Obtención de inoculo

El experimento se realizó en el laboratorio de toxicología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro ubicada en la ciudad de Saltillo Coahuila, México. Se colectaron muestras de suelo infestado de nematodos de la especie M. incognita en invernaderos de tomate en el ejido el salado del estado de San Luis Potosí; también se tomaron muestras de raíces de plantas de tomate con presencia de nódulos causados por Meloidogyne. Las muestras fueron transportadas en bolsas negras al laboratorio, se procesaron para obtener masas de huevos mediante el método de tamizado-centrifugado con la ayuda de tamices con mallas de calibre 50, 100, 400 y 500 para posteriormente centrifugar a 5 000 RPM durante 2 minutos; el sobrenadante se recuperó por decantación. Posteriormente se agregó una solución de sacarosa al 45% para centrifugar a 5 000 RPM durante 1 minuto, se decantó en el tamiz de 500 mallas y se enjuagó con agua destilada estéril, después se realizó un conteo en el microscopio estereoscópico (^{Cepeda 1995}). Las masas de huevecillos se depositaron en tubos falcon y se mantuvieron a temperatura constante de 28 °C durante 12 días para obtener J2 (^{Pinzón et al. 2015}).

Identificación de Nematodos

Se realizaron cortes perineales a hembras obtenidas de las raíces de plantas de tomate, las cuales se visualizaron en el microscopio compuesto y se observaron patrones como presencia de fásmidos bien definidos y ampliamente separados, linea lateral ausente y estrías altas finamente definidas con forma cuadrangular, así como ano y vulva distantes; estas características se describen en las claves taxonómicas de ^{Cepeda (2016)}, ^{García et al. (2004)} y, ^{Eisenback y Triantaphyllou (2020)}. Así mismo, fueron confirmadas por medio de la interactive diagnostic key to plant parasitic, freeliving and predaceous nematodes of university of Nebraska (^{Tarjan et al. 1977}).

Obtención del extracto

La obtención del extracto de C. ensiformis se siguió la metodología descrita por ^{Rocha, et al. (2017)} modificada. Se agregaron 100 g de semillas, obtenidas de Leguminutre®, a un matraz de 500 mL al que se le adicionaron 200 mL de agua destilada estéril, y se colocó en un agitador oscilatorio durante 24 h a 130 RPM. Posteriormente las semillas junto con el agua fueron trituradas en un procesador de alimentos de la marca Ninja® con tres pulsos de 30 segundos, el producto resultante se dejó en el oscilador a 150 RPM durante 24 h y posteriormente se agregaron 400 mL de agua destilada. Con la ayuda de gasas se separó la fase sólida y liquida, la fase liquida se centrifugó tres veces a 5 000 RPM a temperatura ambiente durante 20 minutos cada ciclo. Finalmente, se obtuvo un volumen total de 400 mL del extracto y se esterilizó por filtración utilizando filtros de 0.2 micras con la ayuda de una bomba de vacío y un embudo cónico de filtración. Las NP’s de dióxido de silicio fueron obtenidas de la empresa CULTA®, las cuales fueron almacenadas a temperatura ambiente. Las diluciones se calcularon mediante la fórmula general de diluciones (^{Rajagopalan y Agrawal 2023}).

Establecimiento de bioensayos

La evaluación in vitro se realizó mediante placas de cultivo celular de 24 cavidades con un diseño experimental de bloques completos al azar. Se hicieron diluciones de la solución madre donde se contenían los huevecillos eclosionados para obtener una solución stock en la cual cada 100 microlitros contenían 40 individuos ± 5 J2 y posteriormente fueron depositados en cada pocillo. Se estableció un testigo con cinco tratamientos del extracto de C. ensiformis a 2, 4, 6, 8 y 10% que se determinaron mediante una ventana biológica tomando como base las dosis utilizadas por ^{Rocha et al. (2017)}, con cinco repeticiones, y fueron incubados a 26°C ± 1°. Se revisaron a las 24, 48 y 72 h posteriores a la inoculación con la ayuda de un microscopio estereoscópico, donde los criterios de muerte fueron cuerpo en posición recta o desintegración de los individuos (Figura 1A), y fueron comparados contra el tratamiento al 0% con agua (Figura 1B). Por último, se combinó el extracto de C. ensiformis con NP’s de dióxido de silicio, donde se tomaron en cuenta los resultados obtenidos de los bioensayos previos basados en el extracto. En este experimento se utilizaron 35 individuos J2 (±5) en cada pocillo bajo un esquema experimental de bloques completos al azar. Se implementaron cuatro tratamientos y un testigo con agua destilada, en los cuales se realizó un gradiente de concentraciones utilizando NP’s al 0.06, 0.08, 0.10, 0.12 y 0.14%; cada una mezclada con el extracto al 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0%. Los tratamientos fueron revisados a las 24, 48 y 72 h posteriores a la inoculación siguiendo los mismos criterios de muerte. Los datos obtenidos de mortalidad se procesaron mediante un análisis Probit con la ayuda del programa The SAS System Windows 9.0®. Los porcentajes de mortalidad por día se analizaron con análisis de varianza con el paquete estadístico Minitab® con un grado de significancia del 95% y una prueba de medias de Tukey.

Figura 1 A) Individuo de M. incognita en proceso de desintegración causado por el extracto de C. ensiformis. B) Testigo de M. incognita teñido con lugol y azul de algodón. 

Resultados y discusión

Durante las primeras 24 h posteriores a la inoculación la dosis más baja al 2% de extracto de C. ensiformis no provocó mortalidad de los J2. Sin embargo, a las 48 h se tuvo una mortalidad mayor del 60% (Tabla 1). La concentración del 4% tuvo una mortalidad de 63% durante las primeras 24 h y a las 48 h la mortalidad se ubicó en 65% en promedio. Las dosis del 8 y 10% obtuvieron 85 y 90% de mortalidad, respectivamente a las 24 h posteriores a la inoculación (Tabla 1). El extracto de semillas de C. ensiformis presentó una evidente tasa de mortalidad en individuos J2 de M. incognita con bajas concentraciones, lo que coincide con el trabajo de ^{Rocha et al. (2017)} en donde reportaron mortalidades mayores al 80% en individuos del segundo estadio de nematodos del género Meloidogyne, mismos que, al igual que el presente trabajo, también presentaron formaciones de vacuolas en el cuerpo como efecto del extracto. Es necesario resaltar que en otros trabajos las evaluaciones se han realizado solo durante 48 h, mientras que en este trabajo las evaluaciones fueron hasta las 72 h (^{García-Munguía et al. 2016}). La técnica de obtención del extracto utilizada en este estudio fue modificada con la finalidad de reducir costos y hacerla más accesible, sin embargo, los efectos causados son similares. Esto se debe a que el proceso originalmente se realizaba en frío con la ayuda de nitrógeno líquido y manteniendo en todo momento temperaturas no mayores a 4°C (^{Rocha et al. 2017}). Para fines prácticos de este trabajo el proceso se realizó a temperatura ambiente de 24°C, no obstante, el extracto se sometió a más tiempo de centrifugado para garantizar la correcta separación de los anillos de lípidos con la fase acuosa. Lo anterior, indica que el metabolito se mantiene presente y conserva sus propiedades toxicidas. En algunos trabajos con Tagetes, se ha implementado extraer aceites de la planta para evitar afecciones por la temperatura, lo que podría hacer el extracto más estable a condiciones ambientales, mismo que ha mostrado ser más eficiente que extractos acuosos, incluso de la misma parte de la planta (^{Álvarez et al. 2016}).

En el caso de las dosis combinadas, los resultados exponen que el efecto del extracto es potencializado cuando se aplican simultáneamente. En el primer tratamiento donde se aplicó el extracto al 1.5% con 0.08% de NP’s de dióxido de silicio se logró una efectividad del 75%, a las 72 h posteriores de la aplicación (Tabla 2); teniendo en cuenta el tipo de solvente, agua destilada estéril, con el cual se obtuvo una tasa de efectividad mayor del 90%, lo encontrado es superior a lo reportado en otros extractos acuosos y etanólicos realizados con plantas del género Capsicum, Hyoscyamus, Estrumario y Achillea, donde se utilizaron polvos obtenidos de las hojas, reportando mortalidades máximas de 60% (^{Kepenekçi et al. 2016}). El segundo tratamiento indicó que las aplicaciones de extracto al 2.0% combinados con 0.08% de NP’s a las 24 h de la aplicación tuvo mortalidades del 80%, no obstante, la mortalidad no aumentó significativamente en las siguientes 24 h posteriores y se puede observar que las dosis siguientes no tuvieron diferencias en las mortalidades (Tabla 2). El tercer tratamiento de 2.5% del extracto, con 0.06% de NP’s tuvo una mortalidad del 77% a las 24 h y también se constató que en los días posteriores la mortalidad no aumentó significativamente hasta las 72 h, incluso algunos individuos no murieron (Tabla 2). El tratamiento del 3% de extracto expuso una mortalidad similar a la del primer tratamiento ya que la aplicación con 0.06% de NP’s solo tuvo un 55% de efectividad y menos del 50% durante las primeras 24 h, hasta las 72 h no hubo cambios en la mortalidad; por otra parte, el tratamiento de 3.0% de extracto y 0.14% de NP’s a las 72 h mostró mortalidad de 95%. Se puede comparar las mortalidades obtenidas con las dosis aplicadas del extracto solo y del extracto combinado con las NP’s; las mortalidades aumentan en los tratamientos con concentraciones combinadas (Tabla 2), mientras que las aplicaciones con el extracto solo, se requiere mayor concentración para obtener el mismo porcentaje de mortalidad; no obstante, es importante resaltar la relación entre el aumento de las mortalidades y la disminución de las concentraciones en los tratamientos combinados. La mayor aplicación de NP’s tuvo mortalidad de 95% durante las 72 h posteriores a la aplicación. Las concentraciones utilizadas para la evaluación en pruebas in vitro son aceptables considerando el método de extracción, puesto que, el metabolito L-canavanina se puede desnaturalizar bajo métodos de extracción con altas temperaturas, por lo que, para conservar las propiedades toxicológicas de la semilla el proceso se debe realizar en frío y no someterlo a temperaturas mayores a 50 °C (^{Rocha et al. 2017}).

El análisis probit de la CL₅₀ y CL₉₅ del extracto se ubicaron en 2.41% y 10.01. Con respecto a las dosis combinadas el extracto fue potenciado por las NP’s (Tabla 3). Se observa que se requieren 0.079, 0.045, 0.037 y 0.059% de NP’s combinadas con el extracto de C. ensiformis al 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0%, respectivamente; para alcanzar mortalidades efectivas para alcanzar la CL 50. Si se compara con las concentraciones del extracto, se puede observar como se requiere menos concentración una vez que se combina con las NP’s.

Se observan diferencias entre tratamientos, el experimento donde se evaluó solo el extracto de semillas de C. ensiformis, mostró que hay diferencias significativas en todos los tratamientos; mientras que, en el experimento con dosis combinadas, específicamente en los tratamientos de 1.5% de extracto con 0.06 y 0.012% de Np’s no existen diferencias entre tratamientos. También es el mismo caso en el tratamiento de 2.5% del extracto con 0.12 y 0.08% de NP’s, no existen diferencias significativas (Tabla 4).

Las diferencias con otros experimentos donde también se aplican extractos acuosos puede atribuirse al uso de las diferentes partes de la planta, es decir, los metabolitos están distribuidos en la planta y sus concentraciones pueden variar de acuerdo a la parte de la planta de donde se extraen, algunos pueden contenerse en mayor cantidad en hojas, en raíces o en semillas (^{Villegas et al. 2013}). El extracto acuoso utilizado en este trabajo fue obtenido de semillas de C. ensiformis. Mismas que han presentado efectos antilarvarios en los que se han reducido hasta en 35% la presencia de larvas de Callosobruchus maculatus, confirmando así que la semilla por sí misma sin procesar presenta efectos de toxicidad (^{de Sá et al. 2017}). Lo antes mencionado se puede constatar tomando en cuenta que se han comparado pruebas donde desarrollan productos con bases etanólicas y acuosas, en dichos ensayos con cáscara de ruezno reportan mortalidades del 97% para el caso del extracto acuoso y 87% para los etanolicos (^{Cepeda et al. 2018}). Por lo que la importancia del presente estudio rádica en la modificación y simplificación del método de obtención del extracto, así como la compatibilidad de este potencializado con NP’s de dióxido de silicio, ya que actualmente solo existe un trabajo relacionado con C. ensiformis como agente de control aplicado a nematodos fitopatógenos (^{Rocha et al. 2017}). No se realizó la detección de la L-canavanina, no obstante, al comparar los resultados de ^{Rocha et al. (2017)} se puede confirmar que a pesar de que se modificó la técnica de obtención del extracto, el producto obtenido conserva sus propiedades biocidas. Las NP’s de dióxido de silicio no se han evaluado contra patógenos, es por ello que se debe resaltar que la compatibilidad de ambos productos mostró resultados favorables, lo que abre la posibilidad de nuevos estudios para entender y comprender los alcances que pueden tener.

El método modificado para la obtención del extracto de semillas de C. ensiformis exhibió niveles de efectividad contra M. incognita por sí solo, mostrando la mayor mortalidad las primeras 24 h y un incremento en algunas dosis en días posteriores. Es importante resaltar que el resultado de la potencialización con el uso de NP’s de dióxido de silicio fue positivo y se requieren bajas cantidades combinadas, tanto del extracto como de las NP’s. Es importante continuar con pruebas bajo diferentes esquemas, los cuales ayudarán a entender las diferentes aplicaciones que se le puede dar a la combinación de ambos productos.