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Introducción
Debido al deterioro microbiano se desperdician frutas y hortalizas durante la poscosecha, es un problema dentro de la seguridad alimentaria mundial (Janisiewicz y Korsten 2002). Alrededor del 14% de la producción mundial de alimentos (valorada en 400 000 millones de USD anual) se pierde después de recolectarse y antes de llegar a las tiendas (FAO 2022), llega a ser del 20 al 25% en países desarrollados y en países en desarrollo es de aproximadamente un 50%; debido a la inadecuada manipulación (Khalid et al. 2019).
La fruta fresca es propensa a la pérdida poscosecha, debido a las condiciones favorables para el crecimiento de organismos patógenos; alto contenido de agua, nutrientes, pH y actividad metabólica (Bautista-Baños et al. 2014, Zhang et al. 2020). Dentro de los hongos fitopatógenos más invasivos se encuentran los géneros Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Botrytis y Rhizopus (Cuevas 2016). Siendo el hongo R. stolonifer una de las especies más comunes en el filo Zygomycota, el cual en poscosecha contribuye al deterioro de una gran variedad de frutas y verduras, debido a su rápido crecimiento y fácil invasión (Bautista-Baños et al. 2014). Por lo que, se han utilizado fungicidas químicos para controlar la descomposición poscosecha. Sin embargo, la dependencia a los fungicidas químicos tradicionales ha provocado varios problemas de contaminación ambiental y resistencia de los patógenos a los fungicidas (Zhang et al. 2020).
Actualmente, la tendencia mundial propone reducir el uso de compuestos químicos, por lo que se están buscando alternativas seguras, ecológicas y eficaces que sustituyan a los fungicidas (Chandrashekara et al. 2012). Por lo que, se está trabajando en la búsqueda de antagonistas microbianos para contrarrestar enfermedades fúngicas (Singh et al. 2023). Se han utilizado especies de Basidiomycetes y Ascomycetes, por la presencia de diferentes metabolitos secundarios y por su complejo sistema enzimático (Berovič et al. 2003, Guédez et al. 2009). Al respecto, Alves et al. (2013) reportan que aproximadamente 52 especies de hongos tienen actividad antifúngica, presentan moléculas de alto peso molecular (péptidos y proteínas) y de bajo peso molecular (terpenos, esteroides, ácidos orgánicos, acilciclopentendionas y quinolinas). Por lo que es importante identificar estrategias seguras y eficaces para controlar las enfermedades fúngicas poscosecha que no generen residuos tóxicos, los hongos antagonistas se utilizan para el control biológico de fitopatógenos, por lo que, el objetivo de este trabajo fue realizar antagonismo y evaluar la actividad antifúngica de H. coffeata contra R. stolonifer.
Materiales y métodos
Material biológico
Las cepas utilizadas fueron: H. coffeata (Hc), Coprinus comatus (O.F. Müll.) Pers. (Cc), Daldinia sp. (Dc), Cordyceps sp.1 (C1) y Cordyceps sp.2 (C2), proporcionadas por el laboratorio de Micología del Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM). La cepa de R. stolonifer (Rs) fue obtenida de la Colección Nacional de Cepas Microbianas y Cultivos Celulares, afiliada a la World Federation for Culture Collection. Cada una de las cepas se crecieron en agar dextrosa papa (ADP) y se incubaron a 25 ± 2 °C (AMBI-HI-LO) en oscuridad.
Velocidad de crecimiento
Se determinó la velocidad de crecimiento (Vc; mm h-1) de cada una de las cepas antagonistas y de Rs crecidas en ADP, se midió con un vernier digital los milímetros avanzados cada 24 h a partir del inóculo (4 mm2) colocado en la parte central de la placa de Petri (Sánchez y Royse 2001, Acosta-Urdapilleta et al. 2016).
Porcentaje de reducción en el crecimiento micelial de Rs
Las cepas antagonistas se crecieron por cuatro días y el fitopatógeno (Rs) por un día para realizar los ensayos. Se hicieron confrontaciones duales para evaluar el efecto antagónico de Hc, Cc, Dc, C1 y C2 hacia Rs. El ensayo de antagonista-fitopatógeno se inoculó (4 mm2) a 1 cm de distancia de la periferia de la placa de Petri con ADP (90 x 15 mm) y se incubaron a 25 °C en obscuridad. Después de cuatro días de crecimiento, se colocó de forma equidistante un inóculo del fitopatógeno (Rs) a 1 cm de la otra periferia de la placa de Petri y se incubaron a 25 °C en obscuridad. Se realizaron cuatro réplicas junto con un testigo tanto para el antagonista como para el fitopatógeno. Se determinó el tiempo (h) trascurrido en el que el micelio del antagonista y fitopatógeno se juntaron (confrontación dual). En cuanto hicieron contacto las hifas de ambos organismos confrontados, se calculó el PRCM del antagonista hacia Rs. La zona de la confrontación de las cepas fue medida desde el inóculo hasta la zona de intersección de ambos micelios, las mediciones se registraron cada 24 h, hasta que el testigo cubrió la superficie de la placa de Petri (Ezziyyani et al. 2004, Uc-Arguelles et al. 2017, Michel-Aceves et al. 2019). Se determinó el PRCM con la siguiente fórmula:
Donde: A = Crecimiento micelial del fitopatógeno y B = Crecimiento micelial del fitopatógeno junto con el antagonista.
Determinación de la capacidad antagónica
Después de las 240 h de la confrontación dual entre antagonista-fitopatógeno, se evaluó la capacidad antagónica de los ensayos utilizando la escala de 5 clases propuesta por Bell et al. (1982).
Microcultivo
Se utilizaron los hongos con mayor PRCM (Hc y Dc) para microcultivos en cámara húmeda mediante la metodología propuesta por Riddell (1950), con algunas modificaciones. En placas de Petri se puso papel filtro húmedo y sobre un portaobjetos se colocó un fragmento de ADP (10 mm2) en cada uno de los extremos. Sobre uno de los fragmentos de ADP se inoculó por picadura una porción de micelio del antagonista y sobre el otro fragmento se inoculó Rs, se incubaron a 25 °C (AMBI-HI-LO) y se examinaron cada 24 h. Cuando se observó interacción entre las hifas de los dos hongos, se adicionó una gota de ácido láctico o azul de lactofenol. Las preparaciones se analizaron al microscopio óptico a 40x.
Cultivo líquido de H. coffeata
Se utilizó para el cultivo líquido, la cepa Hc por presentar el tipo 1 en antagonismo. El medio líquido contenía (g L-1): 0.5 de MgSO4; 1 de KH2PO4⋅H2O; 0.01 de FeSO4; 0.73 de urea; 5 de almidón de papa y 10 de sacarosa. Se colocó 50 mL de medio en matraces de 250 mL. Se realizaron tres cultivos: 1) Se inoculó con Hc (axénico), 2) se inoculó con Hc y después de dos días se inoculó con Rs (cocultivo), y 3) se inoculó con Hc, pero al medio sé le agregó 1% de biomasa seca de Rs. Se colocó en cada matraz tres inóculos (4 mm2) de micelio, se incubaron a 25 °C a120 rpm y se tomó muestra cada cinco días de crecimiento, separando la biomasa y el caldo de cultivo mediante filtración. La biomasa de Rs se obtuvo mediante cultivo líquido por tres días, posteriormente se centrifugó y se secó en un horno a 65 °C por 48 h.
Evaluación antifúngica del caldos de cultivo de H. coffeata
Se evaluó la actividad antifúngica del caldo de cultivo (1, 2 y 3) contra el hongo fitopatógeno (Rs). Se realizó el método de difusión en agar, al medio ADP (10 mL) se le agregó diferentes concentraciones del caldo de cultivo (5, 10 y 20 %) y como testigo se utilizó el medio ADP solo (Lee et al. 2008). A cada placa de Petri (60 x 15 mm) se le colocó el inóculo de Rs (4 mm2). Se incubaron a 25 °C en oscuridad por 48 h y se determinó el PRCM.
Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron con cuatro repeticiones, se reportó el promedio y desviación estándar (DE). Se realizó análisis de varianza de una vía (ANOVA) y prueba de comparación de medias (Tukey p ≤ 0.05) con el paquete estadístico STATISTICA versión 7.0 (Stat Soft, Inc. 2004).
Resultados y discusión
Porcentaje de reducción en el crecimiento micelial y antagonismo
Los Basidiomycetes y Ascomycetes son una opción para el control biológico, pero tienen diferencias de crecimiento, la Vc llega puede ser una desventaja entre los hongos macroscópicos y microscópicos. Los resultados de Vc de la cepa de Dc mostraron que creció 1.8 veces menos que Rs, en tanto que Hc creció 2.9 veces menos que Rs (0.65 mm h-1), entre las que hubo diferencia estadística significativa (Tabla 1). En la confrontación dual, los hongos hicieron contacto a las 48 y 72 h después de la inoculación de Rs (Figura 1). Con respecto a la clase de antagonismo, para las cepas Hc y Dc fue de clase 1, donde los antagonistas sobrecrecieron a Rs ocupando el 100% de la placa y para Cc, C1 y C2 fue de clase 4, ya que Rs creció más de 75% de la placa de Petri e inhibió el crecimiento de los antagonistas (Tabla 1). Hubo diferencia estadística significativa en el PRCM, la cepa Dc causó una reducción del crecimiento del 52% y para Hc fue de 45% (Tabla 1).
Tabla 1 Velocidad de crecimiento, tipo de antagonismo de las cinco cepas y porcentaje de reducción del crecimiento micelial de R. stolonifer
| Parámetro | Cepas | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Hc | Cc | Dc | C1 | C2 | Rs | |
| Vc (mm h-1) | 0.22 (0.002)c | 0.23 (0.002)c | 0.35 (0.003)b | 0.1 (0.001)d | 0.15 (0.001)d | 0.65 (0.001)a |
| Hd (h) | 48 | 72 | 48 | 72 | 72 | --- |
| Ca (Escala de Bell) | 1* | 4* | 1* | 4* | 4* | --- |
| PRCM (%) | 45 ± 2.5b | 21 ± 2.0c | 52 ± 3.4a | 16 ± 2.0c | 20 ± 2.0c | --- |
Vc: Velocidad de crecimiento; Hd: Tiempo para el inicio de la confrontación dual; Ca: Clase de antagonismo 1*) El antagonista sobrecrece al fitopatógeno ocupando el 100% de la placa y 4*) El fitopatógeno crece más del 75% entremezclándose con el antagonista e inhibiéndolo (Bell et al. 1982); PRCM: Porcentaje de reducción del crecimiento micelial. Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Los datos fueron evaluados mediante ANOVA y la prueba de Tukey (p < 0.05). Los números entre paréntesis corresponden a la DE de cuatro experimentos separados.
Figura 1 Confrontación dual de los hongos antagonistas y R. stolonifer. a) Dc-Rs, b) Hc-Rs, c) C2-Rs, d) Cc-Rs, e) C1-Rs y h) Rs
Las cepas Dc y Hc presentaron mayor efecto hacia Rs, durante el ensayo se observó micelio aéreo después de 10 días de crecimiento, sobrecrecieron y limitaron a Rs. Lo que indica que los hongos mostraron resistencia a la presencia del hongo fitopatógeno, por lo que, pueden ser una alternativa de control biológico de R. stolonifer mediante antagonismo por contacto. A través del microcultivo de Ridell se observó que el micelio de Hc y Dc creció alrededor (enrollado) de las hifas de Rs (Figura 2), algunas hifas de Rs se observaron vacías, por lo que los hongos Hc y Dc pudieron provocar lisis celular. Se observó que las hifas de los antagonistas eran de menor diámetro, lo que podría indicar que el micelio joven es el que realizó el contacto con las hifas de los patógenos, como lo reportó Uc-Arguelles et al. (2017).
Los hongos son el segundo grupo más amplio de la naturaleza y tienen diferentes mecanismos de supervivencia y proliferación, por lo que, varias especies de hongos se pueden utilizar en el control biológico (Badalyan et al. 2002, Thambugala et al. 2020). Dentro de las interacciones se ha indicado que el reemplazo es común entre los basidiomicetes, puede ser provocada por lisis y parasitismo, otro tipo es mediante el crecimiento excesivo de micelio, que puede sofocar el micelio del fitopatógeno, que es una estrategia de reconocimiento como respuesta a la interacción (Rayner y Webber 1984, Boddy 2000).
Mediante la confrontación dual se determinó el papel de antagonista, ya que se observó el comportamiento entre los organismos confrontados. Los hongos antagonistas (Dc y Hc) presentaron competencia contra Rs por espacio y nutrientes (Figura 2), mediante la secreción de enzimas hidrolíticas extracelulares, lisis celular por el enrollamiento de las hifas o la combinación de estos (Howell 2003). Como indicaron Bell et al. (1982) no se espera que este tipo de análisis este relacionado con el grado de control biológico en el campo, pero si, se puede conocer la capacidad y la variabilidad genética de los antagonistas y de los fitopatógenos para resistir el antagonismo. Que es parte importante para la selección de hongos que se pueden utilizar en el control de ciertos fitopatógenos, como en el caso de R. stolonifer, en este trabajo Hc y Dc son una alternativa para ser utilizadas como antagonistas.
Ya se ha reportado la capacidad antagonista de hongos macromicetos, Badalyan et al. (2002) analizaron 17 especies de basidiomicetes contra cuatro fitopatógenos: Bipolaris sorokiniana Shoemaker, Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) Sacc., Gaeumannomyces graminis var. tritici J. Walker y Rhizoctonia cerealis E.P. Hoeven. Los hongos Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm., Hypholoma fasciculare (Huds.) P. Kumm., Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst., Lentinus tigrinus (Bull.) Fr. y Schizophyllum commune Fr. presentaron mayor capacidad antagónica, mediante el mecanismo de reemplazo en un 60.2% y un 32.3% mediante punto muerto. Los hongos fueron combativos contra los patógenos, operan por antagonismo de contacto (interbloqueo) que consiste en una inhibición mutua a distancia o en contacto con el micelio y por reemplazo que consiste en un interbloqueo inicial seguido de un sobre-crecimiento parcial o total. Asimismo, Badalyan et al. (2004) reportaron que P. ostreatus, Ganoderma sp., Flammulina velutipes (Curtis) P. Karst. e Hypholoma fasciculare (Huds.) P. Kumm., mostraron mayor capacidad competitiva contra hongos micoparásitos (Trichoderma harzianum Rifai, Trichoderma pseudokoningii Rifai y Trichoderma viride Pers. y Clonostachys rosea (Preuss) Mussat). Se observaron zonas pigmentadas de color marrón en el área de interacción, lo cual se ha asociado con la actividad de la casa y la formación de compuestos de melanina, que protegen a las hifas de los hongos del ataque de microorganismos, ya que se ha indicado que las lacasas ayudan a los hongos a adaptarse al estrés ambiental o como defensa hacia antagonistas (Savoie et al. 2001).
También, Dar et al. (2011) utilizaron basidiomicetes como Pisolithus tinctorius (Mont.) E. Fisch y Laccaria laccata (Scop.) Cooke, los cuales presentaron inhibición de 45.4 y 46.2% contra Fusarium oxysporum Schltdl., y para Rhizoctonia solani J.G. Kühn fue de 43.7 y 44.7% respectivamente, por lo que, L. laccata y P. tintorius se les consideró antagonistas moderados, provocaron ruptura y torsión de las hifas de los hongos patógenos, seguida de desecación gradual, contracción del protoplasma y finalmente lisis celular. En este trabajo las cepas Hc y Dc se pueden considerar como antagonistas moderados por el PRCM de Rs (45 y 52%, respectivamente). En otro trabajo, Mutlag et al. (2018) utilizaron P. ostreatus como antagonista contra Trichoderma harzianum, Rhizopus spp. y Mucor spp., indicaron que presentó alta capacidad antagónica, ya que cubrió dos tercios del área de la placa de Petri, se le atribuyó dicho efecto antagónico a la producción de enzimas celulasas, hemicelulasas, xilanasas, amilasas y β-glucanasas. En este trabajo se observó contacto micelial e interferencia de hifas de las cepas Dc y Hc sobre Rs (Figura 2), para Hc se observó enrollamiento del micelio de y también se sugiere que podría ser mediante de enzimas (lisis celular), ya que es un hongo de pudrición blanca.
Actividad antifúngica del caldo de cultivo de H. coffeata
Los tres caldos de cultivo de Hc presentaron efecto sobre el crecimiento de Rs, el cultivo 1 (cultivo Hc) mostró una reducción del crecimiento de Rs entre 4.43 a 28.61%, en el cultivo 2 (Hc y Rs) hubo inhibición entre 1.81 a 39.49% y el cultivo 3 (Hc y biomasa de Rs) fue el que presentó el mayor valor de PRCM de 41.8 %, pero no hubo diferencias estadísticas significativas con el cultivo 2 (39.49%) (Tabla 2), en general, el efecto fue proporcional a la cantidad del caldo de cultivo presente en las placas de Petri.
Tabla 2 Efecto antifúngico del caldo de cultivo de los tres medios de H. coffeata sobre R. stolonifer
| Tipo de medio de cultivo | Tiempo de cultivo (h) | PRCM (%) | ||
|---|---|---|---|---|
| Caldo de cultivo (%) | ||||
| 5 | 10 | 20 | ||
| 1 | 120 | 5.43 (0.3)e | 4.43 (0.1)e | 26.08 (2.8)c |
| 240 | 23.25 (3.9)c | 26.61 (5.1)c | 28.18 (2.5)c | |
| 360 | 0 | 0 | 0 | |
| 480 | 0 | 0 | 0 | |
| Testigo* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 120 | 25.3 (4.9)c | 32.9 (2.7)b | 39.4 (1.3)a |
| 240 | 24.6 (1.3)c | 34.0 (0.6)b | 39.4 (1.6)a | |
| 360 | 26.8 (0.38)c | 34.0 (4.4)b | 37.3 (2.5)a | |
| 480 | 1.8 (0.6)f | 3.0 (0.01)f | 6.5 (0.21)e | |
| Testigo* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | 120 | 4.7 (0.02)e | 5.4 (0.08)e | 12.3 (1.3)d |
| 240 | 32.9 (0.6)b | 35.1 (0.63)b | 40.8 (5.1)a | |
| 360 | 0 | 5.79 (0.03)e | 6.88 (0.06)e | |
| 480 | 0 | 0 | 0 | |
| Testigo* | 0 | 0 | 0 | 0 |
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Los datos fueron evaluados mediante ANOVA y la prueba de Tukey (p < 0.05). Los números entre paréntesis corresponden a la DE de cuatro experimentos separados. *Rs sin presencia de caldo de cultivo
Hubo mayor efecto del caldo de cultivo obtenido a las 240 h sobre el crecimiento de Rs, el cultivo 2 presentó actividad hasta las 480 h y en el cultivo 3 fue a las 360 h, la pérdida de la actividad antifúngica del caldo del cultivo, podría ser por la disminución de espacio y agotamiento de nutrientes dentro del sistema de cultivo. Los resultados del cultivo 2 (Figura 3) se debe a la relación de competencia dentro del cocultivo, ya que se asemeja a la condición que se establecen durante el antagonismo, en el que ambos hongos deben competir por alimento y espacio (Tabla 2), lo que se refleja en presencia de compuestos con actividad antifúngica.
Figura 3 Actividad antifúngica de los diferentes tiempos del cocultivo de H. coffeata y R. stolonifer. a) 5 días, b) 10 días, c) 15 días, d) 20 días, t = testigo
En varios trabajos se menciona la presencia de compuestos naturales con actividad biológica en los hongos macromicetes, la actividad antibacteriana y antifúngica son requeridas por los organismos para sobrevivir en su ambiente natural (Yamaç y Bilgili 2006) y se pueden obtener de diferente origen (cuerpo fructífero, micelio y sobrenadante de cultivo líquido) (Poucheret et al. 2006). Al respecto, Batool et al. (2019) informaron que los extractos de metanol del cuerpo fructífero de Hortiboletus rubellus (Krombh.) Simonini, Vizzini & Gelardi, Suillus sibiricus Singer y Boletus edulis Bull presentaron actividad antifúngica. En el caso de B. edulis mostró un 51 a 53% de disminución de crecimiento de R. stolonifer, para S. sibiricus fue de 40 a 45% contra Aspergillus terreus Thom y para H. rubellus fue de 50 a 55% de disminución del crecimiento de Aspergillus niger Tiegh, por lo que, estos hongos ectomicorrízicos presentan compuestos antifúngicos.
Pero otra alternativa de obtener los compuestos es por medio del caldo de cultivo. En este trabajo en el cultivo 1 (cultivo axénico) inhibió el crecimiento de Rs, lo que indica la capacidad antifúngica de la cepa Hc. Pero fue mayor el efecto en el caldo de cultivo del cocultivo (cultivo 2), seguido del cultivo con biomasa seca de Rs (cultivo 3). La presencia del organismo vivo o la biomasa al ser utilizada como fuente de nutrientes, promueve la producción de compuestos que ayudan a inhibir el crecimiento de Rs. Ya que en el cocultivo se activan genes biosintéticos (expresión de vías crípticas) para la producción de metabolitos secundarios (Xu et al. 2023).
Se ha indicado que mediante el cocultivo se puede mejorar o establecer interacciones sintéticas entre diferentes microorganismos (Goers et al. 2014) y favorecer la producción de moléculas bioactivas, ya que dichos compuestos son el resultado de la respuesta de las células a su entorno. El contacto físico entre células de diferentes especies involucra la inducción de moléculas a través de proteínas o receptores de membrana específicos, lo que conduce a cambios en el entorno metabólico intracelular, por lo que es una herramienta eficiente para obtener compuestos de interés (Moody 2014, Netzker et al. 2015, Xu et al. 2023).
Por otra parte, es importante mencionar que el uso de fungicidas postcosecha conlleva a la generación de residuos. Algunos de los compuestos activos utilizados en poscosecha son tiabendazol, imazalil, miclobutanil, fludioxonil y pirimetanil, en el caso de los dos últimos, se ha indicado que son tóxicos para organismos acuáticos y con efectos nocivos duraderos. Además, los fitopatógenos desarrollan resistencia, lo que limita su eficacia, por lo que el personal llega a mezclar fungicidas e incrementa la dosis, en consecuencia se aumenta el riesgo para el ambiente y la salud humana (Zhang et al. 2020). Por lo que, es de gran importancia identificar organismos que son candidatos para el control de enfermedades fúngicas poscosecha. Entre los que destacan los hongos de pudrición blanca, el basidiomicete H. coffeata mostró mayor efecto antagonista y se corroboró mediante el cultivo líquido, los compuestos presentes en el caldo de cultivo se pueden utilizar para contrarrestar hongos patógenos, siendo una alternativa para el control de R. stolonifer
