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INTRODUCCIÓN
La mastitis es definida como la inflamación de la glándula mamaria, causada principalmente por patógenos (Bedolla et al., 2008), que ocasiona una disminución en la producción y calidad de la leche en su forma subclínica; sin embargo puede convertirse en mastitis clínica, donde puede llegar hasta el desecho del animal por pérdida de la funcionalidad de la glándula mamaria (Echeverri et al., 2010). Asimismo la mastitis subclínica suele estar presente por mayor tiempo y es más frecuente que la mastitis clínica (Bedolla et al., 2007). Las pérdidas económicas pueden alcanzar hasta cinco mil pesos por cada lactancia de una vaca al año (Van et al., 2016); aunque se han encontrado alrededor de 137 microorganismos en ganado lechero con mastitis, sólo un reducido número de patógenos son los responsables de la mayoría de los casos (Wolter et al., 2004); por ejemplo, tal es el caso del género Staphylococcus spp, que expresan factores de virulencia que permiten su persistencia y distribución en el huésped (Marqués et al., 2013).
Por otra parte Staphylococcus aureus, descrito por el médico Alexander Ogston en 1880 (Cervantes-García et al., 2014), el cual en la actualidad es considerado como uno de los principales agentes causantes de mastitis a nivel mundial (El-Sayed, 2006b), con una frecuencia de casi el 30% de muestras de vacas con mastitis (Calderón y Rodríguez, 2008). A este patógeno se le atribuyen propiedades invasivas y factores extracelulares como la producción de toxinas que conducen al síndrome de shock tóxico, toxinas exfoliativas y enterotoxinas estafilocócicas (Vasconcelos and Ribeiro de Souza, 2010). Adicionalmente, posee una gran capacidad de adquirir elementos exógenos por transferencia horizontal, lo que le permite adaptarse fácilmente al medio y a los agentes antimicrobianos, mediante la adquisición de factores de resistencia a antibióticos codificados por plásmidos y transposones (Baba et al., 2002).
La tipificación molecular de microorganismos (genotipificación) es muy importante para conocer la evolución de los patógenos y estudiar su relación genética; de esta manera se logra un mayor entendimiento durante las investigaciones epidemiológicas (Amr El-Sayed, et al., 2017; Castañeda et al., 2018, García et al., 2019). Existe una variedad de métodos de genotipificación, cada técnica presenta fortalezas y debilidades. Entre los más destacados se encuentran la electroforesis de campos pulsados (PFGE), tipificación del gen spa, tipificación de secuencias de locus múltiple (MLST), el análisis de perfil de plásmido, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), análisis (MLVA), y el análisis de toda la secuencia del genoma ADN (Struelens et al, 2009; Kuroda et al., 2001).
La electroforesis de campos pulsados (PFGE), es una poderosa técnica de genotipificación utilizada para separar grandes moléculas de ADN (ADN genómico completo), después de una macrorestricción (corte con una enzima de restricción en varios puntos del genoma) y la separación de fragmentos mediante la aplicación de un campo eléctrico; siendo esta técnica una buena representación de todo el cromosoma bacteriano, porque proporciona fragmentos de ADN claramente diferenciados (Sharma-Kuinkel et al., 2016). Una de las fortalezas de la técnica es que presenta un alto poder discriminatorio (Struelens et al, 2009). Castañeda et al., (2011) mostró una estrecha relación de cepas de campo de S. aureus, responsables de mastitis en el occidente de México; sugiriendo que clones estrechamente relacionados de S. aureus son los responsables de la mayoría de las infecciones intramamarias, provocadas en el estado de Jalisco (Castañeda et al., 2018) . Marqués et al., (2013) observaron en Brasil una marcada diversidad de clones de S. aureus, detectando seis perfiles genéticos distintos mediante la electroforesis de campos pulsados (PFGE). (Kuroda et al., 2001;Sato et al.,2017) encontraron variaciones genéticas de hasta 30% de 41 cepas de S. aureus, aisladas en Japón de vacas con mastitis, humanos y en carne destinada a la venta. (Can et al., 2017), obtuvieron una variación de alrededor del 25% de la totalidad de muestras obtenidas de muestras de carne, leche cruda, queso, carne y pollo en Turquía. Las cepas obtenidas de leche de vaca cruda presentaron una similitud del 90%.
Sólo una investigación exhaustiva nos ayudará a comprender la epidemiología del patógeno S. aureus, y puede ayudar a controlar la enfermedad y/o producir una vacuna, minimizando su amenaza. Para este propósito, varias herramientas de biología molecular han sido desarrolladas para su uso en estudios epidemiológicos moleculares avanzados, como las utilizadas en la presente investigación de S. aureus.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestreo.
Se realizó un estudio transversal con un muestreo aleatorio en 27 establos pertenecientes a los 10 municipios: Acatic, Arandas, Atotonilco el Alto, Encarnación de Díaz, la Barca, Lagos de Moreno, Tepatitlán de Morelos, San Juan de los Lagos, San Miguel el Alto y Tototlán, considerados los mayores productores de leche del estado de Jalisco, México.
El número de animales muestreados fue proporcional a la población de vacas de cada municipio, en una relación de 1 a 900 aproximadamente. El tamaño de los establos se clasificó por el número de vacas en producción, que al momento del muestreo presentaba cada establo, y con base a esto se determinó el número de vacas a muestrear en cada uno (tabla 1). El número total de vacas a muestrear se determinó con la fórmula empleada para poblaciones infinitas o muy grandes (Gamboa, 2017), dando como resultado 335 vacas.
Tabla 1 Clasificación de establos por su tamaño (número de vacas en producción)
| Tamaño del establo | No. De Vacas en producción | No. de Vacas a muestrear |
| Chico | ≤ 25 | ≤ 11 |
| Mediano | 26 a 99 | 12 a 15 |
| Grande | ≥ 100 | 16 a 20 |
Detección de mastitis. Se utilizó la prueba de California como prueba de campo para la determinación de la frecuencia de mastitis subclínica; se realizó antes del ordeño del animal, después de eliminarse los primeros chorros de leche; tomándose una muestra aproximada de 2 mL y aplicando una cantidad similar del reactivo de California Mastitis Test (CMT), por sus siglas en inglés; siguiendo el procedimiento propuesto por (Barnum y Newbould, 1961), después de unos movimientos circulares de la mezcla se procedió inmediatamente a su interpretación.
El cultivo bacteriológico, las pruebas bioquímicas, la técnica de PCR; así como la electroforesis de campos pulsados se realizaron en el laboratorio de mastitis y biología molecular del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara, el cual se encuentra ubicado en el municipio de Zapopan del estado de Jalisco. Las 1,325 muestras de leche se cultivaron en cajas de Petri, con contenido de agar sangre adicionado con sangre de borrego al 5%, inoculando alrededor de 0.01 mL de leche por cada muestra.
Identificación presuntiva de S. aureus. Se empezó con la identificación mediante la observación de las características propias de la colonia (presencia y tipo de hemolisis, color y textura). Después se procedió a realizar las siguientes 3 pruebas bioquímicas: Prueba de coagulasa en tubo (Sperber y Tatini., 1975), prueba de sal manitol (Cervantes-García et al., 2014) y prueba de DNasa (Menzies, 1977).
Identificación molecular de S. aureus. Se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya que permite la identificación de patógenos proporcionando una alta sensibilidad y especificidad, siendo la prueba estándar de oro para la identificación de especies (El-Sayed et al., 2017).
Extracción del ADN. Se realizó el método de extracción con lisoestafina propuesto por Chapaval et al., (2008), con algunas modificaciones. De los cultivos de S. aureus sembrados en agar sangre de 18 -24 horas en incubación, se tomaron 2 asadas y se depositaron en 200 µL de una solución de TE (10 mM Tris -1 mM EDTA), pH 8. Posteriormente se añadió 2 µL de lisoestafina (1 mg/mL) y se incubó por 2 horas a 37 °C, se le añadieron 200 µL de la mezcla fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25-24-1), se agitó a velocidad alta (3,000 rpm) en vortex por 3 segundos y se metió a centrifugar a 12,000 rpm por 10 minutos; se pasó 150 µL del sobrenadante a otro tubo y se le añadió 60 µL de NaCl 5 M y 300 µL de etanol al 96% y se metió a -20 °C por 2 h para precipitar el ADN. Posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm. por 15 min y se descartó el sobrenadante, teniendo cuidado de no descartar el pellet formado. Después se añadió 200 µL de etanol al 70% y se centrifugó a 12,000 rpm por 10 minutos, descartando el etanol. Se mantuvieron los tubos abiertos frente al mechero por 30 min para que evaporaran los restos de etanol. Por último, se colocaron 50 µL de TE, pH 8.
Primers y Programa de PCR.
Se utilizaron los siguientes primers para la amplificación del gen 23 rDNA
Secuencia 5’ (ACG GAG TTA CAA AGG ACG AC) Secuencia 3’ (AGC TCA GCC TTA ACG AGT AC)
Y para la amplificación del gen se utilizó el siguiente programa:
Etapa 1 (1 ciclo): paso 1. Desnaturalización (94 °C por 5 min)
Etapa 2 (37 ciclos): paso 1. Desnaturalización (94 °C por 40 s)
Paso 2. Alineamiento (58 °C por 60 s)
Paso 3. Extensión (72 °C por 75 s)
Etapa 3 (1 ciclo): paso 1. Extensión (72 °C por 5 min) (El-Sayed et al., 2006b).
Electroforesis. Para la electroforesis se usó un gel de agarosa al 1%, el cual se corrió a 70 v por 40 min, utilizando el buffer TBE 1x (89 mM Tris -89 mM Borato -2 mM E.D.T.A), pH 8.
Determinación de la variación genética. Se utilizó la técnica de electroforesis de campos pulsados (PFGE), por sus siglas en inglés, misma técnica utilizada por Sato et al., (2017), para la determinación de la variabilidad genética de S. aureus. Solo las cepas diagnosticadas positivas a S. aureus, mediante PCR fueron consideradas para la determinación de la variación genética. En total se seleccionaron 32 cepas de S. aureus.
Se elaboró la técnica utilizada por Castañeda et al., (2011), con algunas modificaciones. Se inocularon las cepas en placas de agar sangre y se incubaron a 37 °C durante 18 horas. De cada cepa bacteriana se tomó una azada del cultivo y se suspendió en 200 µL de la solución PIV (0,01 mM Tris, 1M NaCl) pH 8, y se ajustó a una densidad óptica de 1.5 con un nivel de absorbancia de 610 nm. De esta solución se tomaron 60 µL de cada muestra y se mezclaron con 60 µL de agarosa al 1% (disuelta en TE), conservada a una temperatura de 45 °C. Posteriormente se pasaron a un compartimento del molde para bloques y se esperaron unos 15 minutos a que solidificaran. Los bloques se pasaron a un tubo de 1.5 mL que contenía: 0.5 mL de la solución de lisis (6 mM Tris -1 M NaCl 100 mM E.D.T.A -0.2% desoxicolato sódico -0.5% sarcosyl), 25 µL de brij 58 (al 10%), 5 µL de lisozima (50 mg/mL), y 5 µL de lisoestafina (1 mg/mL); se mezcló y se incubaron a 37°C durante 21 horas. Se decantó la solución y se sustituyó por 0.5 mL de la solución ES (500 mM E.D.T.A -1% sarcosyl) y se agregaron 25 µL de proteinasa K (20 mg/mL). Se incubaron a 56 °C durante 21 h. Se decantó la solución ES y los bloques se lavaron 5 veces, agitándose de manera suave por 20 min con 10 mL de TE (10 mM Tris -1 mM EDTA) por cada lavado. Se cortó una rebanada de 3 mm de cada bloque.
Para la digestión se agregaron 100 µL de la solución para restricción: agua 87.75 µL, buffer (10x) 10 µL, enzima Sma1 1.25 µL (12.5 U por muestra) y albúmina de suero de bovino (BSA) 1 µL. Se dejó incubar 3 horas a 25 °C. Posteriormente las rebanadas se colocaron en el interior de un gel de agarosa al 1% en TBE 0.5x pH 8. Se realizó la electroforesis en 7 L 0.5x TBE pH 8 en el aparato Chef-DR II (Bio-Rad).
El programa utilizado fue: Voltaje 6 V / cm, temperatura 14 °C; tiempo inicial 5 s; tiempo final 40 s; y duración 21 h. Posteriormente, el gel se tiñó y se capturó la imagen en un fotodocumentador.
La determinación de la variación genética se realizó analizando las imágenes de los geles, obtenidos mediante la técnica PFGE, a partir de dendrogramas para la determinación del parentesco, con la ayuda del software Bionumerics® (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Se utilizó el coeficiente de correlación de Dice y el algoritmo de agrupación de promedio matemático del grupo de pares no ponderado (UPGMA). Se elaboró un dendrograma de similitud del total de las muestras y otros 3 dendrogramas (uno por cada región muestreada). Los porcentajes de similitud genética se pudieron obtener con la elaboración de los dendrogramas.
RESULTADOS
Frecuencia de mastitis. De las 1,340 glándulas mamarias correspondientes a las 335 vacas muestreadas, se obtuvieron los siguientes resultados. Analizando 1,325 glándulas mamarias funcionales y 15 glándulas ciegas (no funcionales), se observó una frecuencia del 42.71% de mastitis, de la cual la mastitis clínica representó el 2.26% y de la mastitis subclínica el 40.45%.
Frecuencia de agentes etiológicos. De las 1,325 muestras recolectadas de leche se obtuvo un crecimiento positivo de S. aureus en 130 muestras (correspondientes al 9% del total) y un crecimiento de 261 de estafilococos coagulasa negativo (18% del total). Por lo que refleja la importancia del género Staphylococcus spp, ya que representó un crecimiento del 27% del total de las muestras.
Variación genética de S. aureus mediante la técnica de electroforesis de campos pulsados (PFGE). Se obtuvieron los siguientes perfiles genéticos (pulsotipos) de 32 cepas de S. aureus representativas aisladas de establos mediante la técnica de PFGE (figura 1).
Figura 1 Electroforesis de campos pulsados del ADN (después de la digestión con la enzima de restricción sma1) de las 32 cepas de S. aureus aisladas de vacas lecheras del estado de Jalisco. Donde M= Marcador de peso molecular de 48.5kb a 1,018kb (New England Biolabs), Ref= Cepa de referencia S. aureus (ATCC 25923) y número del 1 al 38= al total de cepas aisladas (32).
Se elaboraron dendrogramas para la determinación de la variación genética de S. aureus. Los 32 pulsotipos de las cepas estudiadas se agruparon en 12 diferentes agrupaciones de pulsotipos, con un 95% o más de similitud genética dentro de cada grupo de pulsotipos.
Se obtuvo un porcentaje de similitud genética del 85.1%, lo que corresponde al 14.9% de variación genética de los 32 pulsotipos de cepas aisladas, de los 10 municipios muestreados del estado de Jalisco. La agrupación de pulso tipos (p3), fue el mayormente encontrado agrupando al 25% (8/32) del total de los pulsotipos de las cepas analizadas (figura 2).
Figura 2 Dendrograma de los pulsotipos de las 32 cepas de S. aureus aisladas en diferentes regiones del estado de Jalisco
En el dendrograma de los pulsotipos de las cepas aisladas de la región Altos Norte, se observó un 84.9% de similitud genética, lo que corresponde a el 15.1% de variación genética de las 14 cepas aisladas de los municipios de Encarnación de Díaz, Lagos de Moreno y San Juan de los Lagos (figura 3).
Figura 3 Dendrograma de los pulsotipos de 14 cepas de S. aureus aisladas en la región Altos Norte del estado de Jalisco
En el dendrograma de los pulsotipos de las cepas aisladas de la región Altos Sur, se observó un 89.8% de similitud genética, lo que corresponde a el 10.2% de variación genética de las 8 cepas aisladas de los municipios de Acatic, Arandas, San Miguel el alto y Tepatitlán de Morelos (figura 4).
Figura 4 Dendrograma de los pulsotipos de 8 cepas de S. aureus aisladas en la región Altos Sur del estado de Jalisco
En el dendrograma de los pulsotipos de las cepas aisladas de la región Ciénega, se observó un porcentaje del 90.2% de similitud genética, lo que corresponde a el 9.8% de variación genética de las 10 cepas aisladas de los municipios de Atotonilco el Alto, la Barca y Tototlán (figura 5).
Figura 5 Dendrograma de los pulsotipos de 10 cepas de S. aureus aisladas en la región Ciénega del estado de Jalisco
Dentro de la relación de las características morfológicas de las cepas estudiadas con su perfil genético (pulsotipo) en la técnica de la variación genética, se pudo observar que las cepas de S. aureus que resultaron idénticas en la técnica de PFGE (similitud del 100%) presentaron características morfológicas idénticas. Mientras que la cepa (38. 27, 6 DD) resaltó de todas las demás en su cultivo, ya que mostró una pronunciada hemolisis beta de 15 mm; de igual forma fue la cepa que presentó el pulsotipo con la mayor variación genética en la técnica de PFGE.
DISCUSIÓN
A partir de los hallazgos encontrados se establece que se encuentran variaciones genéticas mayores a un 10% de Staphylococcus aureus aislados de vacas lecheras del estado de Jalisco, encontrándose el 14.9% de variación genética entre las 32 cepas analizadas en este estudio. Los resultados relacionados con la variación genética observados en el presente trabajo son similares a los citados por Can et al., (2017), quienes encontraron una relación genética del 90% de cepas aisladas de leche cruda de vaca en Turquía, lo que corresponde al 10% de variación genética. En ese mismo estudio se analizaron en conjunto las cepas de S. aureus obtenidas de muestras de leche cruda de vaca, muestras de carne, queso y pollo en Turquía; en donde la variación genética aumentó hasta un 25%, lo que supone que existen tipos de perfiles genéticos similares genéticamente en las muestras de leche; quizás debido a que los S. aureus aislados de leche presentan un genotipo relativamente similar, ya que requieren de las mismas características que les permita estar adaptados, tanto dentro como fuera de la glándula mamaria.
Los resultados mostrados en este estudio son similares a los resultados realizados por Castañeda et al., (2011), quienes concluyeron que existe una estrecha rel ación genética de S. aureus, responsables de mastitis; sugiriendo que clones estrechamente relacionados de S. aureus, son los responsables de la mayoría de las infecciones intramamarias provocadas en el estado de Jalisco. Sin embargo difieren de los resultados generados con los obtenidos por Sato et al., (2017), quienes encontraron variaciones genéticas de hasta el 30% de 41 cepas de S. aureus aisladas en Japón; tal vez debido a que se tomarán además cepas aisladas de humanos y de carne destinada a la venta; por lo que parece comprensible el alto porcentaje de variación mostrado, ya que las cepas suelen desarrollar características elementales que le permiten adaptarse a las condiciones del sitio de donde son aisladas.
Aunque en la frecuencia de mastitis se obtuvo un porcentaje alto (42.71%) en las vacas muestreadas, sólo alrededor del 20% de las glándulas mamarias muestreadas representó a la mastitis clínica y a los grados 2 y 3 de la mastitis subclínica; por lo que alrededor del 80% de las glándulas se identificaron como negativo a mastitis y a mastitis subclínica grado 1. Por otra parte en un estudio realizado por Manjarrez et al., 2012, encontró una frecuencia mayor de mastitis en el estado de México; quienes citan un 6.1% de mastitis clínica y un 48.3% de mastitis subclínica, siendo esto comprensible ya que se muestrearon sólo establos pequeños de tipo familiar, que presentaban poco nivel de tecnificación; lo que representa deficiencias en la técnica de ordeño y poco control de la mastitis, defiriendo del muestreo de nuestro estudio en el cual se eligieron además de establos familiares, establos semitecnificados y tecnificados; por lo que resultó menor la frecuencia de mastitis obtenida en nuestro estudio.
Por otro lado Yera y Ramírez, 2016, registraron una frecuencia de aparición de S. aureus del 8.75% en vacas mestizas Holstein x Cebú, frecuencia menor a la obtenida que fue del 9.8%; quizás por una mejor resistencia a la infección de los animales muestreados al ser animales híbridos. Boscán et al., (2009), observó una frecuencia de aparición de S. aureus del 12.15%, mayor a la presentada en este estudio, difiriendo además de la metodología de muestreo, ya que se tomaron muestras de leche sólo en vacas diagnosticadas con mastitis subclínica y que se encontraban en el inicio del periodo seco. Castañeda et al., (2013), en el estado de Jalisco, mostró una frecuencia de S. aureus a nivel de establo del 100%, siendo la frecuencia más elevada a la mostrada, que fue del 66.7%; probablemente debido a que en ese estudio sólo se sembró leche perteneciente de glándulas diagnosticadas con mastitis; caso contrario a nuestro estudio, el cual se sembraron todas las muestras de leche sin importar su resultado en el diagnóstico de mastitis.
CONCLUSIONES
La agrupación de pulsotipos P3 de S. aureus representó el 25% del total de los perfiles genéticos (pulsotipos) de las cepas aisladas (8/32), estando presente en todas las regiones que se muestrearon de Jalisco. La variación genética comparada con la variación morfológica resultó idéntica. Asimismo, las cepas aisladas dentro de un mismo establo presentaron una notable similitud genética, llegando al 100% de similitud en varios establos. Los resultados del presente estudio aportan información valiosa que puede ser complementaria en el área de la epidemiología molecular necesaria para el control, tratamiento y para la producción de vacunas necesarias para la mastitis causada por S. aureus.
