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INTRODUCCIÓN
La brucelosis es la zoonosis bacteriana más extendida en todo el mundo (Corbel, 2006). Sin embargo, sigue siendo una de las enfermedades a las que menos se presta atención como posible causa de afecciones crónico-degenerativas (Hull y Schumaker, 2018). La Brucelosis canina fue descrita por Leeland Carmichael en 1966, tras aislar el agente Brucella canis de Beagles con problemas reproductivos (Cosford, 2018). Es la causa más común de fallo reproductivo en perros, (Hensel et al., 2018) afectando principalmente a perros domésticos y de refugio (Hubbard et al., 2018) en los que la fiebre se acompaña de epididimitis, prostatitis y fallo reproductivo, además de manifestaciones no reproductivas como linfadenitis, uveítis, endoftalmitis, dermatitis piogranulomatosa, meningoencefalitis y discoespondilitis (Cosford, 2018; Wanke, 2004). La detección se basa actualmente en el aislamiento del agente mediante cultivo bacteriano y seroaglutinación (Cosford, 2018). Sin embargo, el diagnóstico serológico es problemático en la identificación de casos crónicos, y el cultivo presenta un riesgo para el personal de laboratorio (Hull y Schumaker, 2018). Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos métodos para la detección de este microorganismo, y los métodos serológicos son ideales dada su facilidad de uso y fiabilidad demostrada (Cosford, 2018; Hull y Schumaker, 2018). Sin embargo, estos métodos requieren un buen control de calidad, por lo que deben ser validados antes de ser utilizados en el campo (Andreasson et al., 2015).
El objetivo de este estudio es establecer un método serológico (I - ELISA) para la detección de anticuerpos de Brucella canis en perros, utilizando como antígeno de captura la proteína chaperona GroEL de 60 kDa, y un antígeno crudo sonicado (CA). Finalmente, comparar el rendimiento de ambos inmunoensayos y determinar las condiciones para su máxima utilidad.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales y sueros
Para este estudio se utilizaron sueros de 10 perros beagle infectados experimentalmente con B. canis, obtenidos en un trabajo previo, amablemente donados por Efrén Díaz (CENID SAI; INIFAP SAGARPA, México) (Tuxpan Galván, 2015), confirmados por la prueba de aglutinación rápida en portaobjetos (RSAT) y el aislamiento bacteriano de las muestras de sangre. Brevemente, los animales fueron inoculados por instilación en la conjuntiva con 5 x 106 UFC/ml de una cepa de campo de B. canis, se tomaron muestras de sangre a diferentes días post infección y se cultivaron en medio Ruiz-Castañeda. La identificación de Brucella canis se realizó mediante pruebas bioquímicas de rutina según la metodología descrita por Alton (1988).
Se utilizaron sueros de 10 perros clínicamente sanos, cuya última vacunación contra cualquier agente fue al menos seis meses antes de la toma de muestras y que dieron un resultado negativo en el RSAT (Carmichael y Joubert, 1987). Para las pruebas de selectividad, se utilizaron tres sueros de perros con infecciones de Leptospira interrogans confirmadas por la prueba de aglutinación microscópica, dos sueros de perros recientemente vacunados contra L. interrogans, Adenovirus canino tipo 1 y 2, y Moquillo canino, y suero de un perro positivo para infección gastrointestinal con Salmonella spp., confirmado por cultivo. Todos estos sueros provenían del stock de sueros del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Autónoma de México.
Antígenos
El antígeno crudo (AC) se obtuvo mediante la sonicación de la cepa RM6/66 de B. canis utilizando un método previamente descrito (de Oliveira et al., 2011); brevemente, se tomaron 2 g de biomasa de B. canis inactivada por calor (75 °C durante 1 h) y se colocaron en 10 mL de una solución que contenía 10 mM de HEPES pH 7.5, y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Las bacterias fueron así sonicadas (Vibra Cell VCX 130 - Sonics) (4 pulsos de 1 min a 15 Hz) en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich, Saint Luis, Mo). Para corroborar la disrupción celular, se realizó una tinción de Gram. Una vez sonicada la biomasa bacteriana, se centrifugó a 700 x g durante 30 min a 4 °C para obtener la fracción soluble (sobrenadante).
La proteína purificada (GroEL) se obtuvo a partir de la fracción soluble mediante cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) utilizando una columna de intercambio aniónico (HiTrap Capto Q; GE Healthcare) con cromatografía líquida (AKTA Pure; GE Healthcare). La columna se tamponó con 5 mL de una solución de Tris-HCl (5 mM) y EDTA (10 mM), luego se introdujo la muestra con un flujo de 1 mL/min y se lavó con la solución descrita anteriormente. El tampón de elución (1 M NaCl) se incluyó en un gradiente lineal de 0 % a 100 % en nueve volúmenes de 1 mL cada uno. Cada fracción se obtuvo en un volumen de 0.5 mL y se resolvió mediante SDS-PAGE al 12 % por duplicado y se tiñó con azul de Coomassie o se transfirió a una membrana de PVDF para la inmunotransferencia, utilizando sueros de perros infectados; además se utilizó anti IgG de perro como anticuerpo secundario (1:10000) y ECL West femto como sustrato (ThermoFisher, Carlsbad, California). Posteriormente, las fracciones se concentraron 3 veces en un Amicon ultra 50kDa (Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y se resuspendieron en PBS y se seleccionaron dos fracciones que contenían dos bandas cada una (entre 55 kDa y 70 kDa), para resolverlas en un gel mediante enfoque isoeléctrico (EIE) (un total de 20 µg de proteína) seguido de una electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional y se verificó la antigenicidad de cada mancha mediante Western blot con la ayuda de sueros de perros infectados por B. canis. Se identificaron tres manchas como GroEL mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas, tal y como se describe en un trabajo anterior, con una cobertura del 29, 51 y 21 % para cada mancha (Morales Aguilar, 2016) (Material Suplementario).
Protocolo iELISA utilizando el antígeno crudo sonicado
El ELISA con antígeno crudo (AC-iELISA) se realizó en placas de poliestireno de 96 pocillos de unión media (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp; Sigma-Aldrich), añadiendo 240 ng de antígeno diluido en 100 µL por pocillo en solución tampón fosfato (PSB); se homogeneizó a 100 rpm durante 5 min y se incubó a 37 °C durante 17 +/- 1 h. Se lavó tres veces con 200 µl de una solución de PBS + Tween 20 (Sigma-Aldrich) al 0.1% (PBS- Tween 20). Se añadió una solución de albúmina de suero bovino (Bovine serum albumin; Sigma-Aldrich) diluida al 1 % en PBS (100 µl por pocillo), se incubó durante 60 minutos a 37 °C y se lavó tres veces con 200 µl de Tween 20 al 0.1 %. Se añadió el suero diluido en PBS 1:250 en 100 µL, después se incubó a 37 °C durante 60 min, tras lo cual se lavó tres veces con 200 µL de Tween 20 al 0.1 %. Se añadió una solución de 100 µl del anticuerpo secundario anti-IgG canina de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (anticuerpo secundario anti-IgG canina de conejo (H+L), HRP; Invitrogen), diluido 1:2000 en PBS (solución ABTS; Roche), se incubó a 37 °C durante 60 min y se lavó tres veces con 200 µl de Tween 20 al 0.1 %. Por último, se añadieron 100 µL de ABTS (Sigma- Aldrich) a cada pozo en la oscuridad y se incubaron con el pozo cubierto con papel de aluminio, a temperatura ambiente en agitación orbital a 100 rpm durante 25 min. Las placas se leyeron con un lector de ELISA (Biotek Instruments) a una longitud de onda de 405 nm utilizando el programa Gen5 (https://www.biotek.es/es/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/).
iELISA protocol using GroEL
Para la técnica que utiliza GroEL como antígeno de captura (GroEL - iELISA), se sensibilizó una placa de 96 pocillos (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp; Sigma-Aldrich) utilizando 10 ng de proteína GroEL purificada diluida en suficiente solución tampón de carbonato (0.05 M, pH 9.6) para alcanzar un volumen de 100 µl por pocillo. La placa se colocó en agitación orbital a 100 rpm durante 5 minutos, se cubrió con parafilm (Parafilm M; Merck) y se incubó a 4 °C durante 17 ± 1 h, después se lavó tres veces con 200 µl de Tween 20 al 0.1 %. Se añadieron 100 µl de suero diluido 1:500 en PBS con albúmina de suero bovino a 1 g/L (0.1 M, pH 7), se cubrió con parafilm, se incubó durante 1 h a 37 °C y se lavó tres veces con Tween 20 al 0.1 %. Se añadieron 100 µl por pocillo de una dilución 1:2000 del anticuerpo anti-IgG canina de cabra con peroxidasa (anticuerpo secundario anti-IgG canina de cabra (H+L), HRP; Invitrogen) diluido en PBS (0.1 M, pH 7), se cubrió con parafilm y se incubó durante 1 h a 37 °C, después se lavó tres veces con Tween 20 al 0.1 %. Por último, se añadieron 100 µL de ABTS a cada pocillo en la oscuridad, cubriendo la placa con papel de aluminio y colocándola en agitación orbital a 100 rpm durante 25 min. La lectura se realizó en un lector de ELISA (Bio-Tek/ELX808; Biotek) a una longitud de onda de 405 nm utilizando el software Gen5.
Protocolo de validación interno
El punto de corte se determinó utilizando un método previamente descrito (Frey et al., 1998) y se calculó utilizando la siguiente ecuación:
Donde
Las alícuotas 1 a 6 se descongelaron a temperatura ambiente durante 2 h y luego se volvieron a congelar durante 12 h.
Las alícuotas 2 a 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.
Los números 3 a 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.
Los números 4 a 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.
Los números 5 y 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.
La alícuota 6 se descongeló durante 2 h. y se volvió a congelar durante 12 h.
Las muestras 7 a 12 se mantuvieron a temperatura ambiente desde el inicio de la evaluación; una alícuota se trasladó al congelador después de 1 h, una segunda alícuota después de 2 h, una tercera alícuota después de 4 h, una cuarta alícuota después de 24 h, una quinta alícuota después de 72 h y la sexta alícuota después de 168 h.
Las alícuotas 13 a 18 se mantuvieron a 4 °C desde el inicio de la evaluación y se trasladaron al congelador siguiendo el mismo proceso descrito en el punto 7.
La alícuota 19 se mantuvo a -20 °C y se analizó un mes después.
Por último, se comprobó la sensibilidad y la especificidad utilizando 10 sueros negativos y 10 positivos, ajustando los resultados según la fórmula descrita anteriormente para obtener el intervalo de confianza del 95 % (IC95%) (DasGupta et al., 2001; Jacobson, 1998), mediante el siguiente cálculo:
A = 2r + 1.962
C = 2(n + 1.962)
Construyendo el intervalo de confianza como (A-B)/C, (A+B)/C.
RESULTADOS
I-ELISA utilizando antígeno crudo sonicado
El punto de corte en 0.98 DO se calculó utilizando 10 controles negativos. En la prueba de precisión, se encontró que para el control negativo el CV fue del 3.7 % para la repetibilidad y del 13 % para la precisión intermedia, con una media de 0.5 DO; para el control positivo, el CV se calculó como 1.1 % para la repetibilidad y 3.8 % para la precisión intermedia, con una media de 3.0 DO.
Con respecto a los resultados del ANOVA para la robustez, hubo diferencias significativas (p < 0.05) cuando se varió la temperatura, sin embargo, la prueba HSD de Tukey mostró que la diferencia era entre los resultados de la incubación del suero a 32 °C y 42 °C, no entre ninguno de ellos y la temperatura estándar de 37 °C; el ANOVA de los resultados de las pruebas variando los tiempos de incubación mostró diferencias significativas (p <0. 01), que la prueba HSD de Tukey mostró entre los tiempos de incubación de 55 min y 65 min, así como entre cada uno de estos tiempos y el estándar de 60 min.
La prueba de selectividad permitió identificar un falso positivo utilizando suero de perros infectados con L. interrogans. La prueba de estabilidad de la muestra mostró una variación significativa en la muestra negativa a partir de 4 h a 25 °C, 24 h en refrigeración (4 °C) y el segundo ciclo de congelación-descongelación, pero no hubo variación en la muestra que se mantuvo congelada (-20 °C) durante 30 días. En las alícuotas del control positivo, no hubo ninguna variación significativa durante todo el procedimiento. La prueba mostró una sensibilidad del 100 % (CI95% 70 - 100 %) y una especificidad del 100 % (CI95% 70 - 100 %).
I-ELISA con GroEL
El punto de corte se calculó como 1,228 DO utilizando 10 controles negativos. En la prueba de precisión, para el control negativo el %CV fue del 4.6 % para la repetibilidad y del 12.9 % para la precisión intermedia, con una media de 0.7 DO. Para el control positivo, el % CV se calculó en un 8.1% para la repetibilidad y un 16.8% para la precisión intermedia, con una media de 1.3 DO. El ANOVA para la robustez mostró diferencias significativas (p < 0.01) cuando se varió la temperatura, que la prueba HSD de Tukey identificó entre los resultados de los sueros incubados a 42 °C y la temperatura estándar (37 °C) y entre la incubación a 32 °C frente a 42 °C. Con respecto a las pruebas en las que se varió el tiempo de incubación, el ANOVA mostró diferencias significativas en los resultados entre 55 y 60 min, 60 y 65 min, y 55 y 65 min según la prueba HSD de Tukey. La prueba de selectividad permitió identificar un falso positivo de suero de perros infectados con L. interrogans y Salmonella spp. La prueba de estabilidad de la muestra mostró que, para los negativos, empezaron a producirse diferencias significativas a las 168 h a 25 °C, una semana en refrigeración y el segundo ciclo de congelación- descongelación, mientras que para los positivos no hubo diferencias, ni siquiera después de 168 h a 25 °C, 24 h en refrigeración y 7 ciclos de congelación-descongelación. Sin embargo, en ambos casos hubo una curva con variaciones significativas durante las primeras horas de almacenamiento de la muestra, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración. Ni los positivos ni los negativos variaron cuando las muestras se almacenaron en estado de congelación hasta un mes. La prueba mostró una sensibilidad del 44 % (IC95% 18 - 73 %) y una especificidad del 67 % (IC95% 35 - 88 %).
DISCUSIÓN
La Brucelosis Canina es una enfermedad cuyo riesgo epidemiológico potencial ha sido subestimado, (Hensel et al., 2018; Hubbard et al., 2018; Hull y Schumaker, 2018; Krueger et al., 2014) dando lugar a un escaso interés investigador. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos de diagnóstico para poder abordar este problema, y en este sentido los métodos serológicos juegan un papel importante (Avijgan et al., 2019). En este estudio se evaluaron dos antígenos diferentes de B. canis hasta sus límites en dos inmunoensayos diferentes para establecer las condiciones de rango en las que sirven para detectar los anticuerpos presentes en una muestra, y por tanto, su validez como pruebas diagnósticas, (Andreasson et al., 2015) garantizando que puedan ser aplicadas en el campo.
El primer aspecto que se debe determinar es el punto de corte, ya que éste se utiliza como referencia para diferenciar entre muestras positivas y negativas durante el resto de las pruebas, así como las variaciones en los resultados. El método utilizado se basa en el cálculo probabilístico, que se ha preferido al método empírico (Frey et al., 1998), ya que ofrece una mayor seguridad a la hora de tomar decisiones sobre la positividad de una muestra. A continuación, se realizó una evaluación de la precisión basada en el cálculo de la repetibilidad y la precisión intermedia. Según la literatura, la precisión intermedia no debe superar la repetibilidad duplicada, (Andreasson et al., 2015) sin embargo, esta regla puede ser modificada dependiendo de la naturaleza del método que se valida. Por esta razón, para considerar si la técnica es reproducible, se utilizó como punto de referencia una precisión intermedia y una repetibilidad %CV inferior al 20 % (Jacobson, 1998). Bajo este criterio, tanto CA - iELISA como GroEL - iELISA han mostrado niveles aceptables de repetibilidad y precisión intermedia tanto para muestras positivas como negativas, lo que sugiere que se puede confiar en los resultados.
Al evaluar la robustez de la prueba AC - iELISA, encontramos que las muestras incubadas a diferentes temperaturas no mostraron diferencias estadísticamente significativas en comparación con el estándar; esta variable hace referencia a la interferencia que puede suponer un cambio brusco de temperatura dentro de la incubadora, y por tanto a la necesidad de una buena calibración y estabilidad del equipo. No fue así en el caso de la variación del tiempo de incubación, donde sí se encontraron diferencias. Por lo tanto, es necesario que el operador esté atento a los tiempos de incubación cuando utilice esta prueba para el diagnóstico. En el caso de GroEL - iELISA, hubo diferencias significativas cuando se aumentó la temperatura, así como cuando se modificó el tiempo de incubación, por lo que recomendamos que antes de realizar la prueba, el operador se asegure de que la temperatura del equipo se mantenga por encima de 37 °C y por debajo de 42 °C, así como que se respeten los tiempos de incubación propuestos. Esta variable depende totalmente del operador.
Al evaluar la selectividad de las pruebas, se encontró que la prueba AC - iELISA mostró positividad cruzada con perros infectados con Leptospira spp. En la prueba GroEL - iELISA, hubo una reacción cruzada adicional con Salmonella spp. La reacción cruzada con Leptospira spp ha sido descrita previamente en otros métodos serológicos (Rosa de Bengala) en bovinos vacunados contra esta espiroqueta, (de Faria Naves et al., 2012) además, esto ha sido reportado en perros por comunicación personal (Moreno-Torres A, 2018). Por otra parte, en la única literatura que aborda específicamente esta cuestión, no se encontró ninguna reacción cruzada entre B. canis y Leptospira spp utilizando la prueba RSAT (Krecic, 2019). Este estudio es, por tanto, el primero en demostrar una reacción cruzada entre B. canis y Leptospira spp. Debido a la naturaleza de los antígenos de captura utilizados como referencia, y a la falta de reacciones positivas a los mismos en un método basado en la detección de antígenos de membrana, podemos inferir que los antígenos responsables de la interferencia son de origen citosólico. Esta proteína chaperona se expresa abundantemente en los biofilms de Leptospira spp (Vinod Kumar et al., 2017) lo que sugiere una posible relación entre la formación de estos biofilms y la alta exposición a GroEL que genera anticuerpos contra estas moléculas, aunque esta cuestión queda fuera del alcance de este estudio. Además, se ha descubierto que el GroEL de Salmonella spp es altamente homólogo al GroEL de Escherichia coli, y ambos son altamente homólogos a una proteína presente en Brucella spp., (Panchanathan, 1998; Sekhavati et al., 2015) lo que podría explicar la reacción cruzada en la prueba GroEL - iELISA con Salmonella spp. Para responder a esta pregunta, es necesario abordar el problema desde una perspectiva molecular o bioinformática para determinar las similitudes entre el GroEL de las dos especies de bacterias. Hay otros patógenos que se sabe que causan reacciones cruzadas con Brucella spp. (Mol et al., 2020), esas posibles interferencias en el diagnóstico deberían estudiarse en el futuro para descartar reacciones cruzadas. Uno de los más conocidos es el caso de Yersinia enterocolitica, que interfiere en la detección de B. melitensis y B. abortus; sin embargo, hasta la fecha no hay datos publicados que indiquen que este patógeno afecte a diferentes pruebas serológicas de B. canis. En cambio, Hurvell demostró en 1972 que los antígenos de Yersinia enterocolitica no presentan reacciones cruzadas con las Brucellas rugosas, es decir, B. canis y B. ovis (Hurvell, 1972).
Basándose en los resultados de la prueba de estabilidad, se recomienda que las muestras para AC - iELISA se conserven a 25 °C durante menos de cuatro horas, en refrigeración durante menos de 24 horas, siendo la congelación el método preferido de almacenamiento de las muestras, ya que se obtuvieron resultados fiables incluso después de un mes de congelación. Para el GroEL - iELISA, se recomienda que las muestras no se dejen más de una hora a temperatura ambiente o en refrigeración y que se coloquen inmediatamente en un congelador para garantizar la fiabilidad de los resultados.
La sensibilidad y la especificidad calculadas para AC - iELISA son buenas, pero el intervalo de confianza es demasiado laxo debido al número de muestras utilizadas, por lo que deben interpretarse teniendo esto en cuenta. Lo mismo ocurre con GroEL - iELISA. Dado que para la validación "in-house" de las pruebas serológicas no se requiere la determinación de la sensibilidad y la especificidad según el método descrito por Andreasson (Andreasson et al., 2015), en este trabajo no se incluyó un mayor número de muestras, sino que se decidió calcular estos parámetros con el único fin de obtener un punto de comparación entre las pruebas que nos acerque a posibles escenarios a la hora de utilizarlo en la práctica clínica diaria. En futuros trabajos se deberían analizar más muestras que permitan una estimación más precisa de los parámetros, con el fin de utilizar algunas de estas pruebas para estudios epidemiológicos. Dado que ese no era el objetivo de este estudio, no exploramos más esta cuestión.
Por último, la comparación entre las pruebas presentadas en este estudio refuerza la idea de que el uso de diversos antígenos en una prueba de diagnóstico es preferible al uso de un único antígeno (Wanke et al., 2002). No obstante, la discusión sobre si los antígenos citosólicos son más útiles en el diagnóstico que los antígenos de membrana sigue abierta, ya que se observó un mejor rendimiento en la prueba que utilizó una mezcla de antígenos de ambos orígenes que en la prueba que utilizó únicamente el antígeno citosólico.
La Brucelosis Canina es una enfermedad que requiere más atención e investigación. Así, el desarrollo de métodos de diagnóstico con un adecuado control de calidad permitirá futuras investigaciones que exploren más profundamente el impacto de esta enfermedad en la salud humana y animal y nos conduzca a la mejora de las estrategias de prevención y control siguiendo la filosofía de Una Salud.
CONCLUSIONES
Teniendo en cuenta los puntos anteriores, se puede concluir que AC-iELISA no sólo funcionó mejor que GroEL-iELISA, sino que, dados los resultados obtenidos, es una prueba de diagnóstico útil para la brucelosis canina en el campo. Dado que no sólo detecta los antígenos de la membrana externa, sino también los antígenos citosólicos, AC - iELISA es más útil para el diagnóstico que las pruebas de inmunoaglutinación. AC- iELISA también permite abordar la respuesta inmunitaria del huésped de forma semicuantitativa (no sólo cualitativa), lo que lo hace potencialmente útil para que el veterinario de primer contacto controle serológicamente al paciente durante el tratamiento.
