INTRODUCCIÓN

El sector ganadero ha sufrido transformaciones sustanciales en las últimas décadas. La creciente demanda resultante de la explosión demográfica exige incrementos en la producción ganadera (^{INECC, 2018}). En México, la producción de bovinos ha tenido un crecimiento constante de 1.6% tan solo en la última década, con lo que se ostenta actualmente una producción de 1.88 millones de toneladas de carne en canal (^{INECC, 2018}). No obstante, un incremento en la producción ganadera lleva consigo un aumento en las emisiones de gases de efecto invernadero (GEI), provenientes de la fermentación entérica ruminal; principalmente de metano. Además, la síntesis de metano ruminal le representa una pérdida de energía al animal de hasta 12% (^{Johnson y Johnson, 1995}). El metano es un gas que presenta hasta 28 veces más poder calorífico que el CO₂, por lo que se busca disminuir las emisiones del mismo. El metano antropogénico alcanza hasta 40% del total del metano emitido a la atmósfera, del cual 18% es atribuible a la ganadería a través de la fermentación entérica ruminal (^{IPCC, 2015}). Tan solo en México, en 2015 se registró un total de emisiones de 510,043 Gg de CO₂e (equivalentes de CO₂), de los cuales el 13% está relacionado con la actividad ganadera; aproximadamente el 40% de estas emisiones es metano (^{INECC, 2018}). Debido a esto, infinidad de investigaciones alrededor del mundo han tratado de crear diversas estrategias que disminuyan la producción de metano ruminal, a través de: modificaciones en la dieta, el empleo de diversos aditivos, vacunas, uso de extractos naturales, administración de compuestos químicos y, últimamente la suplementación de compuestos bio-activos extraídos de plantas (^{Martin et al., 2010}; ^{Pámanes-Carrasco et al., 2019}).

Actualmente, los esfuerzos han sido enfocados a la utilización de fuentes de forraje no convencionales, que presenten una alternativa alimenticia en la producción animal. De este modo, algunas plantas cuyo uso no es común en la alimentación de rumiantes, pueden ser empleadas como una alternativa para reducir las emisiones de GEI. De hecho, debido a la limitación en la disponibilidad del forraje en las zonas áridas y semi- áridas, hay algunos árboles, arbustos y cactáceas que pudieran emplearse como fuente de forraje. A este respecto, Leucaena (LL) es conocida por tener una alta calidad nutricional, principalmente proteína (22-27% MS; ^{Aye y Adegun, 2013}) y usualmente se adapta a la defoliación y rebrote en la época de secas; en zonas áridas puede llegar a presentar una producción de hasta 1121 ha¹ en zonas de hasta 430 mm de precipitación anual y una temperatura media de 32°C (^{Singh y Toky, 1995}). Además, en investigaciones previas no se han reportado cambios en el consumo de materia seca y ganancia diaria de peso cuando se añadió 40% de LL a la ración (^{Piñeiro-Vázquez et al., 2017}). De igual manera, ciertas cactáceas sin espinas, como la variedad de Opuntla ficus-indica (OFI), son consideradas forrajes frescos y palatables que se producen en la época seca, y representan una fuente importante de agua para los animales (^{González-Arreola et al., 2019}). Sin embargo, el contenido de proteína en las cactáceas es bajo, por lo que los investigadores han desarrollado procedimientos biotecnológicos que mejoren el contenido de proteína cruda a través de fermentaciones en estado sólido, utilizando diferentes cultivos de levaduras de manera exitosa (^{Flores-Ortiz y Reveles-Hernández, 2010}; ^{Herrera et al., 2014}, ²⁰¹⁷). Adicionalmente, la adición de células vivas, como las levaduras, muestran una reducción en la metanogénesis en experimentos in vitro (^{Hristov et al., 2013}). Además, ambas especies (LL y OFI) contienen metabolitos secundarios, tales como taninos condensados, saponinas y/o flavonoides, que pueden actuar como inhibidores de la síntesis de metano (^{Aye y Adegun, 2013}; ^{Alves et al., 2017}; ^{Pámanes-Carrasco et al., 2019};). Consecuentemente, el uso de estas especies como fuentes de forraje en la alimentación de rumiantes pueden ser una alternativa en la reducción de las emisiones de GEI, metano principalmente; sin afectar el desarrollo productivo.

Por lo tanto el objetivo del presente trabajo, fue evaluar la inclusión de Leucaena leucocephala y Opuntia ficus-indica fresco y fermentado, como sustituto del heno de alfalfa en la fracción forrajera sobre los patrones de fermentación, cinética de producción de gas y metano in vitro

MATERIAL Y MÉTODOS

Área de estudio y materiales

Esta investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Nutrición Animal de la Universidad Juárez del Estado de Durango, México. Las plantas de L. leucocephala fueron recolectadas al azar durante el otoño de 2017, de un cultivar ubicado en la misma Universidad. Las plantas colectadas midieron 1 m de longitud y el follaje fue removido manualmente después de la recolección. Las pencas de O. ficus-indica (variedad AV6) fueron colectadas de un plantío ubicado en terrenos aledaños a la Universidad. Los cultivos de levadura de Saccharomyces cerevisiae fueron adquiridos en un comercio local. En el cuadro 1 se muestra el análisis químico proximal de los ingredientes principales (alfalfa, LL, OFI y OFI fermentado).

Fermentación de O. ficus-indica

Las muestras de OFI fueron fermentadas con Saccharomyces cerevisiae a 32°C, por 48h de acuerdo a los procedimientos reportados por ^{Herrera et al. (2014)}. Los cultivos de levadura se adicionaron al 1% (MS). Después de la fermentación, las muestras fueron secadas y reducidas a un tamaño de partícula de 1 mm para su posterior análisis.

Formulación de tratamientos experimentales y análisis químicos

Cuatro tratamientos experimentales fueron formulados (cuadro 2), como dietas para ganado bovino con la inclusión de L. leucocephala (T2), O.ficus-indica (AV6), fresco (T3) y O. ficus-indica fermentado (T4), como sustitución parcial de la fracción de heno de alfalfa en el tratamiento testigo (TI).

Se prepararon 10 kg de cada tratamiento experimental y fueron mezclados en un mezclador rotativo con capacidad de 150 L (Gladiator PRO, modelo H8155/16); después, una muestra representativa de 1 kg fue tomada y mediante el método de cuarteo se tomaron sub-muestras para cada análisis. Todos los tratamientos experimentales fueron sujetos a análisis de composición química (cuadro 3) de acuerdo con los procedimientos estandarizados por ^{AOAC (2010)}. Además, la fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA), así como la celulosa, hemicelulosa y la fracción de lignina, fueron determinadas en un equipo Fiber Analyzer 200 (ANKOM Technology, USA), como lo propuso el fabricante (^{ANKOM, 2020}). La digestibilidad in vitro de la material seca (DIVMS) y digestibilidad in in vitro de la materia orgánica (DIVMO), fueron analizadas de acuerdo a los procedimientos sugeridos por ^{ANKOM (2018)}.

Compuestos fenólicos totales y taninos condensados

Los compuestos fenólicos totales (CFT), fueron determinados de acuerdo a los métodos propuestos por ^{Heimler et al. (2005)}. Además, los taninos condensados (TC) fueron analizados como los reportó ^{Porter et al. (1986)}.

Patrones de fermentación in in vitro

Para los ensayos de fermentación in vitro, se obtuvo líquido ruminal de dos becerros de raza Brangus, dotados de cánula ruminal, con un peso aproximado de 450 kg, y alimentados con ensilado de maíz y concentrado en una proporción 50:50. Aproximadamente, 1 g de muestra de cada tratamiento experimental fue incubado con 120 mL de solución buffer-inóculo ruminal en una relación 2:1 a 39°C en módulos de vidrio ANKOM (ANKOM Technology, USA), con tapas herméticas de goma y plástico, de acuerdo a lo propuesto por el fabricante por triplicado (^{ANKOM 2018}). Después de transcurridas 24h de incubación, los módulos fueron abiertos y el pH fue medido. Inmediatamente, se tomaron alícuotas de 10 mL para ser colocadas en frascos de vidrio, para posteriores análisis de ácidos grasos volátiles (AGV) y nitrógeno amoniacal, de acuerdo a lo propuesto por ^{Galyean (2010)}.

Producción de gas in vitro

Aproximadamente 1 g de cada tratamiento experimental fue colocado en módulos de vidrio ANKOM (ANKOM Technologies, USA), equipados con un transductor de presión inalámbrico por triplicado. Las fermentaciones se llevaron de acuerdo a lo propuesto por el fabricante (^{ANKOM, 2018}), incubando la muestra con una mezcla de solución buffer-inóculo ruminal en una relación 2:1. Las incubaciones se llevaron a cabo hasta las 96h y los cambios de presión se registraron cada hora durante el proceso. La cinética de la producción de gas in in vitro fue estimada mediante el ajuste de los datos obtenidos al modelo de Gompertz, de acuerdo a la siguiente ecuación (^{Murillo-Ortiz et al., 2018}):

En donde GP= producción de gas al tiempo t (mL); A= máxima producción de gas (mL); kd= constante de producción de gas (Ir¹); y L= tiempo de latencia antes de que empiece la producción de gas (h). Adicionalmente, para las mediciones de las proporciones de metano y CO₂, la válvula de alivio de presión de los módulos fue abierta por espacio de 2 s, y el gas liberado fue conducido a través de un tubo hacia un analizador portátil de gas, de acuerdo al procedimiento propuesto por el fabricante (GEM™5000, LANDTEC, USA) y adecuado por ^{González-Arreola et al. (2019)}.

La energía metabolizable (EM) fue estimada de acuerdo con la ecuación propuesta por ^{Menke et al. (1979)}, la cual se presenta a continuación:

En donde EM= energía metabolizable (MJ/kg MS); GP24= producción de gas a las 24 h de incubación (mL); PC= proteína cruda (% MS); EE= extracto etéreo (%MS).

Análisis estadístico

Los datos experimentales obtenidos fueron analizados de acuerdo a un diseño completamente al azar, utilizando el procedimiento GLM del paquete estadístico ^{SAS (2011)}. La comparación de medias se llevó a cabo mediante la prueba Tukey, declarando diferencias significativas con una P<0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los patrones fermentativos de los tratamientos experimentales se presentan en el cuadro 4. La concentración de nitrógeno amoniacal fue diferente entre los tratamientos (P<0.05); el valor más alto se obtuvo con el tratamiento testigo (TI). Así, al agregar LL y OFI a la ración, se observaron reducciones del 26.5, 28.7 y 18.4% en T2, T3 y T4, respectivamente, en comparación con T1. Además, los valores obtenidos de N-NH3 en este estudio se encuentran dentro del rango óptimo (5 a 10 mg/dL), el cual maximiza el consumo de materia seca y el empleo de materia orgánica en el rumen (^{Chandrasekharaiah et al., 2011}). Igualmente, la concentración de ácidos grasos volátiles (AGV) y ácidos grasos volátiles totales (AGVT) presentaron diferencias entre tratamientos (P<0.05). De acuerdo a lo expuesto por ^{Sutton et al. (2003)}, las concentraciones normales de ácido acético, propiónico y butírico en una fermentación ruminal son aproximadamente de 60, 20 y 15%, respectivamente; no obstante, las cantidades reportadas en este estudio difieren de las reportadas anteriormente.

Las concentraciones más altas de ácidos grasos volátiles totales (AGVT), así como ácido acético, se presentaron en T3. Por el contrario, las concentraciones de ácido butírico y propiónico fueron menores en el T3. No obstante, cuando se lleva a cabo el cálculo de la concentración molar de cada ácido graso volátil, las cantidades de acetato, propionato y butirato son mayores en T3 que en los demás tratamientos.

Estos cambios en la concentración de AGV pueden estar relacionados con el incremento en los contenidos de carbohidratos, como la hemicelulosa; debido a la adición de OFI fresco a la ración. Al respecto, ^{Johnson y Johnson (1995)} comentan que una disminución en la relación acetato:propionato representa un proceso de fermentación más eficiente y una reducción en las pérdidas de energía mediante la formación de productos finales de la misma. Lo anterior se puede observar mediante la disminución en la producción de propionato, cuando se incluye OFI fresco a T3.

Como se puede observar en el cuadro 1, hay una diferencia marcada en las concentraciones de compuestos fenólicos totales (CFT), y de taninos condensados (TC) entre los diferentes ingredientes de la fracción forrajera. Debido a esto, en el cuadro 4, se muestran diferencias entre tratamientos en CFT y TC (P<0.05). Los contenidos de CFT se incrementaron más de cuatro veces cuando se incluyó LL a la ración en T2. De la misma manera, CFT se incrementaron cerca del 45% cuando se incluyó OFI a T3. ^{Karimi et al. (2013)} observaron contenidos tres veces menores de CFT cuando compararon alfalfa con LL. Además, los contenidos de CFT en los cladodios de OFI dependen de la madurez de la planta; mismos que se reportaron en valores cercanos a 33 mg/g de MS (^{Figueroa-Pérez et al. 2016}). De manera similar, los contenidos de TC son diferentes entre los tratamientos experimentales (P<0.05); cuando se incluyó LL a T2; el contenido de TC se incrementó cerca de 20 mgEC/g MS. Estos resultados concuerdan con los reportados por ^{Berard et al. (2011)}. Debido a que LL es considerada como una planta tanífera, los contenidos de CFT y TC deben ser más altos en T2 en comparación con los demás. Además, cuando se adicionó OFI a T3 y T4, se observó una reducción en la concentración de TC. ^{Márquez y Suárez (2008)} reportaron un contenido de TC en la alfalfa cercanos a 0.5 mg/g MS; mientras que en los cladodios de OFI las concentraciones eran menores.

Este estudio encontró el mismo efecto. A este respecto, los altos contenidos de CFT con la inclusión de OFI pueden atribuirse a otros compuestos fenólicos diferentes de los TC, tal como lo afirmaron ^{Cardador-Martínez (2011)}. Además, ^{Koenig et al. (2018)} afirmaron que la adición de extractos puros de TC superiores a 3.5%, no afecta el consumo de materia seca en becerros de engorda.

Los parámetros de la cinética de producción de gas se presentan en el cuadro 5. La máxima producción de gas “A” fue diferente entre tratamientos (P<0.05). El valor de “A” registrado en T4 fue diferente al obtenido en T2, presentando una media de 138.4 (mL/g MS) (P<0.05); mientras que los valores en la fase lag (L) disminuyeron cuando se incluyó LL en T2, cuando es comparado con T3 y T4 (P<0.05). De acuerdo a lo que dice ^{Van Soest (1994)}, los microorganismos celulolíticos tardan menos tiempo en atravesar la pared celular del forraje con un menor contenido de lignina; sin embargo, este efecto no se observa en este estudio. Aparentemente, los incrementos en la fracción de celulosa en T3 y T4 conllevan a un incremento en la fase lag (L). Este efecto lo encontró también ^{Grilli et al. (2015)}, cuando midieron la degradabilidad de la hemicelulosa en diversos forrajes; la hemicelulosa contenida en la alfalfa se degradó en menor tiempo que la contenida en otras especies forrajeras.

Por otro lado, la producción de gas a las 24h no mostró cambios entre tratamientos (P>0.05). No obstante, se observaron reducciones del 26 y 14% en la producción de metano con la inclusión de LL y OFI en T2 y T3, respectivamente; de los cuales T2 registró la menor producción de metano (P<0.05). Las reducciones en la producción de metano se pueden atribuir a la presencia de metabolitos secundarios en la ración. En este sentido, las más altas concentraciones de CFT y TC se presentaron en T2. Estos resultados concuerdan con los reportados por^{Tavendale et al. (2005)}, quienes establecen que los más altos contenidos de TC tienden a formar complejos con las proteínas, lo cual limita la degradación de la misma por acción de los microorganismos presentes durante la fermentación. Adicionalmente, la producción de metano disminuye mediante la reducción en la digestión de la fracción fibrosa. Esto último se observó en el T2, el cual presentó menor digestibilidad. De la misma manera, ^{Tan al. (2011)} reportaron que los TC contenidos en LL pueden reducir la población de microorganismos metanogénicos, debido a la mayor presencia de protozoarios, y de esta manera afectar la transferencia de iones hidrógeno. Así, la producción de metano como captador de electrones se ve limitada. Además, la reducción en la producción de metano en T3 y T4 está directamente relacionada con la presencia de CFT. Lo anterior coincide con la investigación previa llevada a cabo por Tavendale et al. (2005) y ^{Murillo-Ortiz et al. (2018)}. Estos autores afirman que la presencia de metabolitos secundarios como los CFT, son moléculas solubles y no fermentables que se encuentran negativamente relacionadas con la síntesis de metano.

Por su lado, la menor producción de CO₂ se registró en T2, en comparación con TI (P<0.05). Por el contrario, la mayor relación CO₂: CH₄ se encontró en T2 comparada con T1. Estos resultados son consistentes con la presencia de taninos condensados; los TC de las plantas reducen la metanogénesis ruminal mediante la inhibición de los metanogénicos (^{Tavendale et al., 2005}). Asimismo, los altos valores en la relación CO₂: CH₄ en TI, indican que en algún punto de la ruta metábolica se está inhibiendo la metanogénesis, ya que hay más volumen de CO₂ presente, mismo que no es sintetizado a metano.

La síntesis ruminal de metano involucra la reducción sucesiva de CO₂ a metano, a través de diferentes niveles de formil, metileno y metil, y su reacción con las coenzimas; entre ellas la Coenzima M en el último paso de la síntesis (^{Liu y Whitman, 2008}). A este respecto, ^{Patra y Saxena (2010)} mencionan que la actividad antimetanogénica de los taninos pudiera radicaren la actividad sobre ciertas proteínas funcionales (enzimas), localizadas en ciertos sitios accesibles de los matanógenos. Esta acción pudiera interrumpir la metanogénesis ruminal, mostrando la inhibición de CH₄ en un punto donde el CO₂ es consumido como sustrato; ^{Murillo-Ortiz et al. (2018)} observaron el mismo efecto.

CONCLUSIÓN

Estos resultados indican que la sustitución de alfalfa por Leucaena leucocephala, mantiene la calidad nutritiva; así como valores similares en la producción de gas y la cantidad de AGV in vitro. Adicionalmente, la inclusión del 30% de Leucaena leucocephala y Opuntia ficus-indica reducen 26 y 14% la concentración de metano in vitro, respectivamente. Por lo anterior, debido a su calidad nutricia y a sus características fermentativas pudiesen incluirse en la dieta de bovinos, y así contribuir a la mitigación de gases de efecto invernadero.