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Introducción
La síntesis y aplicación de materiales a nanoescala (1-100 nm) es un área emergente de las nanociencias, los nanomateriales representan soluciones tecnológicas y ambientales en áreas como la conversión de energía, catálisis, tratamiento de aguas y medicina (Sharma et al., 2009). Por sus propiedades fisicoquímicas únicas, las nanopartículas (NPs) han mostrado diversas aplicaciones en el área médica, por ejemplo, en la liberación de agentes terapéuticos, detección de patógenos, reparación de tejidos e inmunoensayos, destrucción de tumores, entre otras (Khan et al., 2017; Huq et al., 2022). Además, la creciente resistencia a los antibióticos por diferentes microrganismos patógenos ha impulsado en la comunidad científica la búsqueda de alternativas para su control. Por esto, en los últimos años se ha potenciado el uso de la nanotecnología para el desarrollo de materiales con actividad antimicrobiana. De esos materiales, las nanopartículas han demostrado actividad antimicrobiana efectiva contra una gran gama de bacterias tanto Gram positivas como negativas (Rudramurthy et al., 2016; Wang et al., 2017). Con este propósito, se han sintetizado NPs de varios metales, entre las más estudiadas se encuentran las de plata (Ag), oro (Au) y cobre (Cu); de igual forma, se han sintetizado NPs de óxidos de metales como óxido de plata (Ag2O), óxido de zinc (ZnO) y óxido de cobre (CuO) (Rudramurthy et al., 2016).
Las nanopartículas de metales se sintetizan generalmente mediante procesos físicos, químicos y biológicos. Entre las ventajas que ofrece la síntesis biológica se encuentran que es amigable con el ambiente, económica y fácilmente escalable, por lo cual, en las últimas décadas, se ha fomentado el desarrollo de nuevos métodos de la llamada “síntesis verde” (Huq et al., 2022). Para ello se han empleado plantas o sus extractos, algas, hongos, levaduras y bacterias (Thakkar et al., 2010). Debido a las ventajas que presentan las bacterias como son abundancia en el ambiente, facilidad para adaptarse, crecimiento rápido, económico y manipulación de las condiciones de crecimiento, esos microrganismos se han utilizado muy frecuentemente con buenos resultados para la síntesis de NPs de diversos metales (Iravani, 2014; Pantidos y Horsfall, 2014). Para el caso particular de la síntesis de NPs de plata (NPs-Ag) se han utilizado bacterias de los géneros Aeromonas, Bacillus, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Lactobacillus, Nocardiopsis y Pseudomonas (Iravani, 2014). Sin embargo, aunque existen diversos organismos capaces de sintetizar NPs tanto intracelular como extracelularmente, hay interés en la búsqueda de microrganismos y condiciones que permitan obtener las NPs de acuerdo con las características deseadas (Thakkar et al., 2010). Los componentes celulares asociados con la síntesis bacteriana de NPs-Ag son muy variados e incluyen a surfactantes, enzimas, exopolisacáridos, flagelina, ramnolípidos, celulosa, pigmentos, esporas y polisacáridos (Singh et al., 2016).
En el presente trabajo se describe la síntesis de NPs-Ag utilizando sobrenadantes de cultivos de un aislado ambiental de P. aeruginosa. También se describe la caracterización de las NPs-Ag y su actividad antibacteriana contra bacterias patógenas tanto Gram negativas como positivas.
Materiales y métodos
Síntesis de nanopartículas
Para la síntesis de NPs-Ag se utilizó el sobrenadante de un cultivo de Pseudomonas aeruginosa J3, la cual fue aislada de una muestra de suelo contaminado con hidrocarburos (Flores-Pantoja et al., 2022). La bacteria se creció a 37 ºC por 24 h en estático en 50 ml de caldo nutritivo (BD), después, el cultivo se centrifugó a 7,000 rpm a 4 ºC, el sobrenadante se filtró en una membrana de 0.22 µm de tamaño de poro (Millex®-GV, Merk Millipore). Se mezclaron 20 ml de sobrenadante bacteriano filtrado y 80 ml de agua destilada estéril, a la mezcla se le adicionó 3 mM de AgNO3 (Sigma Aldrich). La mezcla se incubó a 37 ºC en estático por 20 h, transcurrido ese tiempo la síntesis de nanopartículas se monitoreó observando el cambio de coloración y midiendo la absorbancia de 300 a 800 nm en un espectrofotómetro Lambda 25 (Perkin Elmer). Posteriormente, la purificación se realizó de acuerdo con lo descrito en la literatura, para lo cual la mezcla de síntesis se centrifugó a 8,000 rpm por 15 min, se retiró el sobrenadante, el sedimento se lavó una vez más con agua bidestilada estéril y las nanopartículas resultantes se resuspendieron en agua estéril (Gul et al., 2016). La concentración fue determinada centrifugando por duplicado 2 ml de la mezcla de NPs-Ag a 14,000 rpm por 15 min en un tubo de 2 ml previamente pesado, el sobrenadante fue retirado con ayuda de una micropipeta y la pastilla resultante se secó a 65 ºC. Se determinó nuevamente el peso del tubo con las nanopartículas y la concentración se estimó por diferencia de peso del tubo (Huq, 2020).
Caracterización de las NPs por difracción de rayos X (DRX)
El producto de la síntesis fue centrifugado a 8,000 rpm durante 15 min y el precipitado obtenido se colocó a 65 ºC hasta la completa eliminación del agua. Los difractogramas se obtuvieron utilizando un difractómetro de rayos X (D8 Avance A25, Bruker) con radiación CuKα (0.15405 nm), con ángulo de inicio de 20º, ángulo final de 100º, paso de 0.04º, voltaje de 40 kV e intensidad de corriente de 35 mA. La calibración del equipo se efectuó mediante la medición de un patrón estándar de alúmina.
Caracterización de las NPs-Ag por microscopía electrónica de barrido (MEB)
Las NPs-Ag en polvo se colocaron sobre un portamuestra de aluminio y fueron recubiertas con oro durante 40 segundos. Después, se les realizó el análisis de microscopía electrónica en el equipo JEOL 66-10LV, equipado con espectrometría de energía dispersiva de rayos X (EDS) para observar la morfología y conocer la composición elemental de la muestra. Las imágenes se obtuvieron a distintas magnificaciones utilizando una potencia de 20 kV y una distancia de trabajo (WD) de 10 mm.
Actividad antibacteriana de las NPs-Ag
Para determinar la actividad antibacteriana de las NPs-Ag se hicieron curvas de crecimiento con diferentes concentraciones en caldo Mueller Hinton (CMH) contra bacterias Gram positiva y negativas, representantes de los principales grupos de patógenos de humanos y animales. Las bacterias que se estudiaron fueron Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus cereus 183, Listeria monocytogenes ATCC 19115 y Staphylococcus aureus ATCC 27543. Para ello, se crecieron cultivos bacterianos en CMH por 4 h en agitación constante de 150 rpm a 37 ºC, a partir de esos cultivos se prepararon diluciones equivalentes al tubo 0.5 de la escala de McFarland (1.5 x 108 UFC/ml). De cada cultivo diluido se mezclaron 10 µl con 190 µl de CMH conteniendo 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 16 µg/ml de NPs-Ag. Las placas de Elisa se incubaron por 20 h a 35 ºC. Después, se midió la densidad óptica a 630 nm en un lector de placas de Elisa (H reader 1, HLab). Los valores de densidad óptica obtenidos se transformaron a porcentajes, tomando como 100% el valor de la concentración cero de NPs-Ag. El experimento se repitió tres veces por triplicado y con los datos obtenidos se calcularon los promedios y desviaciones estándar para cada bacteria y se construyeron las gráficas correspondientes en Excel®.
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB)
Para este experimento se crecieron las bacterias en las mismas condiciones que en el apartado anterior y la CMI se consideró como aquella concentración en la que ya no se observó crecimiento de bacterias en el medio de cultivo.
Para la determinación de la CMB, se sembraron 5 µl de cada uno de los pozos de la placa de Elisa en cajas Petri con AMH. Se incubaron a 37 ºC por 24 h y la CMB fue aquella concentración a la que no se obtuvo crecimiento sobre el agar. Los experimentos tanto para la CMI como para la CMB se repitieron tres veces de forma independiente.
Resultados y discusión
Síntesis de NPs-Ag
La síntesis biológica de nanopartículas se ha descrito mediante el uso de bacterias, hongos y extractos de plantas, lo cual genera nanomateriales biocompatibles con diversas aplicaciones (Singh et al., 2016). Para el caso de bacterias se ha reportado la síntesis de NPs-Ag tanto por Gram negativas como positivas, dependiendo de la localización de la síntesis se puede considerar como intracelular o extracelular. Para el caso de la síntesis extracelular se ha logrado sintetizar NPs con diferentes morfologías, para lo cual se han usado células completas, sobrenadante de cultivos o extractos acuosos libres de células (Singh et al., 2016; Siddiqi et al., 2018). La síntesis de nanopartículas por bacterias de forma extracelular o mediante el uso de sobrenadantes de cultivos tiene varias ventajas respecto a la síntesis intracelular, entre las que se destacan la facilidad de recuperación de las nanopartículas, bajo costo y, por lo tanto, representa una buena opción para la síntesis a mayor escala (Singh et al., 2016; Siddiqi et al., 2018). También, se ha observado que la síntesis por este método produce nanopartículas de menor tamaño, más estables, tamaño más uniforme y mayor eficiencia de producción (Rabiee et al., 2022).
Aunque los mecanismos de síntesis de NPs pueden variar entre las diferentes bacterias, se ha sugerido que las nanopartículas pueden formarse principalmente por la reducción enzimática de los iones metálicos. De acuerdo con esto, se ha propuesto que una de las principales enzimas involucrada en la síntesis de NPs-Ag es la de nitrato reductasa, aunque también se ha descrito que participan otras enzimas y diversas moléculas como polisacáridos, aminoácidos y vitaminas (Singh et al., 2016; Naganthran et al., 2022). Para el caso particular de P. aeruginosa se sabe que contiene varios sistemas de secreción, a través de los cuales la bacteria secreta al exterior proteínas con funciones diversas que incluyen lipasas, proteasas, fosfatasas, toxinas, entre otras (Filloux, 2011).
En este trabajo para la biosíntesis de nanopartículas de plata se utilizó sobrenadante de un cultivo de un aislado ambiental de P. aeruginosa J3. Inicialmente, se probaron varias concentraciones de AgNO3 como material de partida, proporciones variables de sobrenadante en la mezcla de reacción y tiempos de incubación. Derivado de lo anterior, se encontró que una solución acuosa con concentraciones de 3 mM de AgNO3, mezclada con 20% de sobrenadante del cultivo bacteriano crecido a 37 ºC en condiciones estáticas e incubación de 20 h, mostró los mejores resultados en la síntesis de NPs. Por lo cual, se decidió continuar el trabajo en esas condiciones, en la Figura 1A se muestran las mezclas de reacción previa (3mMp) y 20 h después de iniciada la síntesis de NPs (3mMs). En donde se puede apreciar el cambio en la tonalidad de verde claro a café, lo cual es debido a la reducción de la plata y es característica distintiva de la síntesis de NPs-Ag (Singh et al., 2018). También se muestran los espectros de absorción UV-visible antes y después de la síntesis (Figura 1B). En estos espectros se puede apreciar el pico de absorción característico para el plasmon de resonancia superficial de las NPs de Ag alrededor de los 420 nm (Amendola et al., 2010); asimismo, se puede distinguir un pico cercano a los 380 nm después de la síntesis que es característico para las NPs de AgCl (Kim et al., 2010), lo cual indica que la formación de estas NPs se lleva a cabo a partir de la interacción del precursor y el sobrenadante.
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 1 Síntesis de nanopartículas con sobrenadante bacteriano. A) Mezclas de reacción previo a la síntesis (3mMp) y después de la síntesis (3mMs). B) Espectro de absorción de 300 a 800 nm de las mezclas de reacción antes (línea continua) y después de la síntesis de las nanopartículas de plata (línea punteada).
Caracterización por DRX de las NPs
En el análisis de DRX se obtuvo una mezcla de fases siendo el patrón de difracción principal el cloruro de plata y el patrón secundario la plata metálica, los cuales concuerdan con los patrones de difracción indexados en las cartas cristalográficas. Para la fase cúbica de AgCl pura (JCPDS: 31-1238) se obtuvieron las reflexiones de Bragg en valores de 2θ de 27.8º, 32.2º, 46.2º, 54.8º, 57.4º, 67.4º, 74.4º y 76.7º pertenecientes a los planos (200), (220), (311), (222), (400), (331) y (420), por su parte, la fase cúbica de Ag pura (JCPDS: 65-2871) mostró valores en las reflexiones de Bragg de 38.2º, 44.4º, 64.7º y 77.7º correspondientes a los planos (1 1 1), (2 0 0), (2 2 0) y (3 1 1) (Figura 2).
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 2 Difractograma de rayos X de las NPs de plata y cloruro de plata.
Una vez identificados los compuestos que conformaban las NP’s mediante el difractograma de acuerdo con la ecuación de Debye Scherrer (Tada et al., 2017) se calculó el tamaño de cristalito:
Donde k es una constante asumida de ser esférica (k = 0.9), λ es la longitud de onda de los rayos X (λ = 1.5406 Å), β es la anchura a media altura del pico de mayor intensidad y θ es el ángulo de difracción de Bragg, para ello se eligieron los planos (111) de Ag y (200) de AgCl para realizar el cálculo. El tamaño de cristalita fue de 8.5 nm para la Ag y de 11.9 nm para el AgCl.
Caracterización microscópica de las NPs-Ag
Mediante el análisis de microscopía electrónica de barrido de las nanopartículas sintetizadas se observó que formaron aglomerados de partículas con morfologías cuasi esféricas, cúbicas y algunas más amorfas. Los tamaños estimados oscilaron entre los 50 y 100 nm (Figura 3A). La diversidad de morfologías de las NPs puede ser atribuida a la gran variedad de moléculas presentes en el sobrenadante del cultivo bacteriano, pues estas biomoléculas interactúan a nivel fisicoquímico de diversas formas para la reducción de los iones de plata, su agregación y estabilización, generando que las NPs-Ag no tengan un crecimiento equiaxial otorgando diferentes características morfológicas (Kumar et al., 2010). Por otra parte, la pureza de las nanopartículas se verificó mediante el análisis de EDS validando la presencia de plata (Ag) como componente principal de las nanopartículas, también se puede observar cloro (Cl) confirmando la presencia de NPs de AgCl, corroborando lo observado en el DRX, así como también se encontraron elementos como, magnesio (Mg), oxígeno (O) y carbono (C), de los cuales algunos pueden ser parte de las biomoléculas presentes en el sobrenadante del cultivo utilizado para la síntesis (Kumar et al., 2010), mientras que el aluminio (Al) corresponde al portamuestra utilizado (Figura 3).
Actividad antibacteriana
En los últimos años las NPs-Ag han atraído la atención ya que por sus propiedades tienen aplicación en biomedicina y agricultura, así como en áreas ambientales y fisicoquímicas (Singh et al., 2016). En este sentido, las NPs-Ag son consideradas muy atractivas para el desarrollo de nuevos antibacterianos, al mostrar actividad contra una gran variedad de bacterias Gram positivas y negativas, tanto susceptibles como multirresistentes a los antibióticos (Rai et al., 2012; Franci et al., 2015).
De acuerdo con lo anterior, se realizó el análisis de actividad antibacteriana de las NPs-Ag sintetizadas en este trabajo, contra tres bacterias Gram negativas y tres Gram positivas, representativas de patógenos de humanos y animales. Como se puede observar en la Figura 4, se obtuvo inhibición del crecimiento para las seis bacterias en forma dependiente de la concentración. Por ejemplo, P. aeruginosa fue la más susceptible, reduciendo su crecimiento en 36% a 0.25 μg/ml e inhibiéndose completamente en 1 μg/ml (Figura 4A), mientras que E. coli, B. cereus y S. aureus se inhibieron 42%, 22% y 36% a 0.5 μg/ml y no se observó crecimiento en concentraciones de 2 y 4 μg/ml (Figura 4A y 4B). Las bacterias que mostraron mayor tolerancia a las NPs-Ag fueron K. pneumoniae y L. monocytogenes, las cuales redujeron su crecimiento en 26% y 55% a 1 μg/ml de NPs-Ag y no crecieron a 4 μg/ml (Figuras 4A y 4B).
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 4 Determinación de la actividad antimicrobiana de las NPs-Ag. A) E. coli (Eco), K. pneumoniae (Kpn) y P. aeruginosa (Pae); B) B. cereus (Bce), L. monocytogenes (Lmo) y S. aureus (Sau). En el eje y se indica el crecimiento bacteriano expresado como porcentaje (%) y en el eje x las concentraciones de NPs-Ag probadas. Los asteriscos indican las CMI para cada una de las bacterias. Las gráficas representan el promedio de tres repeticiones.
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y mínima bactericida (CMB)
La actividad antimicrobiana de nanopartículas sintetizadas por bacterias o sobrenadante de cultivos bacterianos pertenecientes al género Pseudomonas ha sido documentada en la literatura (Kumar et al., 2011). En este sentido, Kumar y Mamidyala, (2011) encontraron que NPs-Ag sintetizadas con sobrenadante de P. aeruginosa mostraron actividad antimicrobiana contra bacterias Gram negativas y positivas en concentraciones de 4 a 32 µg/ml. En otro estudio, se describió que la CMI de NPs-Ag biosintetizadas con sobrenadante de Pseudoduganella eburnea MAHUQ-39 contra P. aeruginosa fue de 6.25 µg/ml y para S. aureus de 100 µg/ml, de igual forma en ese trabajo se encontró que la CMB fue de 50 µg/ml y 200 µg/ml para esas bacterias (Huq, 2020). También se ha descrito que las NPs-Ag sintetizadas a partir de ramnolípidos de P. aeruginosa BS -161R fueron activas contra bacterias Gram positivas y negativas con CMI de entre 7.81 y 15.62 µg/ml (Kumar et al., 2010). De acuerdo con lo anterior, las NPs-Ag sintetizadas en este trabajo fueron muy efectivas contra bacterias Gram negativas y positivas con valores de CMI de entre 1 y 4 µg/ml (Figura 4). Por otro lado, la CMB fue de 2 µg/ml E. coli, P. aeruginosa y S. aureus y 4 µg/ml para las restantes bacterias (Figura 5). Tanto los valores de la CMI como de la CMB son menores a los mencionados anteriormente, lo cual indica que las NPs-Ag sintetizadas en este trabajo tienen mayor actividad antimicrobiana que las obtenidas en esos trabajos. La razón específica de las diferencias en la actividad antimicrobiana no está clara, ya que las nanopartículas sintetizadas en este trabajo tienen un tamaño mayor (50-100 nm), con diferentes morfologías, mientras que las NPs-Ag descritas en los estudios previamente mencionados tienen tamaños entre 8 y 24 nm y morfología monodispersa y esférica, principalmente. Sin embargo, las diferencias en la actividad antimicrobiana pueden deberse a las variaciones en los métodos de síntesis o a la composición de los sobrenadantes utilizados como agentes reductores, los cuales pueden influir en la composición de la cubierta, carga y estabilidad de las nanopartículas y, por tanto, variar su actividad (Restrepo y Villa, 2021; Madani et al., 2022). Por otro lado, en la literatura algunos autores han encontrado que las bacterias Gram positivas presentan mayor tolerancia que las Gram negativas a las nanopartículas de plata y ese efecto se ha atribuido a diferencias en la pared celular (Huq, 2020). Sin embargo, en este estudio no se encontró diferencia en la CMI o de la CMB entre los dos grupos de bacterias.
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 5 A) Determinación de la CMB de las nanopartículas de plata contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Los guiones (-) indican la concentración mínima bactericida (CMB).
El mecanismo específico de actividad antimicrobiana se desconoce aún, pero en la literatura se ha descrito que las NPs-Ag presentan actividad variable contra una gran diversidad de bacterias tanto Gram positivas como negativas. En este sentido, se ha descrito que por sus propiedades físicas y químicas, las NPs-Ag se adhieren a la superficie bacteriana y, debido a que constantemente liberan iones Ag+, inducen cambios en la estructura y función de la membrana y pared celular de las bacterias. Además, las nanopartículas de tamaño más pequeño pueden ingresar a la célula e inducir la formación de especies reactivas de oxígeno, que provocan daños en el ADN, así como otras biomoléculas importantes para el funcionamiento celular (Durán et al., 2016; Yin et al., 2020).
En conclusión, los datos descritos en este trabajo indican que el uso de sobrenadante de cultivos de P. aeruginosa J3 es una alternativa viable para la síntesis verde de nanopartículas de plata, las cuales tienen actividad antibacteriana contra bacterias tanto Gram positivas como negativas patógenas de humanos y animales.
