Colecta de material vegetal

Entre junio y agosto de 2022 y 2023 se tomaron 80 muestras de hojas, tallos, flores y raíces provenientes de plantas asintomáticas de tres meses de edad de pepino blanco (C. sativus) y calabazo (L. siceraria), obtenidas de huertos familiares en la localidad de Caucel, Yucatán (21°01'16.9" LN, 89°42'04.5" LO), sin ningún tipo de tratamiento con fungicida. Durante este mismo periodo, se adquirieron semillas de pepino blanco y calabazo de productores de las localidades de Kancabdzonot (20°30′33″ LN, 88°42′38″ LO), Muna (20°29′05″ LN, 89°42′47″ LO) y Sotuta (20°35′45″ LN, 89°00′22″ LO), Yucatán, México. Los órganos vegetales fueron guardados en bolsas plásticas resellables trasparentes y estériles, y transportadas al Laboratorio de Fitopatología del Tecnológico Nacional de México (TecNM)/Campus Conkal, Yucatán, México, para su procesamiento aproximadamente 2 h después de su colecta.

Aislamiento de hongos endófitos

Los órganos vegetales fueron lavados con agua corriente para eliminar residuos de sustrato, seguido de una inmersión en NaClO comercial al 1.5% por 2 min, se enjuagaron con agua destilada estéril y secaron con papel absorbente estéril. Las siembras se hicieron en condiciones asépticas, colocando cuatro fragmentos de tejido vegetal de 1 cm² en cajas Petri estériles de 8 cm de diámetro, utilizando cuatro medios de cultivo: Papa-Dextrosa-Agar (PDA), Harina de Maíz-Agar (HMA), Jugo de V8^®-Agar (V8A) y Extracto de Cucurbitáceas-Agar (ECA). El V8A se preparó con jugo de vegetales Campbell's V8 mixto. Para la preparación del medio ECA se hicieron modificaciones a la metodología propuesta por ^{Gilchrist-Saavedra et al. (2015)}, utilizando hojas y tallos frescos de pepino y calabazo. Para las hojas, tallos, raíces y flores se hicieron tres réplicas por cada muestra y por cada medio de cultivo. En el caso de las semillas, se colocaron cuatro semillas por caja de Petri y se dispusieron cinco réplicas por localidad y medio de cultivo. Las cajas de Petri se sellaron e incubaron a 28±2 °C, y se conservaron durante dos meses, tiempo durante el cual se hicieron reaislamientos cada vez que se observó crecimiento micelial, hasta la obtención de cultivos monospóricos. Para garantizar la efectividad de la desinfección, se tomaron alícuotas del agua del último enjuague de algunas de las muestras, se vertieron en medios de cultivo y se incubaron en las mismas condiciones que las siembras. En ninguno se registró crecimiento de microorganismos.

Identificación de hongos endófitos

Las cepas aisladas fueron estudiadas al microscopio compuesto (Carl Zeiss^®, Primo Star, Madrid, España). Muestras de micelio y esporas se colocaron en un portaobjetos con una gota de ácido láctico para su caracterización e identificación a nivel de género, mediante claves morfotaxonómicas (^{Barnett y Hunter 1998}). Para la identificación a nivel especie se extrajo ADN de las cepas aisladas mediante el Kit DNeasy de QIAGEN y se llevó a cabo la amplificación por PCR de la región ITS, utilizando los oligonucleótidos universales ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) e ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′) (^{White et al. 1990}). Para las cepas en las cuales la región ITS no amplificó, se optó por amplificar por PCR los fragmentos del gen que codifica para la Histona 3 con los oligonucleótidos H3-1b (5´-CGCGGCGAGACTGGATGTCCTT-3´) y H3-1a (5´-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3´) (^{He et al. 2017}). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador (Thermo Fisher Scientific Inc., Veriti 96-Well, Cleveland, OH, USA), utilizando 1 µL de ADN molde en un volumen final de reacción de 25 μL con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 30 seg, seguido de 38 ciclos a 90 °C por 30 seg, 58 °C durante 45 seg y 72 °C por 1 min, finalmente un ciclo de extensión final a 72 °C por 10 min. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% a 85 V durante 40 min, con una tinción de bromuro de etidio y revelado en un fotodocumentador con luz UV (Bio-Rad, CA, USA). Los fragmentos amplificados fueron enviados al servicio de secuenciación de MACROGEN en Corea del Sur. Los resultados fueron editados con el software BioEdit 7.2.5 y comparados con las secuencias reportadas en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI), con ayuda del algoritmo de BLAST disponible en Internet. El número de accesión de GenBank de cepas de hongos estrechamente relacionadas, junto con su similitud, se presentan en la Tabla 1.

Efecto antifúngico por competencia

Por cada taxón de hongo endófito identificado se llevaron a cabo tres cultivos duales contra tres especies de hongos fitopatógenos: Corynespora cassiicola, Colletotrichum truncatum y Fusarium equiseti. Estas cepas fueron proporcionadas por el cepario del Laboratorio de Fitopatología del TecNM/Campus Conkal. El medio de cultivo utilizado fue PDA. En los casos en donde el endófito no creció en PDA durante su aislamiento, se optó por utilizar el medio de cultivo en donde sí se había desarrollado. En cada caja Petri se inocularon discos de micelio de 5 mm de diámetro del hongo endófito y del hongo fitopatógeno, con 60 mm de separación. Para este estudio se incluyeron tres réplicas por cada cultivo dual, así como cultivos monospóricos como colonias testigo. Cada cultivo se selló e incubó a 28 ± 2 °C. El radio del crecimiento del hongo fitopatógeno fue medido cada 24 h con un vernier digital (Caliper, Mitotuyo, Kawasaki, Japón) hasta que la colonia testigo alcanzó los 60 mm de radio. Para el cálculo del porcentaje de inhibición se utilizó la siguiente fórmula:

Con los porcentajes de inhibición se realizó un análisis de conglomerados de variables mediante el software Minitab Statistical.

Efecto antifúngico por antibiosis

Las tres especies que mostraron los mayores porcentajes de inhibición en las pruebas duales fueron cultivadas durante 30 días en 200 mL de medio de cultivo líquido de papa dextrosa. Posteriormente, el líquido fue filtrado mediante gasas y algodón estéril, sometido a dos ciclos de centrifugado de 3 000 rpm durante 15 min y una vez descartado el precipitado, se volvió a filtrar en condiciones asépticas con filtro membrana de 0.45 μm. El filtrado final fue mezclado con un volumen igual de medio de cultivo PDA con 2x de agar esterilizado, transferido a cajas Petri de 8 cm de diámetro y observado 24 h después para verificar su esterilidad. Un disco de 5 mm de diámetro de PDA con micelio de hongo fitopatógeno fue colocado en el centro de las cajas de Petri, considerando cuatro réplicas por cada fitopatógeno. Los fitopatógenos también se sembraron en medio de cultivo PDA sin filtrados como tratamiento testigo. Cada cultivo se selló e incubó a 28 ± 2 °C. El radio de crecimiento del hongo fitopatógeno fue medido cada 24 h con un vernier digital hasta que la colonia testigo cubrió por completo la caja de Petri.

Para el cálculo del porcentaje de inhibición se utilizó la fórmula de inhibición antifúngica por competencia antes mencionada. Con los porcentajes de inhibición se realizó un análisis de varianza con comparaciones de medias con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05) mediante el software Minitab Statistical.

Identificación de hongos endófitos

Se aislaron y purificaron 20 especies de hongos endófitos de hojas, flores, tallos, raíces y semillas de C. sativus y L. siceraria (Tabla 1).

Efecto antifúngico por competencia

Las 20 especies de hongos endófitos evaluadas mostraron algún grado de inhibición para los tres hongos fitopatógenos seleccionados, alcanzando el 100% en C. cassiicola con L. pseudotheobromae y T. longibrachiatum. Estos endófitos tuvieron inhibiciones mayores del 90% para las otras dos especies de hongos fitopatógenos. Inhibiciones superiores al 90% también fueron registradas para A. flavus y P. citrinum, mientras que siete cepas inhibieron de 80 a 89% del crecimiento de al menos uno de los hongos fitopatógenos (Tabla 2, Figura 1).

Figura 1 Cultivos duales en medio de cultivo PDA. A la izquierda se sembró el hongo fitopatógeno: C. cassiicola (Cc), C. truncatum (Ct), F. equiseti (Fe); a la derecha se sembró el hongo endófito: A. flavus (Af), L. pseudotheobromae (Lp), T. longibrachiatum (Tl). Los testigos son los fitopatógenos sin cultivo dual. 

En el análisis de conglomerados, las especies que mostraron inhibiciones del 90 al 100% para una o las tres especies de fitopatógenos se agruparon en un solo clado. Las tres especies de este clado que mostraron las mayores inhibiciones y la mayor similitud entre sí fueron seleccionadas para realizar las pruebas de antibiosis: A. flavus, L. pseudotheobromae y T. longibrachiatum (Figura 2).

Figura 2 Análisis de conglomerado del efecto antifúngico de hongos endófitos en los cultivos duales (inhibición de crecimiento radial). 

Efecto antifúngico por antibiosis

Los filtrados de las tres especies de hongos endófitos que exhibieron las mayores inhibiciones fueron evaluados contra los tres hongos fitopatógenos. Los filtrados fueron obtenidos de A. flavus, L. pseudotheobromae y T. longibrachiatum (Tabla 3).

Los filtrados de las tres especies exhibieron antibiosis al disminuir el diámetro de crecimiento de los tres fitopatógenos, con diferencias significativas con respecto al cultivo testigo. El efecto más relevante se observó en F. equiseti, con inhibiciones superiores al 40% en los tres medios de cultivo. Las colonias de F. equiseti expuestas a los filtrados mostraron bordes grises redondeados y dieron al medio de cultivo una tonalidad color café amarillenta; mientras que los testigos presentaron bordes blancos irregulares y cambiaron el medio de cultivo a una tonalidad rosa. En el caso de C. cassiicola, las colonias sometidas a los filtrados fueron inhibidas hasta en 25.9%, presentando un micelio aplanado y aterciopelado; en contraste, los testigos mostraron crecimiento irregular, conspicuo y algodonoso. Para C. truncatum se reportaron inhibiciones de hasta 17.4% sin diferencias notorias en cuanto a la morfología de las colonias (Figura 3).

Figura 3 Efecto de la antibiosis del filtrado de L. pseudotheobromae en medio PDA contra tres hongos fitopatógenos, a los 14 días de siembra. 

Identificación de hongos endófitos

Los hongos endófitos de cucurbitáceas han sido bien estudiados en regiones templadas y de forma moderada en las zonas semiáridas, incluyendo aquellos relacionados con C. sativus y L. siceraria. Los trabajos se han enfocado en realizar aislamientos de hojas, tallos y raíces (^{Huang et al. 2020}). En el presente estudio, además de los tallos, las flores fueron relevantes para la obtención de aislamientos fúngicos. Por primera vez se registró la presencia de hongos endófitos en semillas de pepino y calabazo. Estas estructuras deben ser contempladas como parte de una bioprospección completa, pues se ha demostrado que la colonización de las semillas de la planta hospedante representa una importante estrategia reproductiva para algunas especies de hongos endófitos (^{Panaccione et al. 2014}). De las 20 especies identificadas, cinco pertenecen al género Aspergillus, el cual es endófito, junto con Penicillium, Fusarium, Colletotrichum y Xylaria (^{Rashmi et al. 2019}), los cuales también fueron reportados en este estudio, con dos especies en el caso de Colletotrichum.

Efecto antifúngico por competencia

Los hongos endófitos son una alternativa sustentable de biocontrol contra hongos fitopatógenos debido a sus variadas estrategias antagonistas, desencadenadas por un gran arsenal de compuestos metabólicos con efectos diversos, resultantes de su coevolución con sus plantas hospedantes u otros microorganismos asociados (^{Alam et al. 2021}). En condiciones in vitro, las especies aisladas demostraron inhibir el crecimiento de los tres hongos fitopatógenos en un amplio rango. La combinación menos efectiva fue la de S. musae contra F. equiseti, con una inhibición del 4.64%. El evidente cambio de coloración en el medio de cultivo y la forma de crecimiento de los hongos fitopatógenos, formando un halo alrededor del endófito, sugirieron la secreción de antibióticos por parte del endófito (^{Huang et al. 2020}). El lento crecimiento de esta especie bajo las condiciones del ensayo fue una desventaja para su competencia contra los patógenos evaluados. Cepas de S. musae aisladas de plátano (^{Crous et al. 2021}) y mangle (^{Song et al. 2023}) crecieron en agar avena y agar extracto de malta a 25 °C, incluso se facilitó su esporulación al ser sometidas a luz ultravioleta. Para la cepa se debe considerar modificar las condiciones del cultivo en futuros estudios.

Los endófitos más efectivos fueron L. pseudotheobromae y T. longibrachiatum. Ambas cepas inhibieron el 100% del crecimiento micelial de C. cassiicola. El rápido crecimiento de las colonias fue un factor que favoreció a una eficiente competencia por recursos y espacio por parte de los endófitos, ya que en 72 h cubrieron la totalidad del medio de cultivo y crecieron sobre el micelio del fitopatógeno. En contraste los fitopatógenos testigo, pasaron de 12 a 17 días para cubrir el medio de cultivo. Cepas endófitas de Trichoderma y Lasiodiplodia fueron descritas como micoparásitas agresivas al colonizar completamente a Botrytis cinerea en cultivos duales (^{Leo-Ttacca et al. 2022}). Mientras que en especies de Trichoderma aisladas de melón y sandía se reporta un comportamiento hiperparasitario hacia fitopatógenos en cultivos duales, desarrollando hifas modificadas que apresan y rompen las hifas del patógeno (^{González et al. 2020}).

Los resultados mostraron efecto antifúngico en T. longibrachiatum y T. pseudokoningii, con más del 85% de inhibición para los tres fitopatógenos evaluados. En estudios previos, T. longibrachiatum demostró efectividad en el biocontrol de Magnaporthiopsis maydis (^{Degani et al. 2021}), mientras que T. pseudokoningii registró control in vitro contra M. phaseolina hasta en un 62% (^{Khan y Javaid 2020}). El género Trichoderma ha sido ampliamente utilizado en la agricultura por su eficacia contra hongos fitopatógenos que afectan cultivos de importancia agrícolas, a la vez que mantiene la integridad de las plantas y de otros organismos asociados (^{Baron et al. 2019}). En general, las especies de este género se caracterizan por presentar crecimientos rápidos y por impedir el crecimiento del fitopatógeno, al producir metabolitos secundarios inhibidores de crecimiento micelial (^{Khan et al. 2020}). A su vez, Trichoderma sintetiza una gran variedad de enzimas líticas que, al desintegrar la pared celular, facilitan la penetración de los metabolitos con efecto antibiótico, promoviendo un efecto dual y un antagonismo más eficiente (^{Sood et al. 2020}).

La especie Lasiodiplodia pseudotheobromae se distribuye en regiones tropicales y subtropicales, con una gran variedad de hospederos, a la cual se le atribuyen efectos antifúngicos, antibacterianos y promotores de crecimiento vegetal (^{Jalil y Ibrahim 2022}). El rápido crecimiento de cepas de este endófito también fue reportado en cultivos duales contra F. oxysporum, Rhizoctonia solani y Macrophomina phaseolina, con actividad micoparasitaria e inhibiciones del 70, 66 y 54%, respectivamente (^{Segaran y Sathiavelu 2023}).

Mientras que Aspergillus tuvo la mayor diversidad en la comunidad de endófitos, este género ha mostrado poca agresividad en contra de hongos fitopatógenos; pero hay reportes de inhibiciones cercanas al 80% contra B. cinerea (^{Leo-Ttacca et al. 2022}) y F. solani (^{Rashad et al. 2022}). En este estudio se registraron valores similares para A. tamarii contra C. cassiicola y para A. stellatus contra F. equiseti. Pero destaca el efecto de A. flavus, que inhibió más del 90% del crecimiento de C. cassiicola y F. equiseti, y más del 80% del crecimiento de C. truncatum.

Si bien el género Penicillium es considerado uno de los principales contaminantes de alimentos y materiales, se ha posicionado como una fuente de metabolitos bioactivos con efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antimicrobianos (^{Dramae et al. 2022}). Al respecto, se reporta la presencia de zonas de inhibición en cultivos duales de P. citrinum contra cuatro fitopatógenos. Estas zonas de inhibición son indicadores de los componentes antifúngicos producidos por el hongo (^{Korejo et al. 2014}). En el presente estudio el endófito P. citrinum también mostró una importante actividad antifúngica, con un 93.77% de inhibición contra C. cassiicola.

Efecto antifúngico por antibiosis

Las tres cepas de hongos endófitos que demostraron la mejor actividad antifúngica para los tres hongos fitopatógenos fueron T. longibrachiatum, L. pseudotheobromae y A. flavus, por lo que fueron seleccionadas para las correspondientes pruebas de antibiosis. Extractos de T. longibrachiatum demostraron efectos antibióticos contra 11 fitopatógenos, con inhibiciones del 95% contra Cytospora mali a los cinco días de incubación; identificando péptidos, policétidos y terpenos como los causantes de malformaciones morfológicas en los fitopatógenos (^{Zhang et al. 2018}). La bisvertinolona es un compuesto antifúngico sintetizado por T. longibrachiatum con una fuerte actividad antifúngica, pues está relacionada con la inhibición de la síntesis de β-1,6-glucano, lo que desencadena la lisis de la pared celular del fitopatógeno (^{Ngo et al. 2021}). Aunque T. longibrachiatum cuenta con eficientes estrategias antifúngicas, no es recomendable el empleo directo del micelio o las esporas para su uso en el biocontrol de enfermedades, debido a que es una de las especies principalmente identificadas como causal en la mayoría de las micosis reportadas, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos e inmunosuprimidos. Pero es factible el uso de sus metabolitos con actividad antibiótica (^{Wang y Tu 2023}).

Compuestos antifúngicos secretados por L. pseudotheobromae inhibieron el crecimiento de R. solani, F. oxysporum y M. phaseolina, en 70, 65, 24% a los siete días, respectivamente (^{Sagaran y Sathiavelu 2023}). Entre estos compuestos destaca la lasiodiplodina, causante de alteraciones en la morfología del micelio del fitopatógeno y la destrucción de su membrana celular (^{Luo et al. 2023}). Además de su efectividad en cuanto a competencia y micoparasitismo, la facilidad del aislamiento, el rápido crecimiento y la secreción de compuestos como la lasiodiplodina, hacen a L. pseudotheobromae una buena candidata para su uso en el biocontrol de una amplia gama de enfermedades en cultivos agrícolas. Pero la eficiencia in vitro para biocontrolar fitopatógenos deberá validarse en condiciones de invernadero o campo.

Las formas endófitas de A. flavus exhiben una amplia gama de metabolitos secundarios con efecto antifúngico como ácido palmítico, ácido α-linolénico y ácido esteárico. Entre sus efectos destaca la disminución del metabolismo de proteínas y ácidos grasos; la modificación de la permeabilidad de la membrana celular, lo cual conlleva a la pérdida de electrolitos; la supresión de la germinación de las esporas y la interrupción de la división celular. Estos compuestos han causado la inhibición de F. solani hasta en 57.8% (^{Rashad et al. 2022}). Si bien A. flavus se caracteriza por la producción de aflatoxinas que pueden comprometer la salud humana, se han reportado formas endófitas de esta especie que no producen aflatoxinas (^{Balbinot et al. 2021}, ^{Rashad et al. 2022}). Estas cepas pueden considerarse como una alternativa de biocontrol contra hongos que sí las producen e incluso para reducir la presencia de estas micotoxinas en suelo contaminado (^{Weaver y Abbas 2019}, ^{Yan et al. 2021}). Por lo que es necesario obtener el perfil químico de la cepa endófita aislada del estado de Yucatán para corroborar la presencia de aflatoxinas y considerarla una cepa promisora para su aprovechamiento biotecnológico.

Los filtrados de las tres cepas seleccionadas mostraron inhibiciones menores a las reportadas por cepas de las mismas especies contra diferentes fitopatógenos, y a la vez, valores mucho menores a los registrados en los cultivos duales en este estudio. Esto puede deberse a que las condiciones del cultivo de los hongos endófitos en el medio líquido no fueron las óptimas para la secreción de una concentración eficiente de compuestos antifúngicos. Por ejemplo, las mejores condiciones para la producción de lasiodiplodina son pH inicial de 7; temperatura de 28 °C, volumen de líquido de 300/500 ml; relación C:N de 1:0 y tiempo de fermentación de 20 días (^{Luo et al. 2023}). No obstante, bajo las condiciones de cultivo y fermentación proporcionadas, F. equiseti demostró una mayor susceptibilidad contra los filtrados de los tres hongos endófitos seleccionados. Estos aspectos deberán tomarse en consideración para pruebas posteriores con estas o con el resto de las cepas endófitas aisladas.