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Introducción
El sector agrícola es la fuente principal para la alimentación humana, no obstante, a lo largo de la historia las sociedades han enfrentado retos relacionados con enfermedades de los cultivos o siniestros como exceso de lluvias, adicionando ahora el calentamiento global que ha generado un desequilibrio ecológico; contaminación por uso de agroquímicos que ocasionan daños sanitarios, por lo que es necesaria una transición a la producción agrícola sustentable, inocua y de calidad. Dentro de todas las anomalías que enfrentan día a día en el sector agrícola se encuentran las enfermedades derivadas por hongos fitopatógenos como C. gloeosporioides y B. cinerea que se conocen como antracnosis y moho gris causantes de pudrición del fruto (Lemus-Soriano y Pérez-Aguilar, 2017; Dean, et al., 2012; Juárez-Becerra et al., 2010), siendo estas dos especies de las más involucradas en problemas agrícolas conllevando a pérdidas económicas, contaminación y problemas sanitarios (Huerta, G. et al., 2009). Estas enfermedades son muy comunes en frutos tales como mango (Mangifera indica), aguacate (Persea americana) y fresas (Fragaria spp), donde su desarrollo depende mucho de climas húmedos y calurosos. Los productores tienden a mitigar estas enfermedades con fungicidas organosintéticos como sulfonamidas, benzimidazoles, tiofanatos, fenólicos, entre otros (FAO 2010), que son dañinos para la salud, flora, fauna además de contaminar mantos acuíferos, desencadenando desequilibrios tróficos (Barcenas, 2005; Benítez-Leite et al., 2010; Simoniel, M. F. et al., 2010; Jáquez Matas et al., 2008). Existen alternativas naturales para combatir este tipo de problemas, sin embargo, hace falta mejorar los mecanismos o las tecnologías para su aplicación in situ; como ejemplo de estas sustancias de origen natural tenemos los extractos esenciales como los de tomillo (Thymus), lavanda (Lavandula), eucalipto (Eucalyptus). Los extractos esenciales provienen de los ciclos metabólicos de las plantas y les brindan de manera natural propiedades de defensa ante insectos, hongos, virus y bacterias; al igual que propiedades sensoriales y de aroma (Montoya, 2010). Estos aceites también presentan propiedades antisépticas y son utilizados tanto en la vida cotidiana como en diferentes sectores de la industria: farmacéutica, ganadera, alimentaria, cosmética y fitosanitaria (Camacho 2007). Su principal composición son los grupos fenólicos; sin embargo, no se ha identificado con claridad el mecanismo de reacción que estos tienen para atacar bacterias u hongos, pero pueden alterar su membrana celular o dañar su material genético. De manera general se sabe que el efecto de los aceites esenciales se puede llevar en: la pared celular, la membrana celular, en la síntesis de proteína, en su genética o síntesis de esta (Palou-García y García-García, 2008; Lambert et al., 2001).
Uno de los principios activos con mayor efecto fungicida es el timol presente en el tomillo principalmente, y que es hasta cinco veces más tóxico para bacterias y hongos en comparación con el fenol (Palou-García y García-García, 2008). El timol es una molécula orgánica con potencial efecto para el manejo de hongos fitopatógenos. No obstante, sus características fisicoquímicas limitan su uso: es muy volátil, poco soluble en agua y tiene un aroma característico que lo hace de difícil tolerancia y complicado manejo (Lemus-Soriano y Pérez-Aguilar, 2017; Bruneton, 2001). Ciertos estudios han mostrado que el timol presenta un amplio efecto bactericida y fungicida en el rango de 25 μgmL-1 a 100 μgmL-1 (Dias de Castro et al., 2015; Numpaque et al., 2011). Se le atribuyen “efectos membrana-tróficos”, perfora la membrana citoplasmática e induce a la fuga de material intracelular, fuga excesiva de iones potasio en primera instancia. Estos efectos sobre la potencial transmembrana desencadenan inhibición de los generadores de ATP (Kang y Sun, 2014; Shapiro y Guggenheim, 1995). Por otro lado, el timol sufre una bio-transformación a iones y compuestos secundarios (Berrocal, 2014; Lambert et al., 2001), esta biotransformación del timol en compuestos secundarios debido a la acción bioquímica de hongos y bacterias, lo hace no perjudicial ante hongos benéficos fundamentales en el proceso trófico, comparándolo con fungicidas tradicionales que no son bio-transformados tan fácilmente y perduran en el ambiente mucho tiempo contaminando y dañando el ecosistema (Barcenas, 2005).
El desarrollo de nanomateriales amigables con el medio ambiente y de bajo costo económico es un tema amplio para los investigadores que se dedican a dicha área, hay una amplia gama para elegir y contribuir al desarrollo de algún nanomaterial que brinde nobles beneficios al sector social y ambiental. En el sector agrícola el desarrollo de agroquímicos que sean amigables con el ambiente no solo está siendo impulsado por la ciencia y la industria, sino también a través de políticas gubernamentales que vienen avanzando a nivel internacional (Sabourin et al., 2017). Además, existen tecnologías basadas en los nanomateriales como los hidróxidos dobles laminares (HDL), su estudio en la ciencia e industria relacionada con la genética, la medicina, el medio ambiente, los catalizadores, los adsorbentes, como aditivos en polímeros, entre otras. Estos materiales están teniendo aceptación debido a sus características favorables para su manejo y desarrollo de compuestos híbridos con acción bioquímica, al intercalar una molécula biológicamente activa (Martínez y Carbajal, 2012; Béjar, 2016; Feng y Dua, 1998). Estos HDL son matrices inorgánicas con una estructura general; [MII1-XMIIIX(OH)2 (An-)n/x] · H2O (Miyata 1975) donde MII y MIII son cationes divalentes y trivalentes, respectivamente, An- es el anión que reside en la región interlaminar, los aniones situados en la región interlaminar son móviles y pueden intercambiarse por moléculas de naturaleza distinta algo así como ósmosis sintética, de tal manera que se aprovecha esta característica para introducir aniones orgánicos, inorgánicos o biomoléculas, tienen la capacidad de albergar en su región interlaminar moléculas orgánicas que a su vez les brindan protección y mejoran sus características. Estos HDL, además de tener una gran estabilidad ante la temperatura, tienen la capacidad de reconstruirse después de haber sufrido desnaturalización o rompimiento de su estructura laminar, lo cual se conoce como efecto memoria e, incluso, tienen una característica de intercambio iónico que les da la posibilidad de desplazar moléculas en su región interlaminar por moléculas más afines (Béjar 2016). Los HDL han ido adquiriendo mayor impacto en la industria y en la investigación en los últimos años debido a su fácil y económica síntesis además de su gran beneficio en diversos sectores (Béjar, 2016; Damián, 2017; Bernardo et al., 2018). Hay diversos métodos para la síntesis de los HDL y todos brindan distintas características en los nanomateriales dependiendo del enfoque que se les dé en la investigación o industria; por ejemplo, han utilizado el método sol-gel con irradiación de microondas para obtener un HDL capaz de remover cromo y remediar suelos, y también con el objetivo de buscar una constitución de partículas pequeñas (Ramos et al.,1997; Benito et al., 2009), otro método es el de irradiación de microondas, buscando un tamaño menor en cristales y acotar el tiempo de cristalización (Fetter et al.,1997), también está el método por hidrólisis de urea que busca alta cristalización y buena propiedad de efecto memoria (Costantino et al.,1998), y el método de emulsión en solución con variaciones de pH donde se busca un área superficial amplia (Jing He et al., 2004), sin embargo; los métodos más empleados son los basados en la precipitación de sales, tales métodos son el de coprecipitación a baja y alta sobresaturación, más económicos y prácticos que los anteriores.
Para los fines de este trabajo se optó por el método de combustión, más reciente en la investigación, y que deriva de una solución con un compuesto que ejerza combustión al aplicar temperatura, buscando obtener óxidos mixtos facilitando su homogeneización y una directa síntesis de los nano híbridos (Kashinath et al., 2002), este método puede ayudar en la eficacia de la intercalación o impregnación de los aniones o moléculas deseadas, pues al descomponer un HDL a óxidos mixtos todos sus aniones serán eliminados quedando libre la entrada en su reconstrucción para intercalar o absorber una nueva molécula sin necesidad de competir contra otros aniones. Aunque este método o ruta de solución en combustión es dirigido para la formación de ZnO y AlO para distintas aplicaciones de remediación o como semiconductores, por mencionar algunos (Rajeshwa y de Tacconi, 2009). Este método se dirigió hacia los HDL con Zn y Al en su estructura.
El método de combustión se basa en la propiedad de efecto memoria, o reconstrucción de la estructura de un HDL, este fenómeno se aprovecha para formar un nano híbrido con un anión orgánico deseable en su región interlaminar. Está basado en un proceso de desnaturalización/reconstrucción de la estructura laminar del HDL provocado por un tratamiento térmico generando sus óxidos mixtos de los metales puestos en tratamiento. Posteriormente, al poner estos óxidos mixtos en contacto con una solución alcalina que contenga aniones de interés, este recobrará su estructura laminar original y en la región interlaminar residirán los aniones contenidos en la solución o, en efecto, los aniones o moléculas se impregnarán sobre el área superficial a los 600 ºC, que es la temperatura a la cual se observa el fenómeno de descomposición y formación de los óxidos mixtos; estos se llevan a una solución que contenga el anión de interés a un pH de 9 a 10, y, al cabo de siete días el material híbrido estará formado. Esta ruta comparada entre moléculas orgánicas pequeñas y moléculas orgánicas de gran tamaño y elevado peso molecular es muy útil en la síntesis con las segundas para obtener nano híbridos, debido a una interacción más lenta conveniente por sus características fisicoquímicas que difieren entre moléculas (Jones y Newman, 1998). Las investigaciones dirigidas a híbridos con función biocida de manera general ya están comenzando a ser desarrolladas en los laboratorios de investigación, especialmente en el sector de salud pública contra bacterias. Observamos que el desarrollo de híbridos con actividad biocida dirigidos al sector agrícola y específicamente para mitigar problemas causados por hongos fitopatógenos es un asunto más reciente, listo para ser explorado. La génesis de híbridos comienza teniendo como bases teóricas y experimentales sobre compuestos orgánicos o compuestos biológicamente activos que ya hayan sido estudiados y que tengan ciertas características biocidas y el potencial de ser unidos a matrices con el objetivo de mejorar sus condiciones de uso y aumentar su resistencia a la degradación.
Antecedentes
Dentro de los estudios con extractos esenciales podemos citar un experimento con HDL a base de ZnAl impregnados con aceite de eucalipto como un eficiente nanomaterial híbrido contra bacterias multirresistentes, en este experimento utilizaron ZnNO3 y AlNO3 como cationes di y trivalentes y aceite esencial de eucalipto extraído de hojas de eucalipto, la síntesis del HDL fue formada a distintas relaciones molares (2, 3, 4) y distintos pH (7.5 y 10) donde la mejor síntesis de este híbrido resultó en una relación molar de 2 y un pH de 9. Las pruebas realizadas in vitro contra Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus sp dieron como resultados una inhibición de su desarrollo bacteriano a 4 mgmL-1 del material híbrido necesario en el medio, pero también ese material mostró efecto bactericida a 14 mgmL-1. Se potencializa el extracto de eucalipto mediante la matriz HDL (Lobo-Sánchez et al., 2018).
Un plaguicida ecológico bio nano híbrido con los mismos cationes intercalando ácido nalídixico, antibiótico de bajo espectro (ZnAL -NADS), fue sintetizado para lidiar la enfermedad de la pudrición blanda en los huertos de papa (Solanum tuberosum), ocasionada por Pectobacterium carotovorum. Mediante este mecanismo se buscó reducir la contaminación ocasionada por los antibióticos en las aplicaciones que hacen los productores para controlar la pudrición de papa. Esto debido a un requerimiento menor en la concentración del antibiótico gracias a las propiedades de conservación del HDL y de liberación modulada del bio-nano híbrido. Lo concluyeron como una opción a un pesticida ecológico (Morales-Irigoyen et al., 2018). Otros nano híbridos desarrollados a base de HDL y benzoato han demostrado también tener un gran poder bactericida, fungicida y un alto potencial como material para el desarrollo de filmes (Geetanjali et al., 2018). Por estas razones, los HDL están siendo objeto de estudio para mejorar sus cualidades y perfeccionar el desarrollo de biomateriales y nanomateriales híbridos con un alto valor en las tecnologías modernas.
Metodología
Síntesis del nanomaterial híbrido (HDL-T)
La síntesis de los materiales se llevó a cabo en el laboratorio II de la Facultad de Ingeniería Ambiental de la UMSNH. En el desarrollo de este HDL-T fue necesario partir de una mezcla de óxidos mixtos (ZnAl-(O)); los óxidos mixtos se obtuvieron: se mezclaron dos soluciones de (Zn(NO 3) 6H 2 O y Al(NO 3) · 9H 2 O) en una proporción molar de 2 a 1 adicionando sacarosa como medio de combustible y la acción térmica fue efectuada en mufla a 450 ºC durante 5 min., para eliminar los residuos carbonosos de la sacarosa, al final del proceso térmico se mantuvo en temperatura constante de 450 ºC durante 12 h quedando un material blanco (Figura 1) (Kashinath et al., 2002).
Teniendo los óxidos mixtos ZnAl-(O) como base, se prosiguió con la síntesis del nanomaterial híbrido en un sistema con poca interacción con el ambiente para evitar que las moléculas de CO2 provenientes de la atmósfera interactuasen en forma de CO3 debido a su alta afinidad por la región interlaminar de las estructuras HDL y evitar competencia entre CO3 y la molécula de interés: timol. (Miyata, 1983; Béjar, 2016), a través de este proceso se efectúo el mecanismo de reconstrucción de la estructura laminar de los HDL (Jones y Newman, 1998), mediante la preparación de una solución donde se mezcló ZnAl-(O) con timol en una relación estequiométrica de 2 a 1, respectivamente, para garantizar la intercalación y/o impregnación del timol (Santana, 2014). Los cristales de timol (Timol, N, F., J. T. Baker, 98% pureza) se diluyeron con 12 mL de H2O desionizada y descarbonatada con 12 mL de alcohol etílico 96º G. L. Para facilitar la impregnación o intercalación del timol en la matriz HDL fue necesaria una previa des protonación con NaOH 0.1M, procurando un pH entre 9 y 10, estando dentro del margen indicado por otros estudios (Gerhard et al., 1990; Costantino et al., 1999); no obstante, solo se logró una síntesis del HDL-T a un pH lo más cercano a valores de 10.5 y 11. El sistema se burbujeó con argón para eliminar CO2 y se agregó la proporción de óxido mixto una vez purgado; el sistema se mantuvo lo más hermético posible para evitar la interacción de la solución con el CO2 atmosférico y en agitación constante durante 7 días, pasado este tiempo se centrifugó para obtener el HDL-T y se lavó con agua desionizada hasta reducir el pH a 7, el nanomaterial HDL-T se secó en estufa durante 24 h a 60 ºC para eliminar el excedente de agua (Figura 2) y se almacenó.
Caracterización fisicoquímica
Difracción de rayos-X
La difracción de rayos-X (XRD) fue fundamental para corroborar la síntesis correcta mediante la identificación de su estructura cristalina; se realizó en un difractómetro D9 Advance, fabricado por Bruker, operado a 45 Kv y 40 mA, los rayos-X se produjeron a partir de un tubo de cobre con una longitud de onda de 1.5418 Å y se empleó una velocidad de barrido de 0.02º en tiempo de integración de 0.6 s/paso, y un intervalo de barrido de 2θ de 3.5 a 60º; el tiempo total de barrido por muestra fue de 28.5 min, mediante la técnica de Bragg Brentano. Por difracción de rayos-X se aplicó la ecuación de Scherrer para determinar el tamaño de partícula de ZnAl(O) y HDL-T.
Donde
Espectroscopía IR por transformada de Fourier
El estudio analítico para identificar compuestos orgánicos fue a través de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR); su análisis se efectuó en un espectrómetro Nicolet iS10 con un intervalo espectral de 4000-650 cm-1 a temperatura ambiente, mediante la técnica de ATR con una resolución de 4 cm-1, velocidad de espejo de 0.4747 y cristal de diamante como detector (Santana 2014, Berrocal 2014).
Análisis termogravimétrico
Se realizó el análisis termogravimétrico de las muestras en un equipo Discovery TGA5500 marca TA Instruments® con una rampa de calentamiento de 10 ºC/min entre 0 a 800 ºC y utilizando un flujo de nitrógeno de 25 mL/min como purga (Santana 2014).
Análisis biológicos
El efecto fungistático contra C. gloeosporioides y B. cinerea in vitro se determinó en cajas de Petri de 60 por 15 mm, empleando agar papa dextrosa como sustrato, los hongos fitopatógenos se adquirieron en el laboratorio de biotecnología de plantas U-3 de la UMSNH, las pruebas efectuadas se exponen en la Tabla 1. La inoculación de los hongos fue instalando un disco de micelio de 5mm de diámetro en el centro de cada placa; la incubación fue en cámara de crecimiento a 25 ºC. Se empleó dimetilsulfóxido como disolvente.
Tabla 1 Pruebas realizadas contra los hongos fitopatógenos.
| Muestra | Concentraciones por cuatriplicado |
|---|---|
| Control | |
| Blanco (ZnAl-(O)) | 50 µgmL- |
| Timol puro | 5, 25 y 50 µgmL- |
| HDL-T | 5, 25 y 50 µgmL- |
Fuente: Elaboración de los autores.
El crecimiento radial de los hongos se midió una vez observada de manera subjetiva el crecimiento exponencial total del hongo al ser llenadas las cajas de Petri de los controles por micelio; para el caso de C. gloeosporioides el tiempo de incubación total fue de 96 h, y para B. cinerea finalizó a las 48 h. Las pruebas in vivo se realizaron contra B. cinerea; se inocularon 16 frutos de fresa obtenidos del mercado Independencia de Morelia, Michoacán, con esporas del hongo. La recolección de esporas se realizó mediante raspado de micelio aéreo sobre una caja de Petri inoculada previamente, la cepa se obtuvo del Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas, Laboratorio de Biotecnología de Plantas de la UMSNH, la cual se dejó envejecer durante diez días en la caja de Petri para una mayor concentración de esporas, Figura 3. Una vez obtenido el raspado se procedió a diluir con agua estéril y destilada; posteriormente, se filtró para eliminar micelio e impurezas pasando las esporas por una malla fina de tela. Se realizó el conteo de esporas en cámara de Neubauer, una vez teniendo un conteo de 1 x 105 mL- de esporas en la solución filtrada se procedió a inocular las distintas fresas por inmersión. Las fresas se seleccionaron con características similares, tanto su aspecto físico como de maduración: se les eliminó el pedúnculo y, más adelante, para desinfectarlas, se sumergieron en solución de hipoclorito de sodio al 2% v/v hundiéndolas durante 20 min, después se enjuagaron con agua esterilizada aplicando lo necesario para eliminar trazas de cloro. Finalmente, se introdujeron por 10 min en las distintas soluciones concentradas; para tener un menor error estadístico y afirmar su reproducibilidad se hicieron cuatro réplicas con cuatro fresas cada una. Las distintas soluciones fueron: solución de timol puro (Timol, N, F., J. T. Baker, 98% pureza) a 25 μgmL-1 en dimetil-sulfóxido DMSO; solución del nano híbrido HDL − T a 25 μgmL-1 en DMSO, un blanco de DMSO puro a 25 μgmL-1 y como control se utilizó agua destilada. Se montó un sistema con cajas donde se pusieron las fresas separadas entre sí (Figura 4), de tal manera que se sellaron para evitar corrientes de aire y aisladas de los rayos de luz; se llevaron a cámara de crecimiento a 25 ºC, observando su evolución y tomando medidas del crecimiento radial cada 24 h. Todo el procedimiento fue realizado en campana de flujo laminar. Esas mismas fresas se partieron a la mitad para medir el área interna dañada a causa del hongo una vez terminado el tiempo de incubación.
Análisis de conservación de timol
Este análisis se realizó en el Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas, Laboratorio de Biotecnología de Plantas de la UMSNH, y el experimento lo propuso el doctor Salvador Jesús López Bucio. La experimentación con cromatografía líquida de alta eficacia HPLC se realizó con un sistema de Water Alliance equipado con desgasificador de vacío, mezcla de solventes cuaternarios, muestreador automático y mezcla de matriz de diodos 2996 de agua. El espectro UV se recogió en el rango 200-900 nm, extrayendo 274 para cromatogramas. Se utilizó la columna ACE C18 (4.6 x 250 µm). La fase móvil fue una combinación isocrática de acetonitrilo y agua, (50:50), inyectando un volumen de 10 µl. Se prepararon dos soluciones, una para el HDL-T en DMSO 12,5 µgmL-, otra para timol puro en las mismas condiciones, estas se prepararon en cajas de Petri con pozos, las mezclas se realizaron con sustrato de agar papa dextrosa y se analizaron por triplicado, se comparó el estudio sin la acción bioquímica del hongo B. cinerea y en contraste con la acción del mismo inoculando los centros en los pozos de Petri con discos de 5 mm de diámetro de micelio del hongo previamente envejecido: el análisis constó de obtener alícuotas de 0.5 g de agar solidificado en los muestreos desde el tiempo cero, seguido del tiempo 1 a las 72 h de incubación y se finalizó con un muestreo a las 120 h, donde se observó el desarrollo total del hongo sobre el control (Figura 5). Las muestras obtenidas se trituraron y mezclaron con 1 mL de metanol grado HPLC, posteriormente se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min por dos ocasiones, el metanol obtenido de la separación de fases se analizó en el HPLC para comparar la disminución del área bajo la curva en función del tiempo correspondiente al pico de absorción UV de timol. La solución de timol puro para obtener la referencia o estándar del pico de absorción UV y del tiempo de retención en el HPLC se elaboró en dos distintas concentraciones: 1µgmL- y 0.2 µgmL- con metanol grado HPLC; el área bajo la curva es directamente proporcional a la concentración de timol por lo que el cambio en la derivada indicó una reducción en la concentración de este.
Análisis de resultados
Características fisicoquímicas
La reconstrucción del material se corroboró comparando los difractogramas entre ZnAl-(O) y HDL -T; la estructura cristalina del HDL -T se identificó mediante los planos 003 característicos de estos materiales (JCPDS 022-0700) y el ángulo 2 theta de incidencia en 11.63º (Figura 6) indicó la presencia de CO3 intercalado y no permitió la interposición de las moléculas de timol en la región interlaminar (Bernardo et al ., 2018; Arízaga y Carbajal, 2016; Wan et al., 2015). Por otra parte, la Figura 7 corresponde al difractograma de ZnAl-(O), se reconoció el plano 110, característico de este tipo de compuestos ZnAL, asociado con el tamaño de partícula (Miao et al., 2009). Utilizando la ecuación de Scherrer descrita en la metodología, se calculó un tamaño relativo del cristal de 3.97 nm para ZnAl-(O) y de 8.85 nm para HDL-T. Este aumento en el tamaño del cristal en el material HDL-T se relaciona con su reconstrucción laminar donde las moléculas intercaladas y la cristalización tienen un papel importante en el tamaño (Santana, 2014).
En las Figuras 8 y 9, correspondientes a los espectros IR de HDL-T y del timol puro como un estándar; las moléculas orgánicas de timol presentes pudieron identificarse mediante la huella dactilar en las bandas de absorción desde 1450 a 1600 cm-1 que corresponden a C = C del anillo bencénico del timol, también se pudieron identificar en el rango de 1650 y 1830 cm-1 vibraciones correspondientes a C = O derivado de flavonoides (Bizuneh, 2014; Wu et al., 2012; Bañuelos-Valenzuela et al., 2018). Por otra parte, las bandas de absorción intensas en 1365 cm-1 o cercanas a las bandas de absorción en esa zona, corresponden a los aniones que conforman los HDL, en este caso CO3 (Santana, 2014), afirmándose la correcta reconstrucción laminar. De esta manera se concluye que el timol se encuentra impregnado y no intercalado en la estructura laminar; sin embargo, se formó el nanomaterial híbrido HDL-T deseado.
El material ZnAl-(O) (Figura 10) mostró una estabilidad térmica hasta los 735 ºC: se observaron dos eventos con pérdidas importantes de masa; una de aproximadamente 5% a 100 ºC, correspondiente a la pérdida del agua adsorbida en el sólido de óxido mixto (ZnAl-(O)), y otra del 5 % a 735 ºC, que se asoció con la descomposición del material, rompimiento de sus enlaces. En la literatura se reporta la descomposición del óxido de zinc en aproximadamente 300 ºC, por lo que se relaciona el incremento de su capacidad calorífica hasta los 735 ºC a la adición de Al a esta solución sólida, lo cual indica que el Al le otorgó el doble de capacidad calorífica generando una gran estabilidad ante las temperaturas elevadas.
En la Figura 11 se muestra el termograma del análisis TGA correspondiente a HDL-T, se manifestó una pérdida de peso de hasta un 30% aproximado en el rango de 100 ºC a 230 ºC, fue muy probable que esa pérdida haya sido debido al agua fisisorbida en primera instancia y a la descomposición de las moléculas orgánicas del timol en la región cercana a 230 ºC. El porcentaje en peso continuó disminuyendo de forma constante hasta llegar a una pérdida total por arriba del 10%; sin embargo, comparado con el termograma de ZnAl-(O) se demostró que el material reconstruido en su estructura laminar HDL-T perdió mayor porcentaje en peso cuando estuvo en el proceso térmico, esto debido a que por efectos de la temperatura el material vuelve a forma de óxido mixto (ZnAl-(O)).
En la Figura 12 se observa la morfología del HDL-T; su estructura cristalina se evidenció mediante la formación de sus láminas características, su aglomeración de estas fue notoria, sin embargo, se apreciaron de forma concisa las grandes láminas formadas. La coloración grisácea en algunas regiones de los cristales fue debido a los carbonos de las moléculas de timol impregnadas, con lo que se corrobora la presencia de estas moléculas orgánicas. La espectroscopía de rayos X de energía dispersiva (EDS) permitió analizar la caracterización elemental del material HDL-T; se corroboró la presencia de carbono derivado de los compuestos orgánicos (timol) hasta en un 21.4%; sin embargo, parte de ese carbono perteneció a los carbonatos intercalados. Por otra parte, la relación Zn +2 y Al +3 presente fue de 1.5 : 1, la relación inicial en la síntesis de ZnAl-(O), fue de 2 : 1, la pérdida proporcional en la relación quizá fue debido al proceso de síntesis térmico y de reconstrucción donde se prestó para perder cierta cantidad de los elementos debido al rompimiento de la estructura cristalina y luego a su reconstrucción (Figura 13).
Análisis fungistático in vitro
El crecimiento radial fue medido al observar el crecimiento exponencial de los hongos fitopatógenos sobre los controles; para el caso de C. gloeosporioides el tiempo máximo de incubación fue de 96 h para B. cinerea fue de 48 h.
La concentración mínima estudiada para ambos hongos fue de 25 µgmL-, corroborando lo que marcan algunos estudios (Berrocal, 2014; Bogdan, et al., 2015). Los datos obtenidos en la medición radial se presentan en las Tablas 2 y 3; se observó el claro efecto fungistático del timol puro en contraste con el HDL-T a 25 µgmL-; por otra parte, se observó de manera subjetiva que los hongos fitopatógenos mostraron inhibición en crecimiento de micelio aéreo, se pigmentaron en menor cantidad y en el caso de B. cinerea, este buscó crecer hacia el fondo del agar (Figuras 14 y 15). Por otra parte, a una concentración de timol o del HDL-T a 50 µgmL-, generó un efecto fungicida.
Tabla 2 Inhibición de C. gloeosporioides.
| Crecimiento radial (mm) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Material | Concentración (µgmL-) |
|
|
|
|
|
| Control | - | 17 | 17.3 | 17 | 17 | 17 |
| Blanco ZnAl-(O) | 50 | 17.6 | 13 | 15 | 15 | 15.1 |
| Timol puro | 5 | 16.3 | 16.6 | 16.3 | 17.6 | 16.6 |
| 25 | 9.6 | 6.6 | 5.6 | 3 | 6.2 | |
| 50 | 3.3 | 3 | 5.6 | 7 | 4.7 | |
| HDL-T | 5 | 16 | 9 | 14 | 13 | 16.3 |
| 25 | 2 | 2 | 4 | 3 | 2.7 | |
| 50 | - | - | - | - | - | |
Fuente: Elaboración de los autores.
Tabla 3 Inhibición de C. gloeosporioides.
| Crecimiento radial (mm) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Material | Concentración (µgmL-) |
|
|
|
|
|
| Control | - | 17 | 17.3 | 17 | 17 | 17 |
| Blanco ZnAl-(O) | 50 | 17.6 | 13 | 15 | 15 | 15.1 |
| Timol puro | 5 | 16.3 | 16.6 | 16.3 | 17.6 | 16.6 |
| 25 | 9.6 | 6.6 | 5.6 | 3 | 6.2 | |
| 50 | 3.3 | 3 | 5.6 | 7 | 4.7 | |
| HDL-T | 5 | 16 | 9 | 14 | 13 | 16.3 |
| 25 | 2 | 2 | 4 | 3 | 2.7 | |
| 50 | - | - | - | - | - | |
Fuente: Elaboración de los autores.
Pruebas in vitro: a) control; b) blanco; c), d) y e) efecto de inhibición del timol a 5, 25 y 50 µgmL-; f), g) y h) efecto de inhibición de HDL-T a 5, 25 y 50 µgmL-.
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 14 Inhibición de C. gloeosporioides.
Análisis fungistático in vivo
Al transcurrir 120 h de incubación de las fresas inoculadas con B. cinerea se observó el desarrollo completo de moho gris correspondiente a este, llenando por completo las fresas el control de micelio aéreo y la descomposición de materia orgánica de las fresas tornándose en una coloración oscura y emitiendo un aroma putrefacto (Figura 16), se evidenció una protección a esa descomposición de materia orgánica y alargamiento de la vida de anaquel en las fresas tratadas con HDL-T y en las tratadas con timol puro. Fue evidente la acción protectora del HDL-T contra B. cinerea, incluso ligeramente mayor que en las fresas tratadas con timol puro. La pigmentación excesiva del hongo en el control significa un envejecimiento y esporulación.
Fresas con sus distintos tratamientos: a) y b) con HDL-T, c) con la solución de timol, y, d) control.
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 16 Análisis en fresas inoculadas con B. cinerea y tratadas.
Al promediar las áreas dañadas se evidenció mediante los datos (Figura 17 y Tabla 4) un mayor control fitopatógeno en las fresas tratadas con HDL-T, superando las tratadas con timol puro.
Daño interno de las fresas causado por el hongo fitopatógeno: a) y b) fresas tratadas con HDL-T, c) fresa tratada con timol puro, y, d) fresa control.
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 17 Daño interno en las fresas inoculadas con B. cinerea.
Análisis de conservación de timol en HPLC
Los datos arrojados por el HPLC fueron tomados directamente de PC del HPLC y están presentados en la Tabla 5; el timol se descompone a compuestos secundarios por la acción bioquímica del hongo (Lambert, 2001; Palou-García y García-García, 2008; Berrocal, 2014), además de la pérdida de este por su característica volátil, el HDL-T conservó más tiempo al timol evitando en gran medida la pérdida debido a su característica volátil; sin embargo, cuando existe acción de B. cinerea, la descomposición del timol es similar si se encuentra solo o como nanomaterial híbrido: para las muestras de timol y HDL-T pasadas 72 h (T1) sin acción del hongo, hay una diferencia en pérdida del 19.3% de timol puro respecto al timol mantenido en HDL-T, indicando mayor estabilidad en el timol en forma de HDL-T, aunque se encontraba impregnado y no intercalado como se mostró en los resultados de difracción de rayos-X; sin embargo, no hay diferencia significativa en el área bajo la curva del pico correspondiente a la absorción UV del HPLC cuando la acción del hongo está presente, ambos se descompusieron en la misma proporción.
Tabla 5 Disminución del área bajo la curva en el análisis HPLC.
| Muestra sin hongo |
Área
bajo la curva de absorción UV en T0 |
Área
bajo la curva de absorción UV en T1 |
Área
bajo la curva de absorción UV en T2 |
Pérdida de timol % |
|---|---|---|---|---|
| Timol | 153,941 | 93,533 | 53,256 | 65.4 |
| HDL-T | 200,592 | 160.652 | 133,829 | 33.28 |
|
Muestra con hongo |
||||
| Timol | 153,941 | 104.295 | 8,518 | 94.4 |
| HDL-T | 200,592 | 102,657 | 12,916 | 93.5 |
Fuente: Elaboración de los autores.
Discusión
El análisis de resultados del experimento en HPLC mostró que la matriz HDL le brindó estabilidad a la molécula biológicamente activa timol disminuyendo su volatilidad, lo que hace a este nanomaterial híbrido HDL-T una alternativa al control de B. cinerea y C. gloeosporioides sin que el timol pierda su efecto tóxico en un menor tiempo comparando los efectos de inhibición con otros resultados (Berrocal, 2014; Bogdan et al., 2015). Esto es importante para un futuro desarrollo de fungicidas orgánicos que mantengan moléculas orgánicas como el timol con una mayor estabilidad ante el ambiente. Los nanomateriales a base de HDL ZnAl son excelentes matrices para el desarrollo de nanohíbridos hacia su uso en el sector agrícola, lo cual queda demostrado en esta investigación; no solo brindan una alternativa en el sector agrícola, sino que también en el sector alimenticio pensando como un nanomaterial híbrido como conservador de alimentos y evitando hacer uso de conservadores dañinos a la salud como los nitritos.
Conclusiones
Con los resultados obtenidos se puede concluir que el nanomaterial sintetizado mostró capacidad de conservación de la molécula biológicamente activa, timol, cuando no hay acción bioquímica de por medio, además se conserva procurando sus características de acción fungistática y fungicida; el aroma característico de timol se percibió notablemente disminuido lo que hace al nanomaterial híbrido mucho más manejable y aplicable que el timol puro, esto nos indica que disminuyó su volatilidad y abre la puerta a futuros desarrollos de nano biofungicidas con base en HDL y extractos esenciales para transitar a tecnologías más amigables con el entorno. Por otra parte, la descomposición de la molécula timol a la misma velocidad contrastándola en estado de híbrido ante la acción bioquímica de B. cinerea nos indica que no quedarían residuos de timol si se aplicara in situ, evitando contaminación por timol durante muchos años.
