texto en 
Inglés (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
INTRODUCCIÓN
La criopreservación de los espermatozoides es una herramienta importante para conservar el material genético y mantener la diversidad genética en especies silvestres y domésticas (Lermen et al., 2009). Sin embargo, se sabe que los procesos de congelación-descongelación de semen empleados en la mayoría de las especies de mamífero ocasionan la muerte de un gran número de células (Watson, 2000).
En el ovino, a pesar de que un porcentaje relativamente alto (40-60 %) de espermatozoides conservan su motilidad después de la descongelación, sólo alrededor del 20-30 % permanecen biológicamente intactos (Salamon y Maxwell, 2000). Esto es debido que durante el proceso de refrigeración y criopreservación se presenta un incremento en los niveles de las especies reactivas de oxígeno (ROS), los cuales producen cambios biofísicos y bioquímicos en la membrana de los espermatozoides (Chatterjee et al., 2001; Kankofer et al., 2005) e incluso daño en su ADN (Aitken, 1999; Agarwal et al., 2003), afectando la viabilidad y su capacidad fecundante. En los últimos años los protocolos de criopreservación han sido mejorados sustancialmente con la adición de compuestos con propiedades antioxidantes, repercutiendo positivamente en la mejora de la calidad del semen descongelado (Peña et al., 2005; Thuwanut et al., 2008; Domínguez-Rebolledo et al., 2010; Mata-Campuzano et al., 2015).
Los antioxidantes juegan un papel importante en la protección de las células espermáticas, frente a los efectos dañinos que producen las ROS (Halliwell, 1997). La función de un antioxidante se basa en donar electrones a otras moléculas que tiene uno o más electrones perdidos (ROS), y así evitar que se produzcan alteraciones en las moléculas de los lípidos, proteínas y del ADN espermático (Tremellen et al., 2008).
El antioxidante Trolox es un análogo de la vitamina E, soluble en agua, y se ha utilizado en una gran variedad de sistemas celulares para evitar los efectos de las ROS (Halliwel, 1994; Michielset al., 1994). Se ha observado que la adición de este antioxidante en el medio de congelación, mejora la calidad de los espermatozoides descongelados de cerdo (Peña et al., 2005); así como la viabilidad espermática de semen descongelado en ovinos de la raza Churra (Mata-Campuzano et al., 2015). En muestras espermáticas procedentes del epidídimo (postmortem) de ciervo Ibérico, se demostró que este antioxidante es capaz de disminuir las cantidades de ROS y de la lipoperoxidación; además de proteger los acrosomas y el ADN espermático (Domínguez-Rebolledo et al., 2010). Thuwanut et al. (2008) observaron que la adición del Trolox al diluyente de congelación, mejoraba la motilidad y la viabilidad en los espermatozoides de epidídimo de gato en la descongelación.
El antioxidante Crocina (glucosil éster de crocetina), es un carotenoide poco soluble en agua, que se encuentra en el pigmento amarillo del azafrán (Crocussativus). Se ha demostrado que la adición de este antioxidante en el medio de incubación de semen, mejora la calidad de los espermatozoides descongelados del ciervo Ibérico (Domínguez-Rebolledo et al., 2010) y toro (Sapanidou et al., 2014). En semen de gallos, mejora la viabilidad, motilidad, actividad mitocondrial y reduce la lipoperoxicación a la descongelación (Mehdipour et al., 2019).
Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la adición de los antioxidantes Trolox y Crocina al medio de congelación, sobre las características espermáticas post-criopreservación en ovinos de la raza Pelibuey.
MATERIAL Y MÉTODOS
Ubicación
El estudio se realizó en el Banco de Germoplasma Ovino Pelibuey y Blackbelly, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Campo Experimental Mocochá.
Animales
Se utilizaron 4 ovinos adultos (2.5 años), de la raza Pelibuey, de 40 a 45 kg de peso vivo, con una condición corporal de 3 a 3.5; a los cuales previamente se evaluó su estado de salud y calidad espermática.
Obtención de muestras espermáticas
Se obtuvieron 36 eyaculados de los 4 sementales, mediante una vagina artificial, y con la ayuda de una oveja que sirvió como maniquí.
Dilución espermática
Los eyaculados obtenidos fueron mezclados (pool) y diluidos en Triladyl® + 20% yema de huevo, a una concentración final de 400 x 106 espermatozoides/ml. Posteriormente, las muestras fueron divididas en 3 tratamientos: T1: Trolox 1mM; T2: Crocina 1mM; TT: Testigo (sin antioxidante), para luego ser envasadas en pajillas de 0.25 ml.
Congelación de semen
La congelación de las muestras se realizó colocando las pajillas a 4 cm sobre la superficie del nitrógeno líquido (LN2), durante 10 minutos. Inmediatamente después las pajillas se sumergieron en LN2 y se almacenaron hasta su evaluación.
Descongelación de semen
El procedimiento de descongelación se realizó mediante la inmersión de las pajillas en un baño maría a 37°C durante 30 segundos; posteriormente las muestras fueron evaluadas a la 0 h (descongelación), a las 6 horas de incubación a 37 °C.
Concentración espermática
Se diluyó una pequeña fracción de la muestra de semen (5 µL), en 995 µL agua destilada; después se tomó 9 µL de la muestra diluida en agua y se colocó en cada uno de los dos lados de la cámara bücker, para estimar su concentración, con el módulo de concentración del sistema CASA (ISAS®v1 (Proiser R + D, Valencia, España). Se capturaron 4 campos de cada lado de la cámara y se obtuvo la concentración espermática.
Motilidad espermática
La motilidad se analizó con el sistema CASA, colocando 5 µL de semen descongelado y diluido a ~30 x106/ml de espermatozoides, sobre una cámara de recuento Makler® (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel), precalentada a 37ºC; y se procedió a la captura de al menos cinco campos con un mínimo de 300 espermatozoides/muestra. Los parámetros de motilidad evaluados fueron: Motilidad Total (MT%) y Motilidad Progresiva (MP%).
Viabilidad espermática
Se evaluó mediante la tinción de SYBR14-IP (Live/Dead® kit L-7011, InvitrogenTM), añadiendo 1µL de SYBR14 (10 µM) y de IP (12 µM) de la solución stock en 100 µL de muestra espermática, diluida en solución salina (PBS); y se dejó incubar durante 10 minutos a 37ºC. Posteriormente se colocaron 5µL de la muestra entre un portaobjeto y cubreobjeto precalentado a 37ºC, y se procedió a su evaluación por medio de un microscopio de epifluorescencia (LWScientific i40-ADN); contabilizando 200 espermatozoides, los cuales presentaban fluorescencia roja (muertos), y de color verde los que estaban vivos.
Integridad del acrosoma
Se evaluó mediante la tinción de FITC-PSA (100µg/ml, L-0770, Sigma-AldrichTM), añadiendo 5µL de la solución stock en 100 µL de muestra espermática diluida en PBS y se dejó incubar en la oscuridad durante 30 minutos a 37ºC. Inmediatamente después se colocaron 5µL de la muestra entre un portaobjeto y cubreobjeto. Finalmente se contabilizaron 200 espermatozoides con un microscopio de epifluorescencia, los cuales presentaban fluorescencia de color verde (acrosomas dañados), y sin fluorescencia de los acrosomas intactos.
Actividad mitocondrial
Se analizó con la tinción JC-1 (153 µM, Molecular Probes® T-3168, InvitrogenTM), añadiendo 1µL de la solución stock en 100 µL de muestra espermática diluida en PBS y se dejó incubar en la oscuridad durante 10 minutos a 37ºC. Después, se colocaron 5µL de la muestra sobre un portaobjeto y cubreobjeto, y se contabilizaron 200 espermatozoides mediante un microscopio de epifluorescencia, los cuales presentaban en la parte intermedia del flagelo una fluorescencia de color naranja (mitocondrias activas), y de color verde las mitocondrias inactivas.
Integridad de la membrana plasmática de la cola (HOST)
Se realizó diluyendo 5µL la muestra espermática en 50µL de solución de endósmosis (0.735 g de citrato de sodio dihidratado y 1.351 g de fructosa en 100 ml de agua destilada) a 100 mOsm/L y se dejó incubar durante 37 °C. Posteriormente se colocaron 5µL de la muestra sobre un portaobjeto y cubreobjeto y se contabilizaron 200 espermatozoides con un microscopio de contraste de fases, los cuales presentaban colas enrolladas (endósmosis positiva), y no enrolladas (endósmosis negativa).
Análisis estadístico
Las variables expresadas como porcentajes (motilidad total, motilidad progresiva, viabilidad, actividad mitocondrial, acrosomas intactos y Host), fueron transformadas al arcoceno√(variable)/100 antes de su análisis. Posteriormente se analizó con un modelo lineal general (GLM) con procedimiento PROC GLM; y para encontrar las diferencias estadísticas entre tratamientos se utilizó la prueba de Tukey a P ≤0.05, a través del paquete estadístico del Statistical Analysis System (SAS Inst. Inc., 2003).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A las 0 y 6 h de incubación, ninguno de los parámetros evaluados presentó diferencias (P>0.05) entre los tratamientos (cuadro 1). Estos resultados difieren a los obtenidos por Thuwanut et al. (2008) con espermatozoides epididimarios de gato suplementados con el antioxidante Trolox a 1mM; ya que la MT, MP y la viabilidad espermática mejoraron a la descongelación. Si bien son especies distintas, la diferencia en resultados podría atribuirse a que los espermatozoides provenientes del epidídimo de gato por castración, nunca han estado en contacto con las secreciones de las glándulas que forman el plasma seminal, que es donde se encuentra la mayor defensa antioxidante (Chen et al., 2003); por lo que existen diferencias en la congelación entre espermatozoides procedentes de eyaculados y epididimarios (Gilmore et al., 1998), que afectan la sensibilidad al enfriamiento, como la resistencia a la congelación (Schmehl et al., 1986). En este sentido, el Trolox pudo haber actuado directamente y sin competencia alguna sobre los espermatozoides del epidídimo, similar a lo observado por Domínguez-Rebolledo et al. (2007), con plasma seminal ovino sobre el semen descongelado.
Tabla 1. Porcentajes (%) de los parámetros espermáticos evaluados a la 0 h y a la 6 (media ± error estándar).
| Hora | Tratamiento | Motilidad Total | Motilidad Progresiva | Viabilidad | Actividad mitocondrial | Acrosomas intactos | Host |
| 0 |
T1 T2 TT |
57.5±5.3aA 49.9±5.6aA 58.6±3.9aA |
17.1±1.6aA 15.8±2.2 aA 15.3±2.2 aA |
39.5 ± 3.9 aA 45.2 ± 5.2 aA 41.4 ± 5.2 aA |
50.7 ± 6.2 aA 42.3 ± 5.4 aA 40.5 ± 6.0 aA |
49.6 ± 6.4 aA 44.6 ± 6.1 aA 47.7 ± 6.1 aA |
23.6 ± 3.1 aA 23.4 ± 3.1 aA 19.3 ± 2.1 aA |
| 6 |
T1 T2 TT |
36.6±7.0aA 39.2±5.8aA 26.7±4.3aB ** |
8.6±7.0aB 8.9±5.8 aB 8.2±4.3 aB |
24.6 ± 4.0 aB 22.8 ± 2.7 aB 27.2 ± 4.0 aB |
15.7 ± 1.9 aB 17.1 ± 1.5 aB 20.0 ± 2.2 aB |
46. 0 ±2.7 aA 43.7 ± 4.0 aA 41.7 ± 3.5 aA |
10.2 ± 1.0 aB 13.1 ± 1.1 aB 12.4 ± 1.2 aB |
T1: Trolox 1mM; T2: Crocina 1mM; TT: Testigo (sin antioxidante). (ab) Literales diferentes dentro de la misma columna indican diferencias significativas entre tratamientos dentro de cada hora (P<0.05). (AB) Literales diferentes dentro de la misma columna indican diferencias significativas (P<0.01**) entre el mismo tratamiento a través del tiempo.
Por otra parte, en sinergia con los antioxidantes presentes en el plasma seminal, las muestras seminales utilizadas en este estudio, pudieron verse alteradas, ocasionando que su efecto disminuya. Asimismo, se ha reportado que la suplementación del diluyente con Trolox a 1mM, dependiendo del tipo de aditivo utilizado en el diluyente, puede mejorar o no la viabilidad del semen congelado de ovinos de la raza Churra (Mata-Campuzano et al., 2015); es decir, cuando el diluyente era elaborado a base de lecitina de soya, el antioxidante Trolox presentaba una mayor viabilidad en las muestras descongeladas; mientras que cuando se utilizaba un diluyente a base de tris, como el que se utilizó en este estudio (Triladyl®), la viabilidad en los espermatozoides no mejoraba. La soya contiene isoflavonas, que actúan como antioxidantes; los cuales pudieron haber ejercido algún tipo de protección sobre los espermatozoides durante el proceso de la congelación-descongelación o en combinación con el Trolox, produciendo una sinergia que coadyuvo a potenciar los efectos benéficos en los espermatozoides. Con la adición del antioxidante Crocina, se ha reportado una mayor viabilidad, motilidad, actividad mitocondrial y reducción de la lipoperoxidación, en muestras espermáticas de gallo a la descongelación (Mehdipour et al., 2019).
A través del tiempo de incubación (0 a 6 horas), la MT se comportó de forma similar en el T1 y T2, pero no así en el TT (P<0.01); por el contrario, la integridad de los acrosomas en los tres tratamientos resultó similar (P>0.05). La MP, viabilidad, actividad mitocondrial y Host disminuyeron a través del tiempo de forma similar en los tres tratamientos (tabla 1). Los resultados son similares a los reportados por Domínguez-Rebolledo et al. (2010) en muestras espermáticas de epidídimo descongeladas del ciervo Ibérico, donde la MT y la integridad de los acrosomas se mantenían durante la incubación a 37 ºC con el antioxidante Trolox y Crocina a un 1mM. Asimismo, Sapanidou et al. (2014) observó que la motilidad, viabilidad y la integridad de los acrosomas en espermatozoides de bovinos se mantenía durante la incubación a 37 ºC con 1mM de Crocina. A la vista, de los resultados tras 6 h de incubación donde el T1 y T2 mantuvieron la MT y la integridad de los acrosomas, se puede decir que los antioxidantes probados son eficientes y recomendables para su incorporación al diluyente previo a la congelación; de tal modo, que la dosis seminal estará vigente en el tracto genital, tras la inseminación hasta el momento cercano a la ovulación.
