INTRODUCCIÓN

En las aves de producción las enfermedades respiratorias son importantes, por el impacto económico debido a la disminución de los parámetros productivos y aumento del costo por el uso de medicamentos, esto depende de la especie productiva, edad de las aves, costo por tratamientos, microorganismo patógeno, mortalidad, bioseguridad, estrés por factores climáticos o manejo y respuesta inmune (^{Espinosa et al., 2011}; Colas et al., 2011^a; Colás et al., 2011^b; ^{Bagust, 2013}; ^{Ataei et al., 2017}). En el sistema de postura comercial en jaula, el tratamiento consiste en el uso de antimicrobianos; sin embargo, la resistencia a los antibióticos se debe en gran medida a su uso inapropiado (^{Vanegas-Múnera & Jiménez-Quinceno, 2020}), lo cual representa uno de los mayores riesgos que enfrentamos como comunidad global (^{Davies & Davies, 2010}; ^{Nhung et al., 2017}; ^{ONU, 2019}). ^{Braykov et al. (2016)} evidenciaron la presencia de E. coli en muestras de agua, suelo y gallinero, así como en gallinas y pollos de granja a pequeña escala en el noroeste de Ecuador, encontrándose resistencia antimicrobiana en todos los casos. Lo verdaderamente alarmante en los sistemas de producción intensiva es la presencia de problemas respiratorios diagnosticados con etiología simple o múltiple causada por diversos organismos patógenos (virus, bacterias, hongos y agentes inmunosupresores) (^{Glisson, 1998}) y patógenos emergentes con multirresistencia (^{Nworie et al., 2016}), en el caso de S. aureus, comprometen el desempeño de un organismo impidiéndole mostrar su potencial genético en producción, conociéndose a este complejo patológico como Síndrome Respiratorio Aviar o Complejo Respiratorio Aviar (CRA) o Enfermedad Respiratoria Crónica Complicada (ERCC) (^{Colas et al., 2010}; ^{Ammar et al., 2016}; ^{De la Cruz, 2016}; ^{Brochu et al., 2019}). El manejo adecuado de la parvada o el sistema de producción adquieren un papel primordial en la aparición de procesos respiratorios, pues siempre serán superiores en parvadas donde no existe un manejo apropiado (Colás et al., 2011^b). La identificación fenotípica bacteriana se basa en las características morfológicas, de desarrollo, propiedades bioquímicas y metabólicas, éstas sirven en la diferenciación de los géneros de las bacterias, puesto que su realización y coste los hace más asequibles, no obstante, en ocasiones se requiere de metodologías complementarias para la identificación de especies (^{Bou et al., 2011}; ^{El-Adawy et al., 2018}). Debido a la alta incidencia de portadores de bacterias causantes de enfermedades respiratorias en parvadas de gallinas ponedoras y reproductoras de pollos de engorda es sustancial la identificación de los agentes causales, ya que esto significa una distribución extensa de estos microorganismos entre las aves de corral, lo cual ocasiona disminución en la producción de huevos y representa la primera causa de muerte de gallinas ponedoras (Colás et al., 2011^b; ^{Nworie et al., 2016}; ^{Elbestawy et al., 2018}). Un manejo inadecuado, por ejemplo, una falla en la ventilación, influye en el inicio de la presencia de enfermedades del tracto respiratorio, donde diversas bacterias como Mycoplasma spp., Escherichia coli, Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale, Bordetella avium, Avibacterium paragallinarum, Staphylococcus spp, Streptococus spp, Corynebacterium spp, entre otras, ocasionan el CRA (^{Espinosa et al., 2011}; ^{De la Cruz, 2016}; ^{Singh et al., 2016}; ^{Nworie et al., 2016}); además, se incluye la edad como un factor relacionado (^{Glendinning et al., 2017}). En cuanto a la resistencia a antibióticos en P. multocida se encuentran eritromicina, cloramfenicol y clindamicina con susceptibilidad a derivados de la penicilina y otros betalactámicos (^{Espinosa et al., 2011}; ^{Atere et al., 2016}). Se han reportado aislados de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina y susceptibilidad reducida a la vancomicina (^{Jorgensen & Ferraro, 2000}). Asimismo, se han reportado perfiles de resistencia donde incluyen hasta 12 antibióticos en especies de estafilococos coagulasa negativa, dentro de los cuales destaca S. epidermidis (^{Osman et al., 2015}). Respecto a Corynebacterium spp se describió resistencia a macrólidos, clindamicina, trimetoprim/sulfametoxazol, quinolonas y/o rifampicina (^{Yang et al., 2018}). Por otra parte, se reportó resistencia a los betalactámicos (penicilina y ampicilina), tetraciclina, tilosina, novobiocina, sulfonamida, lincomicina, enrofloxacina, florfenicol, cefotaxima, clindamicina, sulfatiazol, penicilina, norfloxacina y cefalotina en Gallibacterium anatis (antes Mannheimia haemolytica) (^{Osuna et al., 2017}; ^{El-Adawy et al., 2018}; ^{Elbestawy et al., 2018}; ^{Nassik et al., 2019}; ^{Krishnegowda et al., 2020}). El objetivo del presente estudio fue identificar las bacterias aisladas de tráquea de gallinas ponedoras y determinar su perfil de resistencia a antibióticos.

MATERIAL Y MÉTODOS

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Bacteriología y Micología perteneciente a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa (FMVZ-UAS), en el municipio de Culiacán, Sinaloa. De una granja de sistema de producción intensiva del norte del estado de Sinaloa (municipio de Ahome), se tomaron muestras de tráquea de gallinas ponedoras aparentemente sanas, casetas 1 y 2 de 59 semanas de edad y caseta 3 de 111 semanas de edad, mantenidas todas en jaulas desde la crianza hasta producción, con 20 mil aves aproximadamente en cada una. Este trabajo fue un estudio de cohorte transversal, observacional y descriptivo, se determinó el tamaño de muestra por conveniencia (5 hisopados por caseta). Las gallinas se trataron con enrofloxacina (10 mg/Kg de peso corporal o 0.5 mL/L de agua) entre 10 y 32 semanas antes de la toma de las muestras, debido a la presencia de estertores y caída de la producción. Para la toma de muestra se empleó la técnica de contención física manual del ave, se introdujo el hisopo y se realizó un arrastre intratraqueal. Las muestras fueron transportadas en medio Stuart en un contenedor a 4°C.

Aislamiento bacteriano. Se tomó el hisopo del medio y se realizó un estriado continuo en placas con medio agar sangre y chocolate. Posteriormente las placas se incubaron por 24 h a 37°C, en aerobiosis y anaerobiosis (incubadora para anaerobios marca Thermo Scientific con una atmósfera al 5% de CO₂). Una vez sembradas las placas, se tomaron los hisopos y se colocaron en tubos con agua peptona con el fin de conservar las muestras a 4°C.

Identificación bacteriana por métodos fenotípicos. En la identificación de las características de las colonias en el cultivo se observó el tamaño, forma, color, textura y bordes de las colonias, así como la presencia de hemólisis. Para la identificación microscópica se utilizó la tinción de Gram y se observó formas y agrupaciones (^{Kaiser, 2017}).

Identificación por pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación bacteriana fueron: agar de hierro y triple azúcar (TSI), agar de hierro y lisina (LIA), agar citrato de Simmons y sulfuro indol motilidad (SIM), prueba de oxidasa, catalasa, coagulasa y fermentación de manitol. En TSI se evaluó la capacidad para fermentar carbohidratos como glucosa, sacarosa y lactosa; en LIA se evaluó la presencia de la enzima decarboxilasa (descarboxilación de la lisina); en citrato de Simmons se comprobó la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono; en SIM se probó la motilidad, la producción de ácido sulfhídrico (H₂S) e indol; en la prueba de oxidasa se determinó la presencia de enzimas del sistema citocromooxidasa, en la prueba de catalasa se comprobó la presencia de esta enzima, la cual descompone el peróxido de hidrógeno; la prueba de coagulasa evidenció la presencia de esta enzima al coagular el plasma y transformar el fibrinógeno en fibrina; por último, algunos microorganismos fermentan manitol (^{Kaiser, 2017}). La diferenciación bioquímica de cada bacteria obtenida se realizó con base a lo descrito por ^{Hoover et al., 1983}; ^{Funke et al., 1997}; ^{Weinstein et al., 1997}; ^{Arce et al., 2011}; ^{Castillo et al., 2014}; ^{Sanz-Rodríguez et al., 2014} y ^{Zendejas-Manzo et al., 2014}.

Susceptibilidad a antibióticos. Con base a las características fenotípicas y metabólicas se seleccionó al azar un aislado de cada grupo de bacterias y se realizaron pruebas de inhibición in vitro por triplicado mediante el método de Kirby-Bauer de difusión en disco. Las bacterias se crecieron en caldo soya tripticaseína, tomándose lectura en un espectrofotómetro Bandwidth UV-5200 a una densidad óptica de 600 nm para estimar el crecimiento bacteriano hasta establecer un patrón 0.5 de McFarland. Posteriormente, las bacterias se sembraron en placas de agar Müeller-Hinton mediante estría continua cruzada con ayuda de un hisopo estéril hasta impregnarse el inóculo en el medio. Consecutivamente, se colocaron los multidiscos para bacterias Gram negativas (PT35Nmultibac I.D.) y Gram positivas (PT-34Nmultibac I.D.), los cuales contenían los antibióticos ampicilina (10 µg), cefalotina (30 µg), cefotaxima (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), clindamicina (30 µg), dicloxacilina (1 µg), eritromicina (15 µg), gentamicina (10 µg), penicilina (10 U), trimetoprim-sulfametoxazol (25 µg), tetraciclina (30 µg), vancomicina (30 µg), cloramfenicol (30 µg), carbenicilina (100 µg), netilmicina (30 µg), nitrofurantoína (300 µg), norfloxacina (100 µg) y amikacina (30 µg). Los quimioterapéuticos clindamicina, dicloxacilina, eritromicina, penicilina, tetraciclina y vancomicina fueron probados únicamente en bacterias Gram positivas; mientras que cloramfenicol, carbenicilina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina y amikacina se probaron únicamente en las Gram negativas. Por último, las placas se incubaron a 37 ± 1°C por 18-24 h. Transcurrido el periodo de incubación, se midió el halo de inhibición con una regla (mm) para determinar la susceptibilidad o resistencia de acuerdo a las recomendaciones del CLSI (del inglés: Clinical and Laboratory Standards Institute) y del fabricante Investigación Diagnóstica Laboratorio de Reactivos para Diagnóstico (^{CLSI, 2015}; ^{CLSI, 2017}; ^{CLSI, 2018}; ^{ID, 2020}; ^{CLSI, 2021}; ^{EUCAST, 2022}). Los aislamientos con una susceptibilidad intermedia se consideraron resistentes, ya que estas poblaciones bacterianas presentan subpoblaciones de bacterias resistentes que transmitirán este fenotipo a las bacterias susceptibles (^{Flores-Hernández et al., 2020}).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De las 15 muestras obtenidas de tráquea de gallinas, pertenecientes a tres casetas de postura (CP1-3), se obtuvieron 32 aislados, de éstas se agruparon en 5 tipos de colonias bacterianas y se identificaron por métodos fenotípicos y bioquímicos como se describe en el cuadro 1 como Pasteurella multocida, Corynebacterium spp, Staphylococcus aureus, Gallibacterium anatis y Staphylococcus epidermidis (^{Hoover et al. 1983}; ^{Funke et al., 1997}; ^{Weinstein et al., 1997}; ^{Arce et al., 2011}; ^{Castillo et al., 2014}; ^{Sanz-Rodríguez et al., 2014}; ^{Zendejas-Manzo et al., 2014}). En la CP1 se detectaron los 5 tipos de colonias, donde se obtuvo un total de 14 aislados. En cambio, en la CP2 se encontraron 3/5 tipos de colonias, con 8 aislados. Por último, en la CP3 se obtuvieron 4/5, con un total de 10 aislados (Cuadro 1). En este sentido se observó a S. aureus, P. multocida, G. antis, S. epidermidis y Corynebacterium spp presentes en el 60, 53, 47, 40 y 13% de las gallinas, respectivamente.

Los hallazgos de este estudio coinciden con lo reportado por ^{Osuna et al. (2017)} donde aislaron G. anatis y P. multocida de 600 gallinas ponedoras de diferentes granjas de Sonora; sin embargo, las muestras fueron obtenidas de tejidos diversos como los cornetes, tráquea, pulmones, hendidura palatina, hígado, bazo, riñones, folículos y peritoneo de ponedoras seleccionadas por la presencia de signos clínicos respiratorios; además, también reportaron la presencia de E. coli, Streptococcus sp, Pseudomonas sp y Salmonella sp, mientras en este estudio dichas bacterias no fueron aisladas. Asimismo, difiere en los microorganismos encontrados y la selección de las muestras del trabajo realizado por ^{Mendoza et al. (2014)}, pues se identificaron 96 aislados de G. anatis en aves comerciales (38 pollos de engorda, 37 gallinas ponedoras, 19 reproductoras y 2 gallos de pelea) con signología respiratoria y en la tinción de Gram se observó la morfología de cocobacilos Gram negativos; sin embargo, en el presente estudio se observaron tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas y las muestras fueron tomadas de aves sin signos clínicos, aparentemente sanas con tratamiento previo por problemas de salud.

Con respecto a la frecuencia de aislados bacterianos (32), S. aureus fue el agente bacteriano más aislado (28%), seguido por P. multocida, G. anatis y S. epidermidis, con 25, 22 y 19% de los aislados, respectivamente, mientras que Corynebacterium spp fue la menos frecuente (6%). Estos resultados difieren a lo reportado por ^{Espinosa et al. (2011)}, donde el microorganismo más aislado fue P. multocida (20%), sin embargo, la frecuencia de esta bacteria es similar en cuanto al porcentaje de aislamiento en un total de 80 muestras de exudados nasales y traqueales de gallinas ponedoras, en dicho estudio se aislaron además E. coli (18%) y O. rhinotracheale (5%), las cuales no fueron aislados en este estudio. ^{Atere et al. (2016)}, en un estudio realizado en pollos de 23 granjas aislaron P. multocida con una frecuencia del 12% (12/97), lo cual difiere con este estudio con una frecuencia del 53% (8/15), además, de los 12 aislamientos 3 fueron detectados en hígado. Asimismo, los resultados del presente estudio difieren con lo presentado por ^{Vargas et al. (2010)}, donde mostraron a S. aureus, como la quinta bacteria más aislada de 45 aves silvestres. Sin embargo, ^{Castillo et al. (2014)} identificaron a P. multocida y G. anatis como microorganismos presentes en el CRA, lo cual concuerda con los resultados obtenidos. ^{Nassik et al. (2019)} determinaron que G. anatis está involucrada en la disminución de la producción de huevo con una frecuencia del 46% en muestras de ovario, tráquea y cloaca de 52 gallinas, lo cual coincide con estos resultados (47%); sin embargo, los aislados corresponden solo a tráquea. El estudio realizado por ^{Nworie et al. (2016)}) presenta discrepancias en los aislados y el tipo de muestras donde reportan una frecuencia de 14% para S. aureus en muestras de narinas y cloacas, mientras en el presente estudio se encontró una frecuencia del 60% para esta bacteria en exudados traqueales, además se encontró otra especie de estafilococo (S. epidermidis) en un 40% de las aves. Recientemente, ^{Benrabia et al. (2020)} encontraron para S. aureus una prevalencia de 48.8% en gallinas ponedoras de 840 granjas en Argelia, el cual es similar a estos resultados; además, reportan que el 34% de esos aislados correspondían a S. aureus resistente a la meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés), lo cual representa un riesgo considerable para la salud pública.

En dos de los aislamientos Gram positivos obtenidos (S. aureus y S. epidermidis) se encontró resistencia a betalactámicos (dicloxacilina, Staphylococcus spp. R: ≤ 12 mm, S: ≥ 13 mm), glucopéptidos (vancomicina, Staphylococcus spp. R: ≤ 16 mm; S: ≥ 17 mm), macrólidos (eritromicina, Staphylococcus aureus R: ≤ 21 mm; S: ≥ 22 mm; S. epidermidis R: ≤ 20 mm; S: ≥ 21 mm) y tetraciclinas (tetraciclina, Staphylococcus aureus R: ≤ 23 mm; S: ≥ 24 mm; Staphylococcus spp. R: ≤ 18 mm, S: ≥ 19 mm), con base en los criterios establecidos por ^{CLSI, 2017}; ^{ID, 2020}; ^{CLSI, 2021}y ^{EUCAST, 2022} (Cuadro 2). ^{Vargas et al. (2010)}, en su estudio detectaron resistencia de S. aureus a macrólidos, lo cual coincide con en este estudio en S. aureus y S. epidermidis, quienes mostraron resistencia a la eritromicina; sin embargo, difieren en cuanto a la resistencia a vancomicina y en el tipo de muestras, cloacas y glotis de 30 aves y frotis nasales y rectales de 29 mamíferos. Asimismo, en el estudio realizado por ^{Nworie et al. (2016)} en muestras nasales y cloacales de aves de corral encontraron resistencia de S. aureus a eritromicina, gentamicina, tetraciclina y trimetoprim/sulfametoxazol, lo cual coincide con los hallazgos obtenidos. Del mismo modo, ^{Benrabia et al. (2020)} coinciden al reportar resistencia de S. aureus a tetraciclina y eritromicina; sin embargo, la mayoría de los aislados de esta bacteria, en muestras de hisopados nasales de gallinas reproductoras, ponedoras, pollos de engorda y pavos, fueron resistentes a ciprofloxacina y sensibles a vancomicina y gentamicina, lo cual contrasta con los presentes resultados. De la misma manera, ^{Osman et al. (2015)} coinciden en la resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol pero difieren en resistencia a penicilina y clindamicina en aislados de estafilococos donde destacan S. hyicus, S. lugdunensis, S. aureus y S. epidermidis; esto puede ser por el origen de sus muestras (carne de pollo y res expendida en supermercados de El Cairo), por lo cual ponen de manifiesto la importancia de la procedencia de la infección para el humano. Además, en Corynebacterium spp. se encontró resistencia a los grupos de aminoglucósidos (gentamicina, R: ≤ 14 mm, S: ≥ 15 mm), betalactámicos (ampicilina, R: ≤ 21 mm; S: ≥ 29 mm; cefalotina, R: ≤ 17 mm, S: ≥ 18 mm; cefotaxima, R: ≤ 22 mm, S: ≥ 23 mm), glucopéptidos (vancomicina, R: ≤ 16 mm; S: ≥ 17 mm), quinolonas (ciprofloxacina, R: ≤ 20 mm, S: ≥ 21 mm) y sulfonamidas (trimetoprim/sulfametoxazol, R: ≤ 15 mm, S: ≥ 16 mm), con base en los criterios establecidos por ^{ID, 2020} y ^{EUCAST, 2022} (Cuadro 2).

En este estudio, con base en los criterios establecidos por ^{ID, 2020} y ^{EUCAST, 2022} los aislamientos obtenidos de P. multocida mostraron resistencia a los aminoglucósidos (amikacina, R: ≤ 16 mm, S: ≥ 17 mm; netilmicina, R: ≤ 14 mm, S: ≥ 15 mm), betalactámicos (ampicilina, R: ≤ 16 mm; S: ≥ 17 mm; Carbenicilina, R: ≤ 22 mm, S: ≥ 23 mm), cloramfenicoles (cloramfenicol, R: ≤ 17 mm, S: ≥ 18 mm) y quinolonas (ciprofloxacina, R: ≤ 26 mm; S: ≥ 27 mm; norfloxacina R: ≤ 16 mm, S: ≥ 17 mm) (Cuadro 3), los cuales difieren a lo reportado por ^{Zahoor & Siddique (2006)} en muestras de hígado de aves de varias granjas avícolas, donde aislados de P. multocida mostraron sensibilidad a cloramfenicol y ciprofloxacina y resistencia a trimetoprim/sulfadiazina.

Además, estos resultados difieren en cuanto a la resistencia reportada por ^{Atere et al. (2016)} en hisopados de tráquea e hígado de pollo, donde encontraron resistencia a ciprofloxacina, ampicilina, nitrofurantoína y gentamicina en P. multocida, mientras en el presente estudio se observó resistencia a ciprofloxacina y ampicilina, en contraste gentamicina y nitrofurantoína tuvieron buena efectividad in vitro.

En este estudio, G. anatis presentó resistencia a betalactámicos (ampicilina, FR: ≤ 26 mm; S: ≥ 27 mm), quinolonas (ciprofloxacina, R: ≤ 20 mm, S: ≥ 21 mm; norfloxacina, R: ≤ 16 mm, S: ≥ 17 mm) y sulfonamidas (trimetoprim/sulfametoxazol, R: ≤ 23 mm; S: ≥ 24 mm) con base en los criterios establecidos por ^{CLSI, 2015} e ^{ID, 2020} (Cuadro 3), lo cual coincide con la resistencia reportada en distintos tipos de muestras (cornetes, tráquea, pulmones, hendidura palatina, hígado, bazo, riñones, folículos, peritoneo, ovario, proventrículo, laringe, corazón, saco aéreo, cerebro, ojo y oviducto) de gallinas ponedoras, pollos de engorda y reproductoras; además, presentó sensibilidad a la familia de los fenicoles y gentamicina (^{Osuna et al., 2017}; ^{El-Adawy et al., 2018}; ^{Elbestawy et al., 2018}; ^{Nassik et al., 2019}).

Así mismo, ^{Mendoza et al. (2014)} reportaron resistencia de G. anatis a ciprofloxacina en bacterias aisladas de muestras clínicas de pollos de engorda, gallinas ponedoras, reproductoras y gallos de pelea, lo cual coincide con los resultados obtenidos.

CONCLUSIÓN

Las bacterias patógenas aisladas e identificadas bioquímicamente de tráquea de gallinas ponedoras en el norte de Sinaloa, están representadas por 4 géneros bacterianos, donde las bacterias Gram positivas fueron Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Corynebacterium spp y por Gram negativas Pasteurella multocida y Gallibacterium anatis. La microbiota Gram positiva resultó con alta resistencia antimicrobiana, en el género Staphylococcus, principalmente a betalactámicos, glucopéptidos, macrólidos y tetraciclinas y el género Corynebacterium a aminoglucósidos, betalactámicos, glucopéptidos, quinolonas y sulfonamidas, asimismo, este grupo de Gram positivos convergió en un 100% para los glucopéptidos; así mismo las Gram negativas P. multocida y G. anatis mostraron resistencia a la ampicilina (betalactámicos) y al grupo de las quinolonas en un 100%. La presencia de estas bacterias patógenas en diferentes casetas en las granjas de sistemas de producción intensiva puede ser debido a la exposición y dispersión, implicándose en la resistencia y multirresistencia encontrada en este tipo de enfermedades en producción avícola y sanitaria, por lo cual es necesario explorar alternativas al uso de los antibióticos.