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INTRODUCCIÓN
La disminución en las poblaciones de anfibios los han llevado en casos severos a la extinción, las principales causas son la contaminación o modificación de su hábitat, la introducción de especies exóticas invasoras y enfermedades (Catenazzi, 2015; Jiménez et al., 2017; Tietje y Rödel, 2018). Actualmente, La Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN, 2020), indican que más del 85% de las especies de anfibios de México se encuentran en alguna categoría de riesgo, debido a esta situación, la mayoría de las especies del género Ambystoma en vida silvestre, actualmente se ha optado por reproducirlos en condiciones de laboratorio (Mendoza, 2012; Khattak et al., 2014; Jiménez et al., 2017). De manera específica el Ambystoma mexicanum, está incluido en la NOM-059-SEMARNAT-2010 como especie en peligro de extinción (NOM-059-ECOL, 2010).
La reproducción ex situ utilizando semen criopreservado, es una herramienta de reproducción asistida en cautiverio que puede contribuir a la conservación del Ambystoma mexicanum; además de contribuir a incrementar su variabilidad genética, debido a que en la mayoría de los casos la amenaza se encuentra en su propio hábitat (Clulow et al., 2014; Jiménez et al., 2017). Sin embargo, antes de implementar un protocolo de criopreservación espermática, es necesario conocer la biología reproductiva y las características espermáticas de la especie, para lograr un mayor éxito (Chester, 2013; Silla y Byrne, 2019).
Actualmente, las técnicas de obtención de gametos (espermatozoides y óvulos) que se realizan en anfibios son altamente invasivas, pues la mayoría de los procesos requieren del sacrificio del ejemplar para la extracción de los testículos o conductos eferentes y proceder a macerarlos (Chester, 2013; Shishova et al., 2011). La mayoría de los protocolos de criopreservación utilizados en espermatozoides de diferentes especies, de anfibios, han sido extrapolados de los reportados en de peces (Comizzoli et al., 2012); mostrando resultados variables entre cada uno. Chester (2013) criopreservó espermatóforos completos de A mexicanum utilizando sucrosa como principal crioprotector, reportando 84 % de espermatozoides vivos después de ser descongelados; sin embargo, no reporta el parámetro de espermatozoides vivos antes de su congelación. Se sabe que la manipulación in vitro de los espermatozoides ocasiona alteraciones en su membrana plasmática, en la cual se ha descrito la presencia de carbohidratos membranales, los cuales tienen una función en el reconocimiento entre gametos para lograr la fertilización (Peláez et al., 2011).
Debido a que es limitada la base de datos sobre estudios morfológicos y de criopreservación en espermatozoides de anfibios, en específico del orden Urodelo (Browne y Chester, 2011; Chester, 2013; Sunny et al., 2014).
El objetivo de esta investigación fue identificar los parámetros de evaluación básica y características membranales en espermatozoides provenientes de diferentes ejemplares y espermatóforos de cada uno, para evaluar un protocolo de criopreservación que permita mantener su capacidad fertilizante post descongelación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cuidado y bienestar
El manejo de los ajolotes se llevó a cabo en las instalaciones del Centro de Investigaciones Biológicas y Acuícolas de Cuemanco (CIBAC-UAMX), con apego al Plan de Manejo, autorizado por la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT) a la Unidad de Para el Manejo y Conservación de la Vida Silvestre (UMA) CIBAC, con registro DGVS-CR-IN 0952-D.F./07/UMA CIBAC.
Alojamiento y obtención de espermatóforos
Los ajolotes fueron alojados para su monitoreo durante un año de manera individual en contenedores de 60 L, a una temperatura de 18°C, con un fotoperiodo de 12 h luz y 12 h de obscuridad. Para estimular la liberación de espermatóforos, los machos se trasladaron a un contenedor de cristal con capacidad de 700 L de agua, el cual se acondicionó con suelo arenoso y plantas acuáticas; durante las horas de obscuridad, utilizando chiller de 0.25 HP (Ártica Resun CL-600), se redujo la temperatura del agua; de igual manera para todos los ejemplares de 18 °C a 14°C, introduciendo 3 hembras por macho. Los espermatóforos fueron recuperados del fondo del contenedor, al inicio de las siguientes 12 horas de luz.
Manejo de espermatóforos y obtención de espermatozoides
Los espermatóforos liberados por cada ejemplar fueron recolectados a 5 °C en 2 ml de medio Simplified Amphibian Ringer (SAR), compuesto por NaCl 113 mM, CaCl 1mM, KCl 2.0 mM y NaHCO 3.6 mM, con 220 mOsmol kg-1. Los espermatozoides se obtuvieron colocando los espermatóforos de cada ejemplar en una caja NuncMR de 4 pozos con 0.5 ml de medio SAR; en el primer pozo se lavaron para eliminar residuos de materia orgánica; en el segundo pozo se retiró el material gelatinoso (glucoproteínas) para obtener el capuchón que contiene los espermatozoides; en el tercer pozo se utilizó 0.5 ml de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 20%, para reblandecer el capuchón por 10 min (Taku et al., 2004); en el cuarto pozo con 0.5 ml de medio SAR, los espermatozoides se extrajeron por maceración del capuchón. Mediante aspiración se extrajeron los espermatozoides del sobrenadante, enseguida se filtraron con una malla de 30 µm y se recuperó el total de espermatozoides de los espermatóforos de cada liberación en un tubo Eppendorf con 500 µl de medio SAR a 5°C, para realizar un pool espermático de cada liberación.
Criopreservación espermática
Cada pool espermático, conservado a 5°C, se ajustó con 6% de Dimetilacetamida (DMA), enseguida se llenaron pajillas de 0.25 ml, para mantener en equilibrio por 10 min a 2°C, luego se colocaron a 5 cm sobre vapor de nitrógeno a -76 °C por 15 minutos y posteriormente se sumergieron en nitrógeno líquido a -196°C, para ser criopreservados por 30 días hasta su posterior descongelación a 15 °C por 5 min (Atencio et al., 2013).
Evaluación espermática básica
El porcentaje de espermatozoides vivos, se determinó a través de un frotis que se realizó con una mezcla 1:5 espermatozoides con tinción de eosina-nigrosina, en la cual se contaron 100 espermatozoides bajo el microscopio a 40X; Se consideraron espermatozoides vivos, los no teñidos y muertos, los que presentaron tinción. La morfología espermática fue evaluada en la misma tinción, para determinar porcentajes de espermatozoides con alteraciones morfológicas en las regiones de la cabeza, cuello o flagelo (Tanisław et al., 2017).
Distribución de carbohidratos membranales
Con el uso de las lectinas de Triticum vulgaris aglutinina (WGA), con afinidad a residuos de N-Acetilglucosamina y de Arachis hypogaea (PNA) con afinidad a β-galactosa, aconjugadas a isotiocianato de fluoresceína (FICT), se pretendió determinar la presencia de los carbohidratos que se ha reportado son receptores para el reconocimiento entre los gametos (Herrera et al., 2017) y como partes estructurales del plasmalema espermático (Miller, 2015 ). En un volumen final de 40 µl de medio SAR, con 5x106 espermatozoides, se adicionó 10µl de WGA-FICT o PNA-FITC a una concentración de 15 mg/ml; se incubaron a 25ºC por 30 minutos, estos espermatozoides cubriéndolos de la luz; enseguida se realizaron preparaciones sobre porta objetos, para observarlas al microscopio. Cada preparación se observó directamente en un microscopio de fluorescencia a 260 nm de excitación y >560 nm emisión, contabilizando 100 espermatozoides. Se determinó la presencia de los carbohidratos membranales, mediante patrones de fluorescencia y la proporción de espermatozoides con cada patrón determinado (Naofumi, 2015).
Análisis estadístico
Se determinó la frecuencia de espermatozoides vivos, con morfología normal y con los diferentes patrones de fluorescencia en las muestras frescas y descongeladas, las cuales fueron expresadas como proporción con su respectivo error estándar (EE). Las diferentes variables fueron comparadas entre los grupos de espermatozoides en fresco y descongeladas con una prueba de Xi2, con un una alfa de 0.05; utilizando el paquete estadístico de libre acceso EpiInfo 7.3
RESULTADOS
Se determinó diferente cantidad de eventos reproductivos y número de espermatóforos liberados por cada ejemplar; se obtuvieron un total de 61 espermatóforos. La frecuencia en la cantidad de espermatóforos liberados por ejemplar, fue la siguiente: 1:12, 2:10, 1:8, 1:6, 3:4 y 1:3. La concentración espermática tuvo un promedio de 2.6 ± 0.6 X104 espermatozoides/ ml, con un rango entre 1.0 ± 2.5 a 4.0 ± 3.0. La concentración espermática en liberaciones con seis o más espermatóforos (2.5X104 espermatozoides/ml), fue mayor (P<0.05) a la concentración de espermatozoides (2.5X104 espermatozoides/ml) en liberaciones con menos de seis espermatóforos.
Parámetros de evaluación espermática
Los porcentajes de espermatozoides vivos disminuyeron (P<0.05), aproximadamente 30% en post descongelación; encontrando promedios de 89 % en espermatozoides en fresco y del 58 % post descongelación. Los porcentajes de espermatozoides vivos que se determinaron en liberaciones con diferente número de espermatóforos, mostró diferencias (P<0.05), encontrando un rango de 79% al 100 % en espermatozoides en fresco y del 45 % al 67 %, en espermatozoides descongelados (tabla 1).
Tabla 1 Parámetros de evaluación espermática en fresco y post descongelación de A. mexicanum, en eyaculados de cada ejemplar evaluado
| ID | Espermatóforos n= | % Espermatozoides con Patrón A ± EE | % Espermatozoides con Patrón B ± EE | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fresco | Descongelado | Xi2 p | Fresco | Descongelado | Xi2 p | ||
| A | 12 | 46 ± 3 | 51 ± 7 | 0.3 >0.05 | 54 ± 3 | 50 ± 7 | 0.1>0.05 |
| B | 10 | 44 ± 3 | 46 ± 3 | 0.02>0.05 | 48 ± 4 | 53 ± 3 | 0.3>0.05 |
| C | 10 | 52 ± 4 | 56 ± 6 | 0.2>0.05 | 47 ± 4 | 43 ± 6 | 0.2>0.05 |
| D | 8 | 56 ± 5 | 55 ± 8 | 0.01>0.05 | 46 ± 5 | 46 ± 8 | 1.0>0.05 |
| E | 6 | 52 ± 3.5 | 57 ± 9 | 0.3>0.05 | 47 ± 3 | 43 ± 9 | 0.2>0.05 |
| F | 4 | 49 ± 7.7 | 57 ± 7 | 0.9>0.05 | 61 ± 4 | 42 ± 7 | 6.5<0.05 |
| G | 4 | 41 ± 4.2 | 55 ± 6 | 3.9<0.05 | 59 ± 4 a | 45 ± 6 | 3.9<0.05 |
| H | 4 | 45 ± 7.3 | 56 ± 6 | 2<0.05 | 55 ± 7 | 44 ± 6 | 2.0>0.05 |
| I | 3 | 45 ± 2.8 | 55 ± 5 | 1.6<0.05 | 65 ± 3 | 45 ± 5 | 7.3<0.05 |
La morfología espermática normal de igual manera mostró una reducción (P<0.05) de aproximadamente el 15 %, encontrando porcentajes del 98 % en morfología normal de espermatozoides en fresco y del 83 % post descongelación. Los porcentajes de espermatozoides con morfología normal que se determinaron en liberaciones con diferente número de espermatóforos, no mostró diferencias (P>0.05), encontrando un rango promedio de 95% al 100% en espermatozoides en fresco; sin embargo, determinados post descongelación fue diferente (P<0.5), con porcentajes con rango promedio entre 78% al 90% (tabla 1).
Presencia y distribución de carbohidratos membranales
Con el uso de la lectina WGA-FITC: En espermatozoides en fresco y post descongelación, la intensidad de la fluorescencia que emitió la lectina WGA-FITC sobre la membrana del espermatozoide, evidenció la presencia de residuos de N-Acetil glucosamina presentes en la membrana espermática de A mexicanum. Se determinaron dos patrones de fluorescencia denominados: Patrón A) Con fluorescencia intensa homogénea en la región del flagelo y cuello y con menor intensidad, pero evidente en la región de la cabeza (figura 1A); y patrón B), con fluorescencia evidente homogénea en toda la estructura espermática (figura 1B).
Figura. 1 Patrones de fluorescencia de espermatozoide con la lectina WGA-FITC. 1A). Se observa mayor intensidad de fluorescencia en las regiones del flagelo y cuellos y con menor intensidad en la cabeza. 1B se observa con intensidad homogénea en toda la estructura espermática
Literal diferente en súper índice (a,b,c), indica diferencia (P<0.05) al comparar la misma variable entre columnas (Fresco VS Descongelado). Número diferente en súper índice (1,2,3), indica diferencia (P<0.05) al comparar los promedios en la misma columna
La proporción de patrones determinados con WGA-FITC (tabla 2), mostraron que:
Tabla 2 Porcentajes de espermatozoides en fresco y post descongelación, con dos patrones de fluorescencia A y B determinados con el uso de la lectina WGA-FITC
| ID | Espermatóforos n= | % Espermatozoides con Patrón A ± EE | % Espermatozoides con Patrón B ± EE | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fresco | Descongelado | Xi2 p | Fresco | Descongelado | Xi2 p | ||
| A | 12 | 46 ± 3 | 51 ± 7 | 0.3 >0.05 | 54 ± 3 | 50 ± 7 | 0.1 >0.05 |
| B | 10 | 44 ± 3 | 46 ± 3 | 0.02>0.05 | 48 ± 4 | 53 ± 3 | 0.3>0.05 |
| C | 10 | 52 ± 4 | 56 ± 6 | 0.2>0.05 | 47 ± 4 | 43 ± 6 | 0.2>0.05 |
| D | 8 | 56 ± 5 | 55 ± 8 | 0.01>0.05 | 46 ± 5 | 46 ± 8 | 1.0>0.05 |
| E | 6 | 52 ± 3.5 | 57 ± 9 | 0.3>0.05 | 47 ± 3 | 43 ± 9 | 0.2>0.05 |
| F | 4 | 49 ± 7.7 | 57 ± 7 | 0.9>0.05 | 61 ± 4 | 42 ± 7 | 6.5<0.05 |
| G | 4 | 41 ± 4.2 | 55 ± 6 | 3.9<0.05 | 59 ± 4 a | 45 ± 6 | 3.9<0.05 |
| H | 4 | 45 ± 7.3 | 56 ± 6 | 2<0.05 | 55 ± 7 | 44 ± 6 | 2.0>0.05 |
| I | 3 | 45 ± 2.8 | 55 ± 5 | 1.6<0.05 | 65 ± 3 | 45 ± 5 | 7.3<0.05 |
Literal diferente en súper índice (a,b,c), indica diferencia (P<0.05) al comparar la misma variable entre columnas (Fresco vs Descongelado).
El porcentaje de espermatozoides con patrón A, procedentes de liberaciones de doce a seis espermatóforos, fueron similares (P>0.05) en fresco y post descongelación; en comparación con los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones entre ocho y tres espermatóforos, en los que se incrementó (P<0.05), en espermatozoides descongelados. Al comparar los porcentajes de espermatozoides con patrón A, obtenidos en espermatozoides de cada ejemplar en fresco, se determinó en promedio 48%, con rango entre 44% a 56%; sin encontrar diferencia (P<0.05) entre éstos, en espermatozoides descongelados; se determinó un promedio de 54% con rango entre 46% a 57%, encontrando porcentajes mayores (P>0.05), en espermatozoides con el patrón A, procedentes de liberaciones con 3 y 4 espermatóforos.
Los porcentajes de espermatozoides con patrón B, procedentes de liberaciones de doce a seis espermatóforos fueron similares (P>0.05) en fresco y post descongelación; los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones con cuatro y tres espermatóforos, fueron mayores (P<0.05) en fresco, comparados con los descongelados. En fresco se determinó en promedio 53%, con rango entre 46 a 65%, sin encontrar diferencia (P<0.05) entre éstos; en espermatozoides descongelados, se determinó un promedio de 46 % con rango entre 42% a 53%, encontrando porcentajes mayores (P>0.05) en espermatozoides procedentes de liberaciones con 10 y 12 espermatóforos. Al realizar la comparación general total (Pool) de los porcentajes, fue evidente una diferencia y de manera inversa el por porcentajes totales determinados, los cuales fueron para espermatozoides con el Patrón A: Xi 2 de 7.21 p<0.05, en semen fresco con 47.7 % y de 54.3 % para semen descongelado; con respecto a espermatozoides con el Patrón B: se determinó una Xi 2 de 10.8 p<0.05, en semen fresco con 53.5 % y de 45.6 % en semen descongelado.
Con el uso de la lectina PNA-FITC: en espermatozoides en fresco y post descongelación, la intensidad de la fluorescencia que emitió la lectina PNA-FITC sobre la membrana del espermatozoide, lo que evidenció la presencia de residuos glicosídicos de β-galactosa, presentes en la membrana del espermatozoide de A mexicanum. Se determinaron dos patrones de fluorescencia: C) Con fluorescencia intensa y homogénea a lo largo de toda la estructura espermática (figura 2A); patrón D) Con fluorescencia tenue homogénea en toda la estructura espermática (figura 2B).
Figura 2 Patrones de fluorescencia obtenidos con lectina PNA-FITC: A) Con fluorescencia intensa homogénea, B) Con fluorescencia tenue homogénea
La proporción de patrones determinados con PNA-FITC, (tabla 3), mostró que:
Tabla 3 Porcentajes de espermatozoides en fresco y post descongelación, con dos patrones de fluorescencia C y D determinados con el uso de la lectina PNA-FITC
| ID | Espermatóforos n= | %±EE Espermatozoides con Patrón C | %±EE Espermatozoides con Patrón D | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fresco | Descongelado | Xi 2 p | Fresco | Descongelado | Xi 2 p | ||
| A | 12 | 51±4 | 47±5 | 0.2>0.05 | 49±4 | 53±5 | 0.2>0.05 |
| B | 10 | 51±5 | 49±5 | 0.02>0.05 | 49±5 | 50±5 | 0.01>0.05 |
| C | 10 | 53±5 | 52±6 | 0.01>0.05 | 48±7 | 47±6 | 0.01>0.05 |
| D | 8 | 49±4 | 66±3 | 5.23<0.05 | 51±5 | 24±6 | 14.4<0.05 |
| E | 6 | 57±4 | 60±7 | 0.08>0.05 | 47±7 | 40±11 | 0.7>0.05 |
| F | 4 | 55±7 | 62±4 | 0.07>0.05 | 45±10 | 37±4 | 1.01>0.05 |
| G | 4 | 55±4 | 68±6 | 0.7>0.05 | 55±6 | 44±7 | 2.0>0.05 |
| H | 4 | 57±3 | 69±4 | 2.6>0.05 | 52±6 | 42±6 | 1.62>0.05 |
| I | 3 | 58±5 | 67±5 | 1.36>0.05 | 42±8 | 43±9 | 0.01>0.05 |
Literales diferentes en súper índice (a,b,c), indica diferencia (P<0.05) al comparar la misma variable entre columnas (Fresco VS Descongelado).
Con los patrones C y D, los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones entre 6 a 12 espermatóforos fueron similares (P>0.05) en fresco y post descongelación, en comparación con los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones con tres y cuatro espermatóforos, que se incrementaron (P<0.05), en espermatozoides descongelados.
Los porcentajes de espertmatozoides con patrón C y D, determinados con la lectina PNA- FITC, únicamente mostraron diferencia (P<0.05) post descongelación, cuando los espermatoziodes provinieron de liberaciones con ocho espermatóforos, observando mayor porcentaje en espermatozoides con patrón C post descongelación y de manera inversa, en espermatozoides con el patrón D. El porcentaje fue mayor en semen fresco, en los porcentajes de espermatozoides provenientes de liberaciones con doce, diez, seis, cuatro o tres espermatóforos, Al comparar los porcentajes de espermatozoides con el Patrón C de cada ejemplar, en fresco con un promedio de 54%, con rango entre 49% a 58% y post descongelación con promedio de 60% y con rango entre 47% a 69%, no se encontraron diferencias (P<0.05).
Al comparar los porcentajes de espermatozoides con patrón D de cada ejemplar, en fresco con un promedio de 48%, con rango entre 42% a 55% no se observaron porcentajes diferentes (P<0.05). En espermatozoides descongelados se encontró en promedio de 42% con rango entre 24% a 53%, tampoco se observaron porcentajes diferencias (P<0.05).
DISCUSIÓN
En cuanto a la concentración espermática, los datos mostraron que existen diferencias entre espermatóforos de un mismo ejemplar y entre ejemplares. Estos resultados son similares a los publicados por Doyle et al. (2011), en el número de espermatozoides entre los espermatóforos liberados de ejemplares de A maculatum. La cantidad y el tamaño de los espermatóforos que pueden ser liberados varía ampliamente, relacionándose con la fisiología y adaptación reproductiva de cada especie (Browne et al., 2019); así como de tres características físicas: tamaño corporal, tamaño de los testículos o la edad (Uribe y Mejía-Roa, 2014), lo cual también fue observado en nuestro estudio. La viabilidad espermática observada en fresco fue de 80 a 98%, siendo este el primer trabajo que registra el porcentaje de espermatozoides vivos extraídos de los espermatóforos. Estos resultados se contraponen a los reportados por Mansour et al. (2011), quienes obtuvieron espermatozoides por medio de masaje cloacal, reportando un 100% de espermatozoides vivos en todas las muestras analizadas.
Por otra parte, un estudio realizado por Chester (2013), menciona que obtuvo de 64 a 86 % de viabilidad espermática después de llevar a cabo la criopreservación de espermatóforos. Estos datos difieren de lo obtenido en este trabajo, donde la viabilidad obtenida en espermatozoides descongelados estuvo en un promedio de 45 a 68 %, por lo que este resultado nos indica que la membrana del capuchón puede funcionar como una barrera, la cual protege a los espermatozoides de los cambios bruscos de la congelación (Chester, 2013; Hall et al., 2016).
La utilización de lectinas WGA-FITC y PNA-FITC mostró ser una alternativa para identificar la presencia y distribución de los residuos glucosídicos B-galactosa y Acetil- glucosamina. Estos resultados concuerdan con el trabajo realizado por Sáez et al., (2004), en donde se determinó que en el momento de la espermatogénesis diferentes carbohidratos entre ellos B- galactosa y acetilglucosamina se presentan en la membrana de las células que se encuentran en diferente etapa de desarrollo durante la espermiogénesis.
La presencia y distribución de los residuos glucosídicos, indica diferencias a lo largo de toda la membrana, lo cual se determinó con cada lectina, que cada una identificó al menos dos patrones de fluorescencia diferentes; los cuales pueden estar asociados a diferentes estados metabólicos de los espermatozoides que les permitan o no el reconocimiento entre gametos.
La presencia y distribución de los residuos glucosídicos permite caracterizar la membrana de los espermatozoides que se encuentren en diferente estado metabólico, asociados a la capacitación y reacción acrosomal, y por lo cual su capacidad fertilizante, (Browne et al., 2015). Lo anterior puede ser de utilidad en protocolos de reproducción asistida que involucren el manejo in vitro de los espermatozoides.
Utilizando la reproducción asistida en cautiverio, se contribuye a la conservación de la especie; además de disminuir la extracción de animales de su medio y venta ilegal (Jimenez et al., 2017); los cuales pueden tener un aprovechamiento sustentable destinando ejemplares a la conservación, investigación biomédica y conservación en colecciones públicas y privadas (Prieto et al., 2014), que es en estas últimas, en las cuales es donde se han reproducido los ejemplares fuera de su hábitat natural; sin embargo, la reproducción de anfibios y su cría en cautiverio es relativamente mínimo (Ananjeva et al., 2015).
CONCLUSIÓN
El protocolo de criopreservación utilizado demostró ser eficiente, manteniendo parámetros de viabilidad e integridad membranal, a pesar de encontrar diferencias espermáticas asociadas al número de espermatóforos presentes en cada liberación, por lo cual este estudio aporta herramientas y conocimientos para la reproducción asistida en cautiverio del Ambystoma mexicanum.
