Introducción

México es uno de los más importantes consumidores de maíz. La producción de este cereal se concentra en los estados de Sinaloa, Jalisco, Michoacán, México, Guanajuato, Guerrero y Veracruz, los cuales aportan poco más del 67% de la producción nacional, la cual fue de 27 424 527.55 t para 2020 (^{SIAP, 2021}). El maíz, como cualquier otro cultivo, no está exento del ataque de malezas, patógenos e insectos cuasantes de pérdidas en la producción (^{Reséndiz et al., 2016}). Una de las principales enfermedades es el carbón de la espiga causado por el hongo Sporisorium reilianum f. sp. zeae (Kühn) Langdon y Fullerton (Basidiomycota, Ustilaginaceae), sinónimo Sphacelotheca reiliana (Khün) Clinton (^{Matyac y Kommedahl, 1985a}; ^{Matyac y Kommedahl, 1985b}); esta enfermedad se presenta con mayor incidencia en los Valles Altos de México y sus daños se han incrementado ciclo tras ciclo desde su aparición en 2003 (^{Aquino-Martínez et al., 2011}). En el Estado de México se ha estimado una reducción en el rendimiento hasta del 15% en variedades e híbridos susceptibles, mientras que en otras regiones de México se reportan incidencias que oscilan de 0.1 hasta 42.5% (^{Pérez et al., 2006}; ^{Sánchez-Pale et al., 2011}), pero también se han observado incidencias de hasta 80% en otras regiones del mundo (^{Pataky, 1999}) y pérdidas en el rendimiento de hasta 300 000 t en China (^{Zhang et al., 2013}). La afectación en el rendimiento de grano causado por S. reilianum f. sp. zeae se debe a que este hongo desarrolla estructuras denominadas soros (que contienen teliosporas) que reemplazan de forma parcial o completa a la mazorca y la espiga, ambos durante la etapa de floración, lo cual reduce la producción de grano por planta y mazorca. La infección por este patógeno tiene lugar cuando las teliosporas (diploides) que se encuentran en el suelo de cultivo germinan y dan lugar a esporidias haploides de cuatro tipos diferentes de apareamiento (^{Ingold, 1994}; ^{Schirawski et al., 2005}). Las esporidias con diferente tipo de apareamiento a y b son compatibles y forman hifas de conjugación que se fusionan; esto conduce a la formación de un dicarión filamentoso (hifa parasítica) (^{Schirawski et al., 2005}), que penetra la raíz de la plántula, y las hifas proliferan para invadir el tejido de manera sistémica (^{Martinez et al., 2000}; ^{Martinez et al., 1999}; ^{Ghareeb et al., 2011}). Sólo en el momento de la floración los síntomas y signos son visibles: cuando la inflorescencia es reemplazada total o parcialmente por soros (^{Ghareeb et al., 2011}; ^{Stromberg et al., 1984}). Debido a que la infección ocurre durante la germinación de la semilla y estados tempranos de desarrollo de la plántula de maíz, la principal estrategia de control se basa en la generación de material resistente, pero sobre todo en la aplicación directa de fungicidas a las semillas para prevenir el contacto entre el patógeno y el hospedante durante estas etapas de desarrollo (^{Stienstra et al., 1985}; ^{Martínez y Ledesma, 1990}; ^{Wright et al., 2006}).

Sin embargo, se desconoce la eficiencia de los fungicidas utilizados en el tratamiento a la semilla, ya que, aun cuando es tratada, la incidencia de la enfermedad es cada vez mayor. Esto ha favorecido la dispersión del patógeno y el incremento en la superficie con problemas de carbón. Por lo anterior, el objetivo del artículo es evaluar la sensibilidad de Sporisorium reilianum f. sp. zeae a diferentes fungicidas y sus efectos en la germinación de teliosporas y formación de basidiosporas que darán origen a la etapa infectiva.

1. Materiales y métodos

1. 1. Recolección de teliosporas

Mazorcas y espigas de plantas infectadas con Sporisorium reilianum f. sp. zeae fueron recolectadas en parcelas de producción comercial de maíz localizadas en el municipio de Metepec, Estado de México, México (19°12ʹ54.40ʹʹ N; 99°36ʹ1.09ʹʹ O). El material vegetal infectado se colocó en bandejas plásticas y se dejó secar por 15 días en invernadero. Una vez pasado ese tiempo, se recolectaron las teliosporas y se almacenaron en bolsas de papel a 22 ± 2 ºC hasta su uso.

1. 2. Viabilidad de teliosporas

Se utilizaron teliosporas de S. reilianum f. sp. zeae desinfestadas en una solución de CuSO4 al 1% (w/v) por 12 h, se lavaron con tres cambios de agua destilada estéril y se recuperaron en papel filtro. La viabilidad del inóculo se verificó antes de su uso. Se preparó una suspensión de 50 000 teliosporas mL-1 en una solución de Tween al 0.05% en agua destilada estéril y se depositó 1 mL por caja Petri con medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA) preparado a partir de papas (^{Gilchrist et al., 2005}). Las placas se incubaron en oscuridad a 25 °C durante 48, 72 y 96 h. Cinco placas se observaron directamente en el microscopio y el número de teliosporas germinadas por campo se contó a magnificación de 40X. Se observaron cinco campos por caja y se registró el promedio de germinación como porcentaje.

1. 3. Fungicidas

Se determinó la sensibilidad de S. reilianum f. sp. zeae a los fungicidas indicados en el cuadro 1.

1. 4. Evaluación de la sensibilidad a fungicidas

La sensibilidad de S. reilianum f. sp. zeae a los diferentes fungicidas (cuadro 1) fue determinada sobre la germinación, tamaño del basidio, formación de basidiosporas primarias, secundarias y terciarias y formación de colonias de basidiosporas. Para cada fungicida se evaluaron cinco concentraciones: 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1 y 1 g i. a. (gramo de ingrediente activo) L-1 a partir de una solución madre a 1 g i. a. L-1 diluida en RPMI-1640 (Sigma; cat#RH130-1L). La cantidad necesaria para preparar dichas concentraciones se adicionó a PDA a 50 °C (^{Noel et al., 2018}); PDA sin fungicida se usó como testigo. Una vez adicionado el fungicida al PDA, se mezcló durante 1 min con un agitador magnético estéril. La mezcla se vació en cajas Petri de plástico y se dejaron reposar por 48 h. Se prepararon cuatro cajas por concentración de fungicida y testigo, y una suspensión de teliosporas desinfestadas en agua destilada estéril a concentración de 50 000 teliosporas estéril (^{Quezada-Salinas et al., 2013}). Se depositaron 0.5 mL de suspensión por caja con PDA y fungicida, y se distribuyó de manera uniforme sobre el medio de cultivo con un triángulo de vidrio estéril. Las cajas se incubaron en oscuridad a 25 °C.

La efectividad de cada fungicida se evaluó a las 96 h de incubación y se determinó el porcentaje de germinación, tamaño del basidio, formación de basidiosporas primarias, secundarias y terciarias y formación de colonias de basidiosporas. El porcentaje de germinación, formación de basidiosporas primarias, secundarias y terciarias y la formación de colonias de basidiosporas para cada dosis se calculó respecto al porcentaje de germinación del testigo. Las variables se cuantificaron en cuatro campos del microscopio de luz en 40x. El porcentaje medio por caja Petri se calculó usando la media de los cuatro campos observados. Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de varianza y a una prueba de comparación de medias (Tukey: P ≤ 0.05) mediante el paquete estadístico SAS para Windows (Versión 8.1). El experimento se repitió en dos ocasiones bajo un diseño al azar. A partir de los porcentajes de inhibición de la germinación, obtenidos mediante la fórmula de ^{Abbott (1925)}, se estimó la concentración efectiva 50 (CE50); para ello, los porcentajes se transformaron a unidades probit y las concentraciones, a logaritmos (^{Throne et al., 1995}).

2. Resultados

2. 1. Viabilidad de teliosporas

En medio PDA a 25 °C se registró 17%, 28% y 30.25% de teliosporas germinadas después de 48, 72 y 96 h respectivamente. Las teliosporas formaron un basidio septado con cuatro células y cada una de ellas dio origen a una basidioespora que desarrolló colonias tipo levadura de color crema (figura 1).

Fuente: elaboración propia. Nota: a) Teliospora sin germinar. b) Teliospora germinada con basidio septado. c) Basidiosporas primarias. d) Basidiosporas primarias con formación de basidiosporas secundarias. e) Basidiosporas terciarias. f) Colonia de basidiosporas.

Figura 1 Proceso de germinación de una teliospora de Sporisorium reilianum f. sp. zeae (sinónimo Saphaceloteca reiliana) 

2. 2. Evaluación de la sensibilidad a fungicidas

La mayor cantidad de teliosporas germinadas en el testigo (30.25%) se obtuvo después de 96 h de incubación. Tanto en el testigo como en algunos tratamientos con fungicida, las teliosporas formaron un basidio septado con cuatro células, cada una de las cuales originó una basidiospora.

Todos los fungicidas inhibieron significativamente la germinación de teliosporas comparados con el testigo (P ≤ 0.05) a 96 h después de la inoculación de cajas (cuadro 2). Sin embargo, carboxín inhibió en su totalidad la germinación a partir de 0.001 g i. a. L-1, siendo el fungicida con mayor efectividad, seguido de carboxín+captán, el cual inhibió la germinación de teliosporas a partir de 0.01 g i.a. L-1. Al respecto, ambos fungicidas están recomendados para el tratamiento de semilla de maíz y control de Sphacelotheca reiliana a una dosis de aplicación recomendada de 250 mL 100 kg semilla-1 y 260 g 100 kg semilla-1, respectivamente, que equivalen a 1 g i. a. en cada caso (cuadro 1), por lo que en este estudio se determinó que se requiere de una dosis menor a la recomendada para inhibir la germinación. Otro fungicida que también es recomendado y de mayor uso para el control de dicho patógeno es triadimenol; sin embargo, en este estudio fue el fungicida que, después del testigo (PDA), permitió el mayor porcentaje de germinación de teliosporas, el cual llegó a ser de 56.19% para la dosis más baja y de 38.01% en la mayor concentración, 1 g i. a. L-1. Es decir, en ninguna de las concentraciones evaluadas para triadimenol se registró un efecto inhibitorio por arriba del 90%; cabe señalar que la dosis recomendada de acuerdo con el cuadro 1 es de 0.75 g i. a. Kg-1 para ejercer un control contra el patógeno. Un comportamiento muy similar al de triadimenol se observó para propiconazol, el cual también facilitó la germinación de teliosporas hasta en la dosis más alta (1 g i. a. L-1). Difeconazol únicamente inhibió la germinación en la dosis de 1 g i. a. L-1, por lo que requirió menor cantidad de ingrediente activo a la dosis de 1.25 g i. a. L-1 que recomienda el fabricante.

Por su parte, la combinación de tebuconazol+thiram, la cual está indicada para el tratamiento de semilla de cebada, avena y trigo para el control del carbón descubierto de la cebada (Ustilago nuda) y carbón cubierto (Ustilago hordei), inhibió la germinación de teliosporas de S. reilianum f. sp. zeae a partir de la concentración de 0.01 g i. a. L-1. Por lo anterior se propone su uso en el tratamiento de semilla de maíz para el control del carbón de la espiga, ya que la dosis a la cual se inhibe la germinación es en menor a la dosis de aplicación que sugiere el fabricante (0.679 g i. a.). Por último, cuando se aplicó únicamente tebuconazol, la inhibición de la germinación se presentó a partir de las 0.1 g i. a. L-1, que es una dosis menor a la recomendada por el fabricante (1.2 g i.a.).

La CE50 para la inhibición de la germinación de teliosporas de S. reilianum f. sp. zeae se presenta en el cuadro 3. Carboxín, carboxín+captán y tebuconazole+thiram tuvieron el mayor efecto en la inhibición de la germinación, mientras que difeconazol, propiconazol, tebuconazol, el menor efecto.

En el cuadro 3también se muestran los valores de la CE50 para la inhibición de la formación de colonias de basidiosporas de S. reilianum f. sp. zeae. Carboxín en todas sus concentraciones probadas fue el único fungicida que inhibió la formación de colonias; sin embargo, todos los fungicidas fueron efectivos estadísticamente.

Prospectiva

El hongo S. reilianum f. sp. zeae inverna como teliosporas en el suelo y en ocasiones sobre la semilla. Cuando se presentan las condiciones óptimas de temperatura y humedad del suelo para el desarrollo de las teliosporas, éstas germinan y dan origen a un filamento corto llamado promicelio o probasidio, en donde el núcleo diploide migra y experimenta la meiosis, la cual resulta en cuatro células, cada una con un núcleo haploide. Estas células producen basidiosporas, las cuales producen otras y así de manera suscesiva formando cadenas de células haploides denominadas esporidias. Las esporidias tienen la característica de poseer tipos de acoplamiento opuestos (+ y -), que por lo general son producidos en igual número (^{Ingold, 1994}; ^{Téféri et al., 1989}; ^{Baier y Krüger, 1962}). Esporidias con tipos de acoplamiento opuesto se unen dando origen a hifas infectivas dicarióticas (binucleadas). Estas hifas dicarióticas infectan a las plántulas de maíz vía mesocotilo o raíz (^{Martinez et al., 2002}; ^{Martinez et al., 2000}; ^{Fowler, 1985}) e invaden sistémicamente los tejidos del meristemo y el tejido floral indiferenciado (^{Martinez et al., 1999}; ^{Matyac, 1985}; ^{Fullerton, 1970}).

Debido a que el inóculo se encuentra en el suelo de cultivo, los fungicidas han sido la herramienta de manejo primaria para el control del carbón de la espiga, en donde el principal objetivo es evitar la infección durante el desarrollo de la plántula (^{Wright et al., 2006}). Sin embargo, no existen estudios que sustenten su uso y que estén respaldados por evaluaciones de efectividad. Esto es de vital importancia, ya que un estudio de sensibilidad a fungicidas es fundamental para establecer una base para futuras comparaciones en el monitoreo de los cambios en la sensibilidad del patógeno a los fungicidas que, a su vez, pueden predecir la efectividad de los programas de manejo.

En México este es el primer reporte in vitro de la evaluación de la sensibilidad de Sporisorium reilianum f. sp. zeae a diferentes fungicidas, en donde se analiza la germinación de teliosporas como factor de generación de esporidias, las cuales son necesarias para la formación de la hifa infectiva (dicarión), ya que la fase haploide es incapaz de infectar, y solamente la hifa dicariótica derivada de la unión de dos esporidias compatibles es infectiva (^{Schirawski et al., 2005}; ^{Martinez et al., 2002}).

Aunque todos los fungicidas inhibieron significativamente la germinación de las teliosporas respecto al testigo, en nuestro estudio S. reilianum f. sp. zeae fue más sensible a carboxín, ya que únicamente se presentó la germinación de teliosporas a una dosis de 0.0001 g L−1 sin el desarrollo de basidiosporas, que son las responsables de la formación del dicarión (hifa infectiva) (^{Martinez et al., 2000}), por lo que este fungicida inhibe en 100% la formación de la fase infectiva a una dosis menor de la recomendada (1000 μg mL−1). Asimismo, presenta la menor concentración efectiva (EC50) requerida para inhibir el 50% de la germinación de teliosporas. ^{Kosiada (2011)} reportó resultados similares con carboxín en la inhibición de la germinación de teliosporas in vitro, en cuya investigación se utilizó la combinación de carboxín+thiram y de esta manera obtuvo una inhibición de la germinación total a partir de 0.01 g i.a. L-1. Por su parte, ^{Fullerton et al. (1974)} en condiciones de campo registraron que con un tratamiento a la semilla de carboxín+captán al 0.2% es efectivo para reducir la incidencia del carbón de la espiga, ya que sólo se obtuvo un 4.56% de plantas enfermas.

Por otra parte, en todos los casos, triadimenol (fungicida recomendado para el control de S. reilianum f. sp. zeae) fue el menos efectivo en inhibir la germinación, después del testigo, pues se presentó hasta en un 38.01% en la dosis más alta (1 g i.a. L-1), resultado que supera la dosis comercial recomendada de 0.75 g i.a. De acuerdo con este dato, no se recomienda seguir utilizando este ingrediente activo. Un efecto similar se obtuvo con propiconazol y difeconazol, los cuales presentaron porcentajes de germinación de teliosporas con las dosis de 1 y 0.1 g.i.a. L-1 de 12.39 y 32.23% respectivamente. Estos fungicidas se recomiendan aplicar a dosis de 1.25 g i.a., por lo que para el caso de difeconazol se requiere una dosis menor para inhibir la germinación. En el caso de propiconazol su eficacia en la inhibición de la germinación de teliosporas del carbón de la caña de azúcar, Sporisorium scitamineum, también ha sido inefectivo, ya que únicamente se ha reducido la germinación en condiciones de in vitro (^{Bhuiyan et al., 2012}); esto concuerda con lo reportado en esta investigación.

Sin embargo, los resultados de las pruebas en condiciones de campo pueden diferir de los observados in vitro; por ejemplo, en aplicación a la semilla, triadimenol y tebuconazol disminuyeron la incidencia del carbón de la espiga a 4.7% y 5.55% respectivamente, mejores resultados que carboxín (7.9%) (^{Gonzalez-Manzo, 1988}). Asimismo, ^{Wright et al. (2006)} reportaron reducción del número de plantas infectadas con S. reilianum cuando las semillas de maíz fueron tratadas con propiconazol mediante el cual se obtuvo una incidencia del 2.3% si se compara con los de menor efectividad como tebuconazol y carboxín+thiram con 6.1 y 7.1%, respectivamente. En la evaluación realizada por ^{Pradhanang y Ghimire (1996)}, donde las semillas de maíz fueron tratadas con propiconazol, tebuconazol y triadimenol, el porcentaje más bajo de plantas infectadas se produjo mediante el tratamiento con propiconazol (0.7%), seguido de tebuconazol (6.1%) y triadimenol (13.2%); lo anterior se compara con una infección del 35.9% en plantas testigo. Por su parte, ^{Anderson (2015)} determinó que los fungicidas con mayor reducción en la incidencia del carbón de la espiga fueron tebuconazol, fludioxonil y sedaxaner.

Cabe señalar que la evaluación de la eficacia de diferentes fungicidas para el control de S. reilianum se ha llevado a cabo con base en el tratamiento de la semilla y posterior siembra en parcelas con antecedentes de la presencia del patógeno. Ante esto se asume que la distribución del inóculo del patógeno en campo es uniforme y que cada semilla al ser sembrada tiene la misma posibilidad de estar en contacto con el patógeno y, por lo tanto, ser infectada. Este escenario ha llevado a resultados inconsistentes como los expuestos. Por lo tanto, antes de realizar una evaluación en campo, se debe tener en cuenta que la distribución del inoculo en el campo no es uniforme, sino que se presenta en agregados (^{Sánchez-Pale et al., 2011}), por lo que existe escape por contacto entre patógeno y hospedante.

De acuerdo con este panorama, se concluye que los productores, así como los beneficiadores de semilla de maíz deben continuar con el uso de carboxín para el tratamiento de la semilla, ya que inhibió el desarrollo de la fase infectiva de S. reilianum f. sp. zeae, aunque es necesaria su evaluación en campo. Asimismo, es indispensable la rotación de los productos empleados para el control de este patógeno, con base al MoA del grupo de FRAC, es decir, utilizar diferentes grupos químicos; en este sentido, se puede hacer uso de la combinación de tebuconazol+thiram, pues gracias a esta investigación se determinó que con la dosis de 0.01 g i.a. L-1, una dosis mucho menor a la recomendada de 0.679 g i.a., ya no se presenta germinación de teliosporas. Asimismo, se debe evitar el uso de triadimenol, dado que, a pesar de estar recomendado para el control de S. reilianum f. sp. zeae a una dosis comercial de 0.75 g i.a., en este trabajo permitió la germinación aún con la dosis más alta (1 g i.a. L-1).