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INTRODUCCIÓN
La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) menciona que el uso inadecuado de antibióticos, ha propiciado la aparición de cepas bacterias resistentes a los mecanismos de acción de estos fármacos, esto supone una situación alarmante tanto para la salud humana como para la sanidad animal (OIE, 2016), debido a la escasez de terapias efectivas. Se requiere del desarrollo de nuevas opciones de tratamiento para enfermedades que afectan la salud, los extractos de plantas o bien sus compuestos puros ofrecen una alternativa potencial para el desarrollo de nuevos tratamientos antimicrobianos que puedan ser utilizadas para el control de microorganismos patógenos, debido a la presencia de metabolitos o compuestos que inhiben el crecimiento o provocan la muerte de estos (Lavor et al., 2014; Upadhyay et al., 2016).
Al respecto Maxia et al., (2005) mencionan que existen prácticas etnoveterinarias por parte de ganaderos y pastores, basadas en conocimientos transmitidos de generación en generación. Por su parte Martínez and Jiménez-Escobar (2017), documentaron un total de 62 prácticas etnoveterinarias; destacando el uso de las plantas para el tratamiento de heridas, afecciones oculares y digestivas, prácticas asociadas a 44 especies vegetales pertenecientes a 30 familias botánicas; entre las que destaca el género Croton (Croton lanatus).
La sangre de dragón, sangregado o sangre de drago (Croton draco), es uno de los arbustos utilizados en la medicina tradicional por diferentes culturas del mundo; algunos de sus usos etnomedicinales, son: hemostático, antidiarreico, antiulceroso, antiviral, cicatrizante, antitumoral, antiinflamatorio, antioxidante y antimicrobiano, entre otros (Gupta et al., 2008).
En México a esta planta se le atribuyen una gran cantidad de propiedades curativas, como las mencionadas anteriormente, debido a la amplia gama de metabolitos secundarios que posee, como: alcaloides, taninos, diterpenos y aceites volátiles (Salatino et al., 2007); sin embargo, se requiere de estudios para determinar las concentraciones a las cuales presenta su efecto farmacológico y los compuestos a los cuales se les puedan atribuir las propiedades farmacológicas.
Estudios realizados por Peres et al., (1997), demuestran que los extractos de algunas especies de Croton presentan actividad inhibitoria frente a Staphylococcus aureus y Salmonella typhimuryum.
De acuerdo a lo mencionado anteriormente, el objetivo de la presente investigación fue realizar una caracterización cualitativa y química del extracto hidroalcohólico de Crotón draco, así como determinar su actividad antibacteriana (in vitro) sobre bacterias de importancia sanitaria.
MATERIAL Y MÉTODOS
Obtención del extracto
Se recolectaron muestras de material vegetal de la parte aérea de Crotón draco durante el verano (junio-agosto) en el municipio de Huatusco (19°08′56″N 96°57′58″O) perteneciente al estado de Veracruz; para la identificación de la planta se consultó el herbario de la Universidad Nacional Autónoma de México, y el espécimen vegetal se identificó como Crotón draco subsp. draco (IBUNAM:MEXU:501697).
El material vegetal fue secado a temperatura ambiente en ausencia de luz, se maceraron 250 g del material seco (triturado) en un litro de solución hidroalcohólica (70:30, agua: metanol), durante 48 horas a temperatura ambiente en ausencia de luz. Se filtró el extracto líquido de la maceración mediante papel filtro y algodón; posteriormente el líquido obtenido fue concentrado a presión reducida en un rotavapor (BÜCHI ™ R-210, Flawil, Germany), de acuerdo a la metodología descrita por (Rivero-Pérez et al., 2016). El extracto resultante fue conservado en refrigeración hasta su posterior evaluación.
Caracterización química del extracto
Al extracto hidroalcohólico de Crotón draco, se le realizó el perfil químico cualitativo de acuerdo al procedimiento descrito por Bañuelos-Valenzuela et al., (2018), en tubos de ensayo Pyrex de 10 ml. Las pruebas fueron las siguientes: prueba del KMnO4 para insaturaciones, prueba del FeCl3 para oxidrilos fenólicos (taninos vegetales), prueba de Liebermann-Burchard para esteroles y triterpenos, prueba de Salkowski para esteroles y triterpenos, prueba de cumarinas, prueba de Baljet para sesquiterpenlactonas, prueba del H2SO4 para flavonoides, prueba de Shinoda para flavonoides, prueba de Dragendorff para alcaloides, prueba de taninos, prueba de floratanino, prueba de esteroides, prueba de la agitación, prueba del bicarbonato de sodio y prueba de Salkowski para saponinas.
La composición química del extracto hidroalcohólico de Crotón draco se determinó de acuerdo a la metodología descrita por Bañuelos-Valenzuela et al., (2018), mediante un cromatógrafo de gases (CG; Agilent Tecnologies serie 6890N fabricado en U.S.A), con una columna polar DB_WAXetr, a 250 °C y 12.13 psi, con un flujo de He 36.5 ml min-1 después de la inyección. Las condiciones para la columna fueron: temperatura inicial 50 °C de cero a dos min, aumentando de 10 en 10 °C hasta llegar a 250 °C, manteniendo la temperatura constante por 5 min para luego descender a 50 °C por dos min con un flujo de He de 1.6 ml min-1 a una presión de 12.13 psi y una velocidad promedio de 25 cm s-1, utilizando un detector de flama ionizante (FID), a una temperatura de 210 °C, con un flujo de H2 de 40 ml min-1 y un flujo de aire de 450 ml min-1. Los estándares (Sigma-Aldrich) se utilizaron en concentraciones diferentes (cuadro 1).
Cuadro 1 Concentraciones de estándares empleadas en cromatografía de gases para la caracterización química del extracto hidroalcohólico de Crotón draco
| Estándar | Timol (mg ml-1) | Carvacrol (mg ml-1) | Linalol (mg ml-1) | Terpineno (mg ml-1) | Limoneno (mg ml-1) |
| 1 | 10.373 | 8.284 | 7.744 | 7.154 | 8.496 |
| 2 | 5.186 | 4.142 | 3.872 | 3.577 | 4.248 |
| 3 | 2.593 | 2.071 | 1.936 | 1.789 | 2.124 |
| 4 | 1.297 | 1.035 | 0.968 | 0.894 | 1.062 |
| 5 | 0.648 | 0.518 | 0.484 | 0.447 | 0.531 |
| 6 | 0.324 | 0.259 | 0.242 | 0.224 | 0.265 |
Actividad antimicrobiana
La actividad antibacteriana se determinó mediante la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) para el extracto, siguiendo las especificaciones del CLSI., (2012). Las pruebas de actividad antimicrobiana se llevaron a cabo con las cepas ATCC, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 35218 , Pseudomona aeruginosa ATCC 9027 , Salmonella typhi ATCC 14028 , Salmonella cholerasuis ATCC 10708 , Listeria monocytogenes ATCC 19113 y Bacillus subtilis ATCC 6633, las cuales fueron reactivadas en Agar Muller Hinton (BD Bioxon), se corroboró la pureza de las cepas por medio de la tinción de Gram.
Una vez confirmada la morfología de la bacteria se inoculó una colonia en caldo nutritivo (BD Bioxon), el cual fue incubado en agitación constante (70rpm) por 24 horas a 37ºC. Trascurrido el tiempo de incubación, el inóculo se ajustó con caldo nutritivo al 0.5 del patrón de turbidez de McFarland (Remel, R20421), el cual corresponde a 150 x 106 cel/ml.
Para la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se utilizó el método de microdilución en placa; las concentraciones evaluadas fueron: 400, 200 100, 50, 25, 12.50, 6.25, 3.12 mg/ml, para las cepas a evaluar. Cada concentración fue preparada con caldo nutritivo (BD Bioxon). El tratamiento se realizó por triplicado en una placa de 96 pozos, se colocaron 100 μl de cada una de las diluciones más 10 μl de la suspensión bacteriana previamente ajustada a 0.5 de McFarland. Una vez realizada la inoculación la placa se incubó a 37°C durante 24 horas a 70 rpm en agitación constante. El control positivo fue Kanamicina (AppliChem 4K10421) a concentraciones de 64, 32, 16, 8.0, 4.0, 2.0, 1.0 y 0.5 µg/ml. Se utilizó caldo nutritivo como control negativo.
Para determinar el punto final de la CMI se empleó un método colorimétrico basado en el uso de sales de tetrazolium, según lo descrito por Balouiri et al., (2016). Una vez transcurrido el tiempo de incubación se agregaron 20 μl de una solución al 0.04% (w/v) de p-iodonitrotetrazolium (Sigma-Aldrich I8377) en cada pozo; se incubó por 30 minutos a 37°C y se realizó la lectura, determinándose como la concentración mínima inhibitoria; aquella a la cual la solución vira a rosa (Kaewpiboon et al., 2012; Mothana et al., 2009).
Para determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB), previa adición del p-iodonitrotetrazolium, se inocularon 5 μl de cada pozo en agar Mueller Hinton, para posteriormente incubar a 37°C durante 24 horas. Trascurrido el tiempo de incubación se verificó el crecimiento de las bacterias para determinar la concentración mínima bactericida del extracto, fracción o metabolito; considerándose como CMB, la concentración a la cual no se observó crecimiento bacteriano en la placa.
RESULTADOS
Caracterización química del extracto hidroalcohólico de Crotón draco
Los ensayos de caracterización cualitativa realizados al extracto hidroalcohólico de Crotón draco, indican la presencia de compuestos fenólicos (cumarinas, flavonoides y flavonas), terpenos (sesquiterpenos), saponinas y alcaloides.
El análisis en el cromatógrafo de gases del extracto hidroalcohólico de Crotón draco determinó la presencia de timol y carvacrol en concentraciones de 0.5340 mg/ml y 0.4206 mg/ml respectivamente; sin determinar la presencia de Linalol, terpineno y limoneno.
Actividad antibacteriana
En la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto de hidroalcohólico de Crotón draco, se determinaron diferencias estadísticas significativas (P≤0.05) entre las bacterias evaluadas, la CMI para E. coli, S. typhi, S. cholerasuis, P. aeruginosa fue de 100 mg/ml; sin encontrar diferencias estadísticas, para L. monocytogenes de 50 mg/ml con diferencias significativas con respecto al resto de las bacterias evaluadas y de 25 mg/ml para S. aureus, B. subtillis; mostrando diferencias estadísticas con las bacterias antes mencionadas. Por otra parte, las CMI para las bacterias evaluadas mostraron diferencias estadísticas significativas con respecto a la CMI del control con Kanamicina, como se muestra en el cuadro 2.
Cuadro 2 Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida del extracto hidroalcohólico de Crotón draco, sobre bacterias de importancia sanitaria
| Concentración Mínima Inhibitoria | Concentración Mínima Bactericida | |||
|---|---|---|---|---|
| Bacteria evaluada | EHCD (mg/mL) | Kanamicina (µg/mL) | EHCD (mg/mL) | Kanamicina (µg/mL) |
| E. coli | 100c | 4 | 200c | 8 |
| S. typhi | 100c | 4 | 200c | 8 |
| S.cholerasuis | 100c | 2 | 200c | 4 |
| P. aeruginosa | 100c | 16 | 200c | 32 |
| L. monocytogenes | 50b | 2 | 100b | 4 |
| B. subtillis | 25a | 0.5 | 50a | 1 |
| S. aureus | 25a | 2 | 50a | 4 |
| P value | 0.0001 | 0.0001 | ||
EHCD; extracto hidroalcóholico de Croton draco, diferentes literales a,b,c en las columnas indican diferencias estadísticas significativas (P≤0.05)
En la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hidroalcohólico de Crotón draco, se determinaron diferencias estadísticas significativas (p≥0.05) entre las bacterias evaluadas, la CMB para E. coli, S. typhi, S. cholerasuis, P. aeruginosa fue de 200 mg/ml; sin encontrar diferencias estadísticas entre estas, para L. monocytogenes de 100 mg/ml con diferencias significativas con respecto al resto de las bacterias evaluadas, y de 50 mg/ml para S. aureus, B. subtillis; mostrando diferencias estadísticas con las bacterias antes mencionadas. Por otra parte, las CMB para las bacterias evaluadas mostraron diferencias estadísticas significativas (P≤0.05) con respecto a la CMB del control positivo (Kanamicina), como se muestra en el cuadro 2.
DISCUSIÓN
Actualmente, la aparición de bacterias resistentes o multirrestentes a fármaco antibacterianos, representa un grave problema de salud pública a nivel mundial; esta problemática requiere una vigilancia constante, situación que desafía a la comunidad científica para la búsqueda de alternativas (Lai et al., 2017). La disminución de la eficacia y el aumento de la toxicidad de los antimicrobianos sintéticos agravan el problema; por lo que los científicos están buscando compuestos naturales para obtener soluciones. Al respecto la medicina tradicional basada en el uso de plantas medicinales representan una alternativa para el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias resistentes o multirrestentes, tanto en humanos como animales (Valle et al., 2015).
Los resultados de la caracterización cualitativa del extracto hidroalcohólico de Crotón draco, indica la presencia de compuestos fenólicos (cumarinas, flavonoides y flavonas), terpenos (sesquiterpenos), saponinas y alcaloides; metabolitos que han sido reportados en otras plantas con actividad antibacteriana, según la literatura: cumarinas (Souzaa et al., 2005), flavonoides (Cushnie et al., 2005), sesquiterpenos (Barrero et al., 2005), saponinas (Mandal et al., 2005) y alcaloides (Cushnie et al., 2014).
Por otro lado, la caracterización química por medio de cromatografía de gases, permitió determinar la presencia de timol (0.5340 mg/ml) y carvacrol (0.4206 mg/ml); compuestos con actividad antibacteriana de acuerdo con Du et al., (2005).
Salatino et al., (2007) reportó una caracterización cualitativa y química de diferentes especies del género Crotón, la cual coincide con la caracterización del extracto evaluado en el presente experimento.
Peres et al., (1997) reportó la actividad antibacteriana del extracto metanólico de Crotón urucurana; determinado una mejor actividad del extracto contra bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus). Resultado que concuerdan con los obtenidos en la presente investigación, ya que las concentraciones más bajas de CMI y CMB fueron frente a las cepas Gram positivas de L. monocytogenes (50 mg/ml CMI, 100 mg/ml CMB), B. subtillis y S. aureus (25 mg/ml CMI, 50 mg/ml CMB). Lo cual puede explicarse debido a que la membrana externa de las bacterias Gram negativas actúa como una barrera selectiva que limita la entrada de antibacterianos (Cabrera et al., 2007).
Estudios similares realizados por Selowa et al., (2009), reportan la actividad antibacteriana de los extractos metanolicos de Crotón salvatycus, C. megalobotrys, C. steenkapianus, contra E. coli, S. aureus y P. aeruginosa, siendo C. steenkapianus; el único inactivo frente a E. coli y S. aureus. Caso contrario a Crotón draco, el cual mantiene actividad frente a estas especies bacterianas; esta diferencia puede deberse a que los compuestos y las concentraciones de los mismos cambian dependiendo del género, especie, estado fenológico, situaciones de estrés y localización geográfica de la planta; además de la técnica utilizada para la extracción y concentración de metabolitos secundarios (Hernández-Alvarado et al., 2018).
Aunque en el presente experimento no se determinó el mecanismo de acción, el mecanismo de acción al cual se asocia la actividad antibacteriana de las cumarinas, flavonoides, sesquiterpenos, saponinas y alcaloides, se debe a su capacidad para afectar la permeabilidad de la membrana celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas; disminuir el pH citoplasmático y causar una hiperpolarización de la membrana celular, de acuerdo con lo publicado por Gonelimali et al., 2018.
CONCLUSIÓN
Los resultados indican que en el extracto hidroalcohólico de Crotón draco, contiene metabolitos con potencial actividad antibacteriana; abriendo así la posibilidad de ser utilizado como un fitofármaco capaz de actuar frente a bacterias de importancia sanitaria; sin embargo, se recomienda en estudios futuros aislar y evaluar el o los compuestos que le confieren dicha actividad con cepas de colección y cepas aisladas de campo con resistencia a diferentes antibióticos.
