Ubicación y colecta del material vegetal

La colecta de material vegetal se realizó en el mes de febrero de 2018 en el Rancho Xamantún perteneciente al Instituto Tecnológico de Chiná del Tecnológico Nacional de México, ubicado a 19°43’ latitud Norte y 90°24’ longitud Oeste. El sitio cuenta con un clima cálido subhúmedo A(W1) (^{García, 2004}), con temperatura y precipitación media anual de 26°C y 1,138 mm, respectivamente, y una elevación de 36 m.

Se colectó 1 kg de follaje fresco, compuesto por hojas y tallos tiernos, simulando el ramoneo de un bovino adulto a un máximo de dos metros de altura, de las siguientes 10 especies de plantas arbóreas y arbustivas: B. divaricata, M. calabura, Lysiloma latisiliquum, Tithonia diversifolia, Sida acuta, Guazuma ulmifolia, Moringa oleifera, Acacia farnesiana, Samanea saman y Coccoloba cozumelensis, así como 5 kg de Pennisetum sp. var. maralfalfa. Las muestras se secaron en una estufa de aire forzado a una temperatura de 55°C durante 72 h. Posteriormente, se molieron en un molino tipo Willey con criba de 1 mm y se conservaron a temperatura ambiente (24°C) hasta su uso.

Presencia de metabolitos secundarios

Se determinó la presencia cualitativa de diversos MSec del follaje de las 10 especies de árboles y arbustos forrajeros previamente mencionados. Para ello, se tomaron 25 g del material vegetal y se colocaron en frascos de vidrio. Posteriormente se añadieron 3 v/v de etanol al 96 % como solvente para extraer los MSec. Una vez obtenidos los extractos etanólicos, la presencia de MSec se realizó siguiendo el protocolo de Valencia del Toro y Garín (Valencia-Del Toro y Garín-Aguilar, 2010). Los resultados se muestran en el Cuadro 1.

Tratamientos

Tomando en cuenta los perfiles de MSec obtenidos, así como a la escasa información de sus efectos en la fermentación ruminal, se seleccionaron dos especies vegetales por su alto contenido de metabolitos inhibidores de la actividad microbiana: M. calabura, la cual tuvo una alta presencia de saponinas esteroidales y flavonoides del tipo xantonas y flavonas, y B. divaricata, la cual presentó un contenido moderado de taninos derivados del catecol. Con base en lo anterior, se evaluaron cinco tratamientos: P=Pennisetum sp. (100%); Mc=M. calabura (100%); Bd=B. divaricata (100%); McP=M. calabura (30%)/Pennisetum sp. (70%), y BdP=B. divaricata (30%)/Pennisetum sp. (70%).

Análisis químicos

Las muestras secas y molidas de los cinco tratamientos se analizaron por triplicado para determinar el contenido de materia seca (MS), cenizas, proteína cruda (PC) y extracto etéreo (EE) de acuerdo con la AOAC (2006); mientras que la fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) se determinaron de acuerdo a la técnica de ^{Van Soest et al. (1991)}. Los resultados se presentan en el Cuadro 2.

Fermentación in vitro

El procedimiento para la colecta de líquido ruminal (LR) se realizó en estricto apego a la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 “Especificaciones técnicas para la Producción, Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio” (NOM-062-ZOO-1999., 1999). El LR utilizado se obtuvo de cuatro novillos machos, no castrados, de diferentes cruzas de razas de Sardo Negro, Gyr, Brahman y Pardo Suizo, de un año de edad y con un peso promedio de 250 kg. Su alimentación consistió en una dieta integral (70:30 forraje:concentrado) compuesta por paja de pastos de Echynochloa polystachya y Brachiaria brizantha, maíz molido, granos secos de destilería, melaza y premezcla mineral, la cual se ofreció dos veces al día (8:00 y 16:00 horas). Diariamente los novillos consumieron el equivalente al 3% de MS de su peso vivo.

La extracción de LR se realizó por la mañana, una hora antes de la primera ración del día usando un colector manual de LR (Rumen-Mate with RFE, Drench-Mate®). El LR recolectado se depositó en un termo previamente calentado a 39°C, e inmediatamente se transportó al laboratorio. Una vez en el laboratorio, el LR se filtró a través de cuatro capas de manta de cielo y se utilizó para preparar el inóculo, el cual se elaboró de acuerdo a la metodología de ^{Menke et al. (1979)}. Posteriormente, se adicionaron 50 mL de inóculo en viales de vidrio color ámbar con capacidad de 120 mL, que contenían 0.5 g de cada uno de los tratamientos, se taparon con un tapón de goma, se sellaron con un arillo de aluminio y se colocaron en un baño maría a 39°C, agitándose manualmente cada 2 horas. Se realizaron tres fermentaciones en total, con tres repeticiones cada una.

Degradabilidad in vitro de la materia seca

La degradabilidad in vitro de la materia seca (DMS, mg/g MS) se determinó a las 24 y 72 horas. Al final de cada tiempo, se sacaron los viales del baño maría y se colocaron en agua con hielo durante 2 horas para detener la actividad microbiana. Posteriormente, se filtró el contenido de cada vial con una bomba de vacío; el material filtrado se colocó en una estufa a 70°C durante 24 horas hasta peso constante.

Producción de gas in vitro

La producción de gas (PG) se registró a las 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 30, 36, 42, 48, 60 y 72 horas utilizando un manómetro (^{Theodorou et al., 1994}). Después de cada registro, se igualó a cero la presión de cada frasco. Para obtener el volumen máximo (Vmax), la tasa de fermentación (S) y la fase lag (L) se usó el procedimiento NLIN del programa estadístico ^{SAS (2004)} versión 9.0, utilizando el modelo mencionado por ^{Kholif et al. (2017)}).

Determinación de CH₄ y CO₂

La determinación de CH₄ y CO₂ se realizó de acuerdo con ^{Kholif et al. (2017)}, con las siguientes modificaciones: cada 6 horas durante 24 horas, se colectó el gas producido en los viales con una jeringa de vidrio de 60 mL; posteriormente este gas se transfirió a otro vial que contenía 50 mL de una solución de NaOH (1N), se agitó para asegurar la incorporación del gas en dicha solución, se volvió a colectar y se registró el gas con la misma jeringa de vidrio. La mezcla del gas con la solución de NaOH permitió la absorción de CO₂, y el volumen de gas colectado en la jeringa se consideró como CH₄.

Determinación de AGV

La determinación de AGV se realizó por cromatografía de gases (^{Erwin et al., 1961}). A las 72 horas de fermentación, se colectó 1.6 mL de líquido de cada vial, se depositó en un tubo de microcentrífuga con 0.4 mL de ácido metafosfórico al 25% y se almacenó a - 20°C.

Energía metabolizable y factor de partición

El cálculo de la energía metabolizable se realizó siguiendo el modelo propuesto por ^{Menke et al. (1979}). El factor de partición (relación entre DMS (mg/g) y PG (ml/g MS)), se calculó a las 24 horas de incubación utilizando el modelo mencionado por ^{Kholif et al. (2017}).

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un diseño en bloques completamente al azar utilizando el siguiente modelo estadístico:

Yij= µ+ Ti+ Fj +Eij

Dónde: Yij = es cada observación del i- ésimo tratamiento (Ti) de la j-ésima fermentación (Fj); µ = media aritmética; Eij = error experimental.

Los resultados se analizaron con el procedimiento GLM de programa estadístico ^{SAS (2004)} versión 9.0 y se realizó la comparación de medias por la prueba de Tukey (P≤0.05).

Presencia de metabolitos secundarios y análisis químicos

Las especies forrajeras evaluadas tuvieron presencia de varios MSec, pero ninguna mostró presencia de alcaloides, quinonas o laucoantocianidinas (Cuadro 1). Se observó que las especies M. oleifera, A. farnesiana y L. latisiliquum tuvieron un alto contenido de taninos derivados del ácido gálico y G. ulmifolia en taninos derivados del catecol; mientras que las especies M. calabura y S. saman tuvieron un contenido moderado en taninos derivados del ácido gálico, y las especies B. divaricata y T. diversifolia en taninos derivados del catecol. Respecto a las saponinas, las especies con mayor presencia de esteroides fueron M. calabura, L. latisiliquum, T. diversifolia, S. acuta, A. farnesiana y S. saman, mientras que en terpenoides solo M. oleifera presentó baja presencia. Del grupo de los flavonoides, las especies forrajeras con alta presencia de xantonas y flavonas fueron M. calabura, M. oleifera y A. farnesiana, mientras que S. saman tuvo una presencia moderada; el resto de las especies tuvo una presencia baja, a excepción de T. diversifolia, la cual fue la única especie que presentó una baja presencia de auronas y chalconas.

Los metabolitos secundarios son compuestos producidos en diferentes rutas del metabolismo secundario de las plantas, los cuales no son esenciales para el crecimiento y reproducción. Estas biomoléculas desempeñan diversas funciones, destacando la respuesta al estrés ambiental, inmunidad y protección contra microorganismos patógenos, plagas (^{Pang et al., 2021}) y animales herbívoros (^{Ugbogu et al., 2019}). Se ha demostrado que algunos de estos metabolitos secundarios pueden tener actividad antimicrobiana sobre los microorganismos ruminales, siendo la disminución de la metanogénesis ruminal uno de sus efectos principales (^{Patra et al., 2017}), el cual ha sido ampliamente reportado para taninos y saponinas (^{Anantasook et al., 2013}; ^{Ugbogu et al., 2019}; ^{Patra et al., 2017}) y en menor medida para flavonoides (^{Patra et al., 2017}). Contrario a ^{Delgado et al. (2012)}, quienes reportaron presencia moderada o alta de alcaloides en mezclas de follajes de árboles con pasto, en el presente estudio no fue detectado este metabolito. Los alcaloides poseen actividad antimicrobiana pero también se ha demostrado que son tóxicos tanto para animales como humanos. En general, los animales no consumen altas cantidades de plantas con alto contenido de alcaloides debido a su sabor amargo (^{Guil-Guerrero et al., 2016}).

La selección de M. calabura y B. divaricata fue debido a sus características fitoquímicas y por la escasa información de sus efectos en la fermentación ruminal. El valor nutricional de las dos especies arbóreas evaluadas en este estudio es similar a lo reportado en otros estudios (Cuadro 2). De acuerdo con ^{Gómez-Fuentes-Galindo et al. (2017)}, B. divaricata presenta menor contenido de FDN (46%) y mayor contenido de PC (12.8%) que gramíneas como Panicum máximum o Paspalum langei los cuales poseen en promedio 70% de FDN y 6.5% de PC, características que podrían favorecer un mayor consumo voluntario y una tasa de pasaje más rápida. Otros autores han reportado que B. divaricata posee entre 12 y 18% de PC, entre 30 y 40% de digestibilidad ruminal in vitro, entre 1.5 y 3.8% de taninos, y presencia de saponinas y alcaloides (^{Albores-Moreno et al., 2018}; ^{Cab-Jiménez et al., 2018}; ^{Gómez-Fuentes-Galindo et al., 2017}; ^{Sosa-Rubio et al., 2004}). Respecto a M. calabura, es prácticamente nula la información nutricional. ^{Kongvongxay et al. (2011)} reportaron que las hojas de M. calabura contienen 13% de PC, pero señalan que se sabe muy poco sobre su valor nutritivo ya que es poco utilizada para alimentar animales. En relación al contenido de metabolitos secundarios, se ha reportado que sus frutos (^{Pereira et al., 2018}) y hojas (^{Pujaningsih et al., 2018}) contienen compuestos bioactivos con actividad antioxidante y antimicrobiana, entre los cuales destacan diversos compuestos fenólicos, entre ellos antocianinas y flavonoides.

Degradabilidad in vitro de la materia seca

En el Cuadro 3 se presentan los resultados de la DMS a las 24 y 72 h de los follajes de M. calabura y B. divaricata solos y combinados con Pennisetum sp., observándose diferencias entre los tratamientos (P≤0.05). Los tratamientos con la mayor DMS a las 24 h fueron BdP, seguida por P y Bd; no obstante, a las 72 h fueron P, seguido de BdP y McP. El follaje solo de M. calabura tuvo la DMS más baja en ambos horarios, lo cual concuerda con lo reportado por ^{Puspitaning (2012)}, quien menciona que la utilización de 20% de M. calabura en la dieta disminuye la DMS. Por otro lado, la DMS de B. divaricata fue mayor (53%) que la reportada por otros autores (32 y 39%) (^{Albores-Moreno et al., 2018}; ^{Sosa-Rubio et al., 2004}).

^{Kamalak et al. (2004)} concluye que el contenido de paredes celulares en los forrajes afecta negativamente los parámetros de fermentación ruminal. Por su parte, ^{Zhang et al. (2017)} enfatiza que la incorporación del follaje de algunas especies de árboles y arbustos tropicales en las dietas de rumiantes basadas en gramíneas incrementa el contenido de PC y disminuye el contenido total de carbohidratos estructurales en la dieta. Tales afirmaciones fueron parcialmente observadas en este estudio. Los tratamientos Mc y Bd (correspondientes a los follajes solos) tuvieron ≈33% menos contenido de FDN y ≈57.5% más contenido de PC, comparado con P, lo cual es similar a lo reportado por ^{Gómez- Fuentes-Galindo et al. (2017)}, quienes reportaron un contenido de FDN y PC del 46.5% y 12.8% respectivamente, para B. divaricata. Sin embargo, el menor contenido de FDN y mayor de PC de M. calabura y B. divaricata no mejoró la DMS, lo que contrasta con los reportado para otros follajes, tales como de L. leucocephala, la cual aumenta 18% la DMS cuando se incluye al 25% en dietas de bovinos basadas con gramíneas (^{Molina et al., 2015}). En el presente estudio, la inclusión de M. calabura afectó negativamente la DMS (P≤0.05), ya que en el tratamiento McP fue 10% menor que en P.

Producción de gas in vitro

La PG se presenta en la Figura 1. No hubo diferencias significativas (P>0.05) durante las 72 h de fermentación entre los tratamientos Bd, BdP, McP y P, los cuales tuvieron una PG acumulada promedio de 439 mL/g MS; sin embargo, sí hubo diferencias significativas (P≤0.05) con Mc que tuvo una PG cumulada de 283.49 mL/g MS. ^{Albores-Moreno et al. (2018)} reportaron una PG de 200.59 mL/g materia orgánica a las 72h con follaje de B. divaricata, lo cual es 53% menor que lo observado en el presente estudio. Por otro lado, la PG de follaje de M. calabura reportada por ^{Silivong et al. (2013)} fue de 269 mL/g MS a las 24 h, 166% mayor que lo obtenido con Mc. Estas variaciones en la PG se puede atribuir a las diferencias en la composición de los forrajes, generalmente cuando presentan concentraciones altas de PC, fibra y contenido de polifenoles (^{Vargas et al., 2012}). En nuestro estudio, Mc fue el tratamiento con la más baja PG y menor degradabilidad.

Dónde: P=Pennisetum sp. (100%); Mc=M. calabura (100%); Bd= B. divaricata (100%); McP= M. calabura (30%)/Pennisetum sp. (70%), y BdP= B. divaricata (30%)/Pennisetum sp. (70%).

Figura 1 Producción de gas de follajes de Muntingia calabura y Bauhinia divaricata solos y combinados con Pennisetum sp. 

Características de la fermentación in vitro y producción CH ₄ y CO ₂

Los resultados de Vmax, S, L, producción de CH₄ y CO₂, EM y FP se muestran en el Cuadro 4. El Vmax y S del tratamiento Mc fue significativamente menor (P≤0.05) que el resto de los tratamientos; sin embargo, la L de Bd y Mc (los tratamientos de follaje solo) fue alrededor de 20% menor que la L de los tratamientos McP, BdP y P. Respecto a la producción CH4 también hubo diferencias significativas (P≤0.05), observándose que Mc fue el tratamiento con la mayor producción de CH4, mientras que Bd y BdP los de menor producción. En relación al contenido de EM, se observó que los valores más elevados los presentaron Bd y BdP, siendo cercanos a 2 Mcal/kg MS, los cuales fueron significativamente diferentes (P≤0.05) a los tratamientos Mc y McP, con 1.5 Mcal/kg MS en promedio. No hubo diferencias (P>0.05) en el FP a las 24 h, pero sí a las 72 h (P≤0.05) entre los tratamientos con el follaje solo, siendo mayor con Mc y menor con Bd.

El comportamiento de la fermentación ruminal depende la disponibilidad de los carbohidratos presentes en los forrajes (^{Zhang et al., 2017}), por lo que en este estudio, los tratamientos con mayor Vmax de PG podrían estar relacionados con una mayor degradación de los carbohidratos estructurales presentes en el follaje. Mientras que el bajo Vmax en Mc puede deberse a una baja concentración de la fracción soluble del alimento, disminuyendo la cantidad de gas producido. Además, es probable que la presencia de MSec como saponinas y flavonoides, hayan afectado la fermentación de la MS y, por ende, la PG. Estos MSec interaccionan directamente sobre la función de la membrana citoplásmica de los microorganismos ruminales inhibiendo la síntesis de la pared celular, creando un efecto de defaunación, con lo cual se disminuyen los protozoarios y por consiguiente, las arqueas metanogénicas asociadas a ellos disminuyendo así la metanogénesis ruminal. En el rumen, los protozoarios se encuentran asociados a las arqueas metanogénicas y su relación puede generar entre el 9 y el 37% de las emisiones totales del CH₄ entérico producido por los rumiantes (^{Rivera et al., 2018}; ^{Vargas et al., 2012}). Por su parte, ^{Velez-Terranova et al. (2014)} y ^{Lakhani & Lakhani, 2018} señalan que las plantas que tienen un alto contenido de flavonoides disminuyen la producción de CH4 e inducen a una estimulación extensa del metabolismo microbiano en el rumen, que aumenta tanto la degradabilidad de la PC como los constituyentes de la pared celular, al mejorar la fermentación hasta un 50%. En este sentido, ^{Silivong et al. 2013} reportaron que la producción de CH₄ en la fermentación in vitro de M. calabura fue de sólo 3.8%, concentración considerablemente menor que lo obtenido para L. leucocephala (7.8%) o G. sepium (15.6%), lo cual contrasta con lo reportado en este estudio, en el cual el análisis químico preliminar mostró que el follaje solo de M. calabura tiene alta presencia de saponinas y flavonoides, y presencia moderada de taninos derivados del ácido gálico; no obstante, en el ensayo in vitro el gas producido con Mc tuvo una mayor concentración de CH₄, cercana al 15%.

Ácidos grasos volátiles

No se observaron diferencias significativas (P>0.05) en la concentración de AGV, excepto de ácido acético entre Mc y P con Bd, y de isovalérico entre Mc y Bd (P≤0.05; Cuadro 5). Son inexistentes los estudios que evalúen la producción de AGV de la fermentación ruminal utilizando como sustrato M. calabura o B. divaricata; sin embargo, la modificación en la producción ruminal de AGV puede estar influenciada por la presencia de MSec en la dieta. Al respecto, ^{Broudiscou & Lassalas, (2000}) realizaron un estudio donde evaluaron el efecto de extractos secos de Lavandula officinalis y Equisetum arvense, dos especies conocidas por el alto contenido de flavonoides, sobre la fermentación ruminal in vitro encontrando que el uso del extracto de ambas especies mejoró la tasa de fermentación en un 50%, al aumentar la producción de acetato y propionato, reduciendo de esta manera la producción de CH₄. En el presente estudio el follaje de M. calabura mostró un alto contenido de flavonas, mientras que en el follaje de B. divaricata fue bajo, lo cual pudo influir en la mayor concentración de ácido acético en el tratamiento con Mc. Por otro lado, la mayor concentración de ácido isovalérico en Bd pudo ser a causa del mayor contenido de PC de este follaje (casi 15% en BS), el cual se produce a partir de la descarboxilación y desanimación de la leucina, un aminoácido de cadena ramificada (^{Apajalahti et al., 2019}).