónico (63.85 y 19.73 mM por cada 100 mM producidos de acético y propiónico, respectivamente). Las gramíneas con características fermentativas deseables fueron: L. perenne, Dactylis glomerata, y L. multiflorum, consideradas gramíneas templadas produjeron más AGV, ácido propiónico vs acético también fueron los pastos que menos biogás produjeron, por lo que se puede asumir que sus carbohidratos eran menos disponibles y como consecuencia también obtuvieron menores cantidades de CH4. Amaleviciute-Volunge et al. (2020) reportaron cantidades mayores de CH4 en Dactylis glomerata 213.9L CH4 kg MS-1 y 205.7 L CH4 kg-1 en L. perenne. Sin embargo, Apráez et al. (2012) reportaron aproximadamente 45 mL CH4 g MS-1. Melesse et al. (2017) reportaron cantidades menores de aproximadamente 150 mL de biogás g MS-1 y 30 mL de CH4 g MS-1 en gramíneas similares como Barachiaria mutica, Cenchrus ciliaris y Chloris gayana. Por lo que se concluye que: las gramíneas que tuvieron características fermentables deseables para la producción de rumiantes (mayor producción de AGV y cantidades menores de CH4) fueron: Lolium perenne, Dactylis glomerata y Lolium Multiflorum. Las cuales podrían ser incluidas en las dietas para rumiantes en las zonas templadas de México.
