Material vegetal

Se utilizó semilla de pepino variedad Poinsett 76 (SAKATA^®, México, Zapopan Jalisco), de crecimiento anual indeterminado, estructura suelta, polinización abierta y producción precoz.

Nanopartículas de hidroxiapatita (nHAp)

Nanopartículas de hidroxiapatita (nHAp) Se usaron nanopartículas de hidroxiapatita sintetizadas y caracterizadas según el procedimiento descrito por ^{Flores-Hernández et al. (2020)}. La reacción química utilizada fue por precipitación húmeda y se ejecutó de acuerdo con la siguiente ecuación:

Posterior a la reacción química húmeda se obtiene un precipitado, el cual se pasó por estufa de secado a 70 °C por 24 h para eliminar el exceso de agua, resultando una delgada capa de material sólido.

Caracterización de nHAp por potencial Zeta (PZ)

Se determinó el PZ utilizando un equipo microtrac ZETA-check de Colloid Metrix Company^© 2021 (Microtrac Retsch GmbH, Duesseldorf, Germany), el cual es un analizador de dispersión dinámica de luz (DLS) que proporciona información sobre el tamaño de las partículas, el potencial Zeta, concentración y peso molecular. Permite mediciones rápidas con tecnología confiable, precisión y exactitud. El potencial Zeta determina la carga superficial de las nanopartículas al medir su potencial eléctrico, esto representa la cantidad de repulsión o atracción electrostática (o carga) entre las capas que rodean a la partícula (^{Cano-Sarmiento et al. 2018}). Este parámetro indica cómo se afecta la estabilidad de las NPs en una suspensión y proporciona información sobre las causas de la dispersión, agregación o floculación (^{Mikolajczyk et al. 2015}).

Tratamientos aplicados de nHAp

Se utilizó nHAp con tamaño entre 10 y 45 nm. La concentración inicial fue de 5 000 mg L^-1 , la cual fue suspendida en agua desionizada estéril y dispersada durante 30 min con un sonicador Tianjing Autoscience (AS2060 Instrumental Factory, Tianjing, China). Se realizaron los cálculos correspondientes para diluir la solución inicial y obtener siete concentraciones diferentes. Los tratamientos evaluados fueron a 25, 50, 100, 200, 500, 1 000 y 2 000 mg L^-1 y un control con agua destilada.

Germinación de semillas y crecimiento de plántulas

Se utilizaron lotes de 100 semillas para cada tratamiento, con pinzas de disección se realizó la distribución de las semillas en cajas Petri de 100 x 15 mm. En la etapa de imbibición se agregó cada tratamiento con una pipeta, la dosis fue de 10mL de suspensión de nHAp. Posteriormente, las semillas se mantuvieron durante 4 h en una cámara de crecimiento, modelo Equitec EGCS 3S, 301 3SHR (Equitek, Guadalajara, México), programada a 25 °C ± 2 °C con fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.

Posterior al período de imbibición, se seleccionaron 75 semillas al azar por tratamiento, las cuales se sembraron en tres repeticiones de 25 semillas distribuidas horizontalmente sobre papel Anchor (Seedburo Equipment Company, Hidalgo, TX, U.S.A.), previamente humedecido con agua destilada. Se tomó en cuenta la dirección del embrión colocándolo hacia abajo; posteriormente se humedeció otro papel anchor del mismo tamaño para cubrir la semilla, al estar unidos los dos papeles anchor se procedió a enrollarlos para después colocarlos en bolsas de plástico, las cuales a su vez se acomodaron en cestas de polietileno de 20 cm de ancho x 45 cm de altura, en seguida se introdujeron en la cámara de crecimiento durante siete días bajo las mismas condiciones de temperatura y fotoperíodo.

Variables evaluadas

Las variables de vigor de semilla (V%), porcentaje de germinación (G %), longitud de plúmula y radícula (LP y LR) y peso seco (PS), se evaluaron de acuerdo con las normas del ^{ISTA (2004)}. También se determinaron el índice de germinación normalizado (IGN) e índice de elongación de la radícula (IER) de acuerdo con indicado por ^{Bagur-González et al. (2011)}.

Diseño experimental y análisis estadístico

El diseño del experimento fue completamente al azar con ocho tratamientos y tres repeticiones por tratamiento. La unidad experimental consistió en 25 semillas. Los datos de las variables porcentaje de germinación y porcentaje de vigor se transformaron mediante arcoseno para cumplir con los supuestos de normalidad. Los resultados obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza, se utilizó la comparación de medias de Tukey (α = 0.05) por medio del software SAS Versión 9.4.

Nanopartículas de hidroxiapatita (nHAp)

El polvo obtenido para la síntesis de nHAp, se analizó por medio de difractómetro de rayos X, la lectura obtenida se comparó contra el patrón estándar de la hidroxiapatita pura, comprobándose que el polvo obtenido corresponde a la hidroxiapatita (Figura 1a). Para comprobar el tamaño de partícula se realizó una micrografía por microscopio electrónico de transmisión (TEM, Figura 1b). El tamaño aproximado de las partículas fue de entre 25 y 40 nm.

Figura 1 (a) Patrón de difracción XRD. (b) Imagen TEM. 

Potencial zeta (PZ)

La potencial zeta determina la carga superficial de las nanopartículas al medir su potencial eléctrico, esto representa la cantidad de repulsión o atracción electrostática (o carga) entre las capas que rodean a la partícula. Este parámetro indica cómo se afecta la estabilidad de las NPs en una suspensión y proporciona información sobre las causas de la dispersión, agregación o floculación. En el análisis del PZ de las nHAp, presentó una lectura de -20 mV, lo cual indica que el PZ de las nanopartículas es muy bajo, no existe repulsión entre ellas y es fácil su aglomeración.

Germinación y vigor de semillas

El porcentaje de germinación mostró diferencias estadísticas (p ≤ 0.05) en todos los tratamientos, orientados a una inhibición en la germinación, resultando las concentraciones de 200 y 2 000 mg L^-1 el menor porcentaje de germinación (38.67 ± 07.48 y 24.00 ± 4.64), al reducirse 56.06 y 72.73% con respecto al control (88.00 ± 17.03). La utilización de la nHAp afectó negativamente el vigor. La concentración de 200 mg L^-1 fue la más perjudicial (49.33 ± 7.21), observándose una disminución del 35.09% (Tabla 1) con respecto al tratamiento control (76.00 ± 11.11).

Longitud de plúmula y radícula

La longitud de plúmula no fue afectada por las distintas concentraciones de la nHAp. Con respecto a la longitud de radícula, la concentración de 100 y 200 mg L^-1 presentó un efecto inhibidor de crecimiento al reducir 2.73 y 23.22%, con respecto al control, en cambio las concentraciones de 25, 50, 500, 1000 y 2000 mg L^-1 aumentaron la longitud en 19.76, 7.19, 8.38, 13.29 y 2.27% respectivamente en relación al tratamiento control (Tabla 1).

Producción de biomasa seca

Las nHAp no tuvieron afectación de forma significativa (p ≤ 0.05) en la producción de biomasa en ningún tratamiento, como se indica en el Tabla 1, sin embargo, el tratamiento de 25 mg L^-1 presenta el valor numérico más alto en comparación contra el tratamiento control con una diferencia de 5.17%, mientras que el tratamiento de 200 mg L^-1 mostro el valor numérico más bajo, representado por un 12.59% en comparación contra el control.

Índice de germinación normalizado y de elongación de radícula

La comparación de medias del IGN indica que las concentraciones de 25 y 50 mg L^-1 presentaron baja toxicidad; en cambio los tratamientos con 100, 500 y 1 000 mg L^-1 presentaron una toxicidad moderada y los tratamientos de 200 y 2 000 mg L^-1 de nHAp presentaron alta toxicidad (-0.5605 y -0.7272, respectivamente), según se muestra en el Tabla 2. Para el IER, los tratamientos de 100 y 200 mg L^-1 presentaron una baja toxicidad, al obtenerse valores negativos de acuerdo con los cálculos realizados (-0.0273 y -0.2322, respectivamente). El resto de los tratamientos tuvieron valores positivos superiores de cero (Figura 2), lo que indica un efecto promotor en el crecimiento de las semillas. El tratamiento de 25 mg L^-1 presento el índice de ER más alto (0.1976), mientras que el tratamiento de 2 000 mg L^-1 presento el índice ER más bajo (0.0227), estos resultados concuerdan con el fenómeno de la hormesis, caracterizado por una estimulación en dosis bajas y una inhibición en dosis altas.

Figura 2 Índice de germinación normalizado y elongación de la radícula de Cucumis sativus. 

Germinación y vigor de las semillas

Según ^{Baz et al. (2020)}, la germinación es una fase crítica en el desarrollo de plantas y la producción de cultivos, por tal motivo se han evaluado diferentes tipos de NPs, con efectos positivos (^{Xin et al. 2020}, ^{Bayat et al. 2022}) pero los resultados en este bioensayo no concuerdan con esta afirmación. Se han reportado efectos fitotóxicos de diversos nanomateriales en distintos cultivos (^{Ruttkay Nedecky et al. 2017}, ^{Jogaiah et al. 2021}). ^{Verma et al. (2021)} explica que este efecto puede deberse principalmente al tipo de NPs analizada y la actividad fotocatalítica de las mismas, las cuales difieren tanto en tamaño como en la morfología. Por otro lado, ^{Guo et al. (2022)} concluyen que se debe tener en cuenta la composición química, tamaño y forma de las NPs, los métodos de síntesis, su forma de exposición, así como las especies de plantas utilizadas, debido a que los efectos varían entre especies diferentes. Lo anterior, indica que una misma NPs pueda promover la germinación o causar fitotoxicidad de acuerdo con el tipo de semilla/cultivo analizado. Al respecto, trabajos previos con nHAp no mostraron respuesta en germinación, por ejemplo, ^{Ortiz et al. (2017)} mencionan que en semillas de lechuga no se detectaron efecto en dosis de hasta 8 000 mg L^-1, efectos similares fueron observados por ^{Marchiol et al. (2019)}) quienes reportan que el aumento en las concentraciones de nHAp no presentaron fitotoxicidad en tomate.

Los resultados encontrados se pueden deber al fenómeno denominado hormesis (^{Mattson 2008}), caracterizado por la estimulación de dosis baja e inhibición de dosis alta. La hormesis se ha observado con frecuencia en estudios diseñados apropiadamente y su manifestación es independiente del agente químico/físico, modelo biológico y criterio de valoración (^{Jalal et al. 2021}). Mientras que ^{García-López et al. (2018)} indican que la etapa de germinación es sensible a condiciones de estrés causadas por elevadas concentraciones de nanopartículas provocando inhibición del crecimiento y reducción en la producción de biomasa. Lo que ocurrió en la germinación, vigor y longitud de radícula de la concentración de 200 mg L^-1 que tuvo el mayor efecto toxico. En la literatura actual no hay referencias al efecto toxico de las nHAp, pero hay evidencia del efecto toxico de NPs metálicas, con las cuales podemos hacer comparativo (^{Stampoulis et al. 2009}). Por ejemplo, ^{Escobedo et al. (2020)} en estudios con Allium cepa L. encontraron que a mayor concentración de nanopartículas el índice mitótico disminuye y el índice de anomalías aumenta, además que los nanomateriales podrían tener un efecto tóxico no sólo en las plantas, sino también en varios microorganismos del suelo, incluidas levaduras, bacterias y hongos (^{Rajput et al. 2018}). Mientras que ^{Corredor et al. (2009)} indican que las NPs son capaces de penetrar tejidos y dirigirse a diferentes partes de las plantas causando toxicidad. Por lo tanto, es importante prestar atención a este efecto, el cual aún no ha sido explorado y no existe una propuesta para su macro consumo (^{Maghsoodi et al. 2020}).

Longitud de plúmula y radícula

Los nuevos productos agroquímicos a base de nanotecnología han demostrado ser prometedores en la agronomía (^{Lira-Saldívar et al. 2018}). Para el caso de la nHAp, se han reportado efectos positivos en diferentes cultivos, por ejemplo, ^{Bala et al. (2014)} obtuvieron incremento en el crecimiento de radícula de Cicer arietinum, debido al aumento de la actividad de la giberelina. Mientras que ^{Marchiol et al. (2019)} aplicaron nHAp en plántulas de tomate, observando un incremento de la longitud radicular con las concentraciones de 200 y 500 mg L^-1 de un 64 y 97%, con respecto al control. En otro trabajo con plantas de Raphanus sativus sembradas con nHAp, se reporta un incremento significativo en el alargamiento del brote, alargamiento de las raíces y biomasa seca (^{Madanayake et al. 2020}). Los resultados del presente trabajo difieren con los efectos promotores de crecimiento mencionados por ^{Marchiol et al. (2019)} y ^{Madanayake et al. (2020)}, debido a que la variable longitud de plúmula no tuvo efecto estadístico significativo bajo ningún tratamiento. Con respecto a la longitud de radícula, la concentración de 200 mg L^-1 presentó un efecto inhibidor de crecimiento en un 23% con respecto al control (Tabla 1). En cambio, se encontró similitud con la investigación de ^{Jiang et al. (2014)}, quienes trabajaron con semillas de frijol mungo y nHAp a diferentes tamaños de partícula y concentración; con resultados de una fuerte tendencia de inhibición en la longitud del hipocótilo (HL) a concentraciones de 5 mg m L^-1 , con nHAp de tamaño menor al poro de la pared vegetal (aproximadamente 30 nm), lo que permitiría penetrar fácilmente la célula. El efecto de inhibición se debilitó a concentración de 10 mg mL^-1 , debió a que las nHAp más allá de cierta cantidad, pueden aglomerarse y formar partículas grandes, cuyo tamaño excede el tamaño del poro de la célula. La aglomeración de partículas es posible que ocurra durante el proceso de síntesis de nHAp. De acuerdo con ^{Salimi et al. (2012)}, se deben atender diversas condiciones de la reacción que pueden afectar el tamaño de partícula, sin embargo, la velocidad de agitación y la temperatura son los principales factores para controlar. Una temperatura elevada genera una disminución en la viscosidad de la solución que acelera la tasa de colisión de los núcleos y, por lo tanto, resulta en partículas más pequeñas, por otra parte, velocidades de agitación altas evitan la formación de aglomerados. Para determinar la posibilidad de aglomerase de las NPs se utiliza el potencial Zeta (PZ), el cual indica la afinidad electrostática o la facilidad para formar agregados en solución. NPs en suspensión con carga de ± 30 mV (milivoltios) o superior generan mayor repulsión por su carga superficial, lo que evita su agregación, por otro lado, cuando el PZ se encuentra en el rango de 10 - 20 mV disminuye la repulsión y facilita la unión entre partículas. Por lo tanto, cuando el PZ se acerca a cero, la aglomeración de las partículas es favorecido (^{Lorenzo-Acosta 2006} y ^{Flores-Hernández et al. 2020}).

El análisis del PZ de las nHAp utilizadas en este estudio fue de -20 mV, esto significa que prácticamente no existe repulsión entre las nHAp en solución y fácilmente pueden generar agregados de tamaño superior al poro de la célula vegetal, impidiendo su paso y alterando el efecto de las nHAp. Los datos antes descritos del PZ ofrecen una explicación a la ausencia de efecto en la longitud de plúmula y el comportamiento de la radícula, similar al descrito por ^{Jiang et al. (2014)}, los resultados obtenidos de esta variable mostraron que los tratamientos de 100 y 200 mg L^-1 disminuyeron la longitud en 2.73 y 23.22% con respecto al control, lo que evidencia el efecto inhibidor, mientras que los tratamientos de 25, 50, 500, 1 000 y 2 000 mg L^-1 aumentaron la longitud en 19.76, 7.19, 8.38, 13.29 y 2.27%, con respecto al control. Este comportamiento concuerda con el encontrado por ^{Jiang et al. (2014)}, por lo que podemos suponer que a concentración mayor de 200 mg L^-1 provoca aglomerados grandes de las nanopartículas de HAp, los cuales por su tamaño no podrían ingresar a las células, impidiendo visualizar el efecto de las NPs.

Producción de biomasa seca

En relación con la biomasa, ^{Liu y Lal (2014)} mencionan que la aplicación de nHAp en soya mejoró la producción de biomasa en un 18.2% (sobre el suelo) y un 41.2% (bajo tierra) en comparación con las plantas fertilizadas con una fuente de P soluble en agua convencional. Mientras que ^{Montalvo et al. (2015)} encontraron que la aplicación de fertilizantes a base de nHAp en trigo presentaron un aumento significativo de la materia seca vegetal en comparación con los tratamientos control, además de mayor absorción de fósforo por la planta. Pero las nHAp no influyeron en los procesos de acumulación de biomasa seca en las plantas de pepino, pudiendo estar relacionado con las necesidades fisiológicas de la semilla, o una aglomeración de nHAp pudo inhibir la penetración en células por el tamaño de los aglomerados, evitando que se pudiese apreciar un efecto evidente.

En general el efecto de nHAp en las plantas difiere por el tipo de planta y la concentración de nHAp, por lo que se requieren más estudios para entender los mecanismos involucrados con la absorción de nHAp en varias plantas y células (^{Maghsoodi et al. 2020}). Lo que concuerda con lo reportado por ^{Siddiqui et al. (2015)} quienes mencionan que las nanopartículas interactúan con las plantas y causan diversos cambios fisiológicos y morfológicos debido a las diferentes propiedades fisicoquímicas. Además de que cada especie vegetal presenta un mecanismo fisiológico específico para la absorción de nutrientes (^{Rafique et al. 2018}).

Índice de germinación normalizado e índice de elongación de la radícula

^{Bagur-González et al. (2011)} indican que el IGN y el IER son estimadores de fitotoxicidad. Al respecto, ^{Rodríguez et al. (2014)} recomienda usar ambos índices de toxicidad para generar respuestas a diferentes factores. Los resultados obtenidos de IGN e IER son inesperados por su variabilidad, pero la aglomeración de las nanopartículas explicada anteriormente puede afectar también la respuesta de estos índices. Existen pocos reportes sobre la fitotoxicidad de la nHAp, existen reportes sobre la fitotoxicidad de NPs metálicas (^{Asli et al. 2009}, ^{Ruffini et al. 2010}, ^{Kim et al. 2013}); sin embargo, los resultados no son concluyentes debido a que se reportan efectos positivos y negativos de las NPs de óxidos metálicos en diferentes plantas. Incluso, los efectos en la misma planta por el mismo tipo de NPs de óxido metálico puede mostrar resultados opuestos, como los descritos por ^{Ruffini et al. (2010)} que trabajo con nTiO₂ y obtuvo inhibición en la germinación de maíz, contra lo encontrado por ^{Burke et al. (2014)} quien trabajo con la misma NP y no encontró efecto significativo en maíz. Según ^{Yang et al. (2015)} estas conclusiones opuestas pudieron ser causadas por la divergencia y combinación de factores como: métodos de síntesis de las NPs, concentraciones utilizadas y el medio donde se aplican (suelo, hidroponía). Por lo tanto, se insta a investigar sistemáticamente la fitotoxicidad de una amplia variedad de NP de óxidos metálicos en plantas de cultivo.