Especies

Se evaluaron seis especies de Ganoderma: G. curtisii (Berk.) Murrill, G. oerstedii (Fr.) Torrend, G. sessile Murrill sensu^{Gottlieb and Wright (1999)}, G. sessiliforme Murrill, G. subincrustatum Murrill sensu ^{Gottlieb and Wright (1999)} y G. weberianum (Bres. & Henn. ex Sacc.) Steyaert, las cuales se recolectaron en diferentes localidades del estado de Sonora, México (Tabla 1). Los basidiomas están depositados en la Colección de Macromicetos de la Universidad Estatal de Sonora, mientras que las cepas en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., conservándose mediante resiembras continuas en agar con extracto de malta (EMA), las especies resistentes a 4 °C y las sensibles a bajas temperaturas a 25 °C.

Inóculo y tratamientos

El micelio de las cepas creció en cajas Petri con EMA. El inóculo se preparó con semilla de trigo (Triticum aestivum L.) de acuerdo con el protocolo de ^{Gaitán-Hernández et al. (2006)}; posteriormente se inocularon con cuatro discos de EMA de 0.5 cm de diámetro, los cuales se tomaron del crecimiento activo de los micelios de Ganoderma. Las bolsas de trigo inoculadas se incubaron a 25 ± 2 °C en oscuridad por 7 a 10 d. Se tomaron 50 semillas completamente colonizadas por el micelio de las cepas y se colocaron en viales de policarbonato de 5 mL previamente esterilizados en autoclave a 121 °C por 15 min. Posteriormente se sometieron a los tratamientos de conservación: T1= aceite mineral, los viales con semillas se aforaron con aceite mineral estéril (15 min a 121 °C); T2= liofilización, T3= -20 °C y T4= -80 °C; como testigo se utilizó el micelio sin congelar, conservado a 4 y 25 ºC, con resiembras continuas. Los tratamientos T2, T3 y T4 se congelaron previamente con nitrógeno líquido, sin ningún agente crioprotector. Los tratamientos T1 y T2 se mantuvieron a temperatura del laboratorio (25 ± 2 °C).

Viabilidad

Después de 1, 6 y 22 meses de almacenamiento, los viales fueron removidos de sus tratamientos. Las semillas de T1 se colocaron sobre papel estéril para remover el exceso de aceite mineral, las semillas de T2 se utilizaron directamente, mientras que los viales de los tratamientos T3 y T4 se colocaron por 10 min en baño maría a 30 °C para su descongelación (^{Mata y Savoie, 2013}). Posteriormente, se colocaron por duplicado, 20 semillas en una caja de Petri de 8 cm de diámetro con medio de cultivo EMA y se incubaron a 25 ± 2 ºC en oscuridad. Se consideró como viable, cuando bajo el microscopio estereoscópico, se observó crecimiento micelial sobre la semilla (^{Gutiérrez et al., 2017}); se cuantificó el tiempo de recuperación (TR) en d y el porcentaje de recuperación (PR) de las especies, la cual se determinó multiplicando × 100 los taxones recuperados entre el número total. El porcentaje de viabilidad (PV) se cuantificó multiplicando × 100 las semillas que mostraron crecimiento micelial entre el número total de semillas. Se consideraron viables los tratamientos con un crecimiento ≥70 % y la velocidad de crecimiento del micelio (VC), se calculó con el tiempo requerido para llenar la caja Petri de 80 mm de diámetro (^{Mata y Savoie, 2013}).

Crecimiento micelial

El crecimiento micelial por especie evaluada, se determinó colocando una semilla de cada tratamiento en el centro de la caja Petri con EMA, incubada en la oscuridad a 25 ± 2 ºC. Se midió diariamente el diámetro de la colonia en dos direcciones perpendiculares con un vernier digital Truper Modelo CALDI-6MP, por un periodo de 15 d.

Análisis descriptivo

Los resultados del comportamiento de las seis especies de Ganoderma en los cuatro tratamientos y tres periodos de conservación se describen para cada una de las variables analizadas con base en los estudios de ^{Voyron et al. (2009)} y ^{Eichlerová y Homolka (2014)}.

Tiempo de recuperación

En el tratamiento control, el tiempo de recuperación (TR) en la mayoría de las especies rescatadas fue de dos días (Tabla 2); G. oerstedii y G. sessiliforme resultaron las más precoces, necesitaron sólo un día para recuperarse. Después de un mes en almacenamiento, el TR varió entre especies y tratamientos. Los TR más cortos se lograron a -80 °C (T4) y en aceite mineral (T1) con 1.6 y 2.2 d, respectivamente; mientras que los más prolongados, liofilización (T2) y -20 °C (T3) con 3.7 y 4.6 d, respectivamente.

Después de seis meses de almacenamiento, los TR se prolongaron con respecto a los 30 d de almacenamiento. En T1 y T4, los TR micelial se incrementaron 0.4 y 1.0 d, respectivamente. En T2 y T3 se observó un comportamiento disímil, recuperándose la totalidad de las especies, lo cual no ocurrió a los 30 d. El TR en T2 demoró 0.1 d más y en T3, el TR fue 1.4 d más rápido con respecto a 30 d de almacenamiento. En todos los tratamientos a los 22 meses de preservación se incrementó el TR comparado con seis meses. El TR a los 22 meses fue de 3.3 (T4), 4 (T3), 3 (T1) y 5 d (T2). El TR del micelio se incrementó conforme transcurrió el tiempo de almacenamiento en todas las especies y tratamientos evaluados. Probablemente sea inherente a la especie, tiempo de almacenamiento, calidad del micelio y método de conservación. ^{Mata y Savoie (2013)} reportaron que el TR de 20 cepas de Agaricus osciló entre 2 y 3 d, cuando utilizaron sorgo como medio para crioconservación. ^{Colauto et al. (2012)} registraron nueve días en TR de micelio de Agaricus blazei con arroz integral en la criopreservación. El ADN del micelio de Ganoderma multiplicado en semilla de trigo y crioconservado se observó más estable, comparado con medios sintéticos (^{Singh et al., 2004}; ^{Veena y Meera, 2010}).

Porcentaje de recuperación

El porcentaje de recuperación (PR) de las especies, después de 30 d de almacenamiento fue de 100 % en los tratamientos de T4 y T1; en T3 el 83.3 %, sin recuperación de G. subincrustatum, y en T2 el 50 %, con pérdida de G. curtisii, G. sessiliforme y G. subincrustatum. El PR no se afectó después de seis meses de almacenamiento en los tratamientos de T4 y T1 (100 %), mientras que en T2 y T3 su comportamiento no fue claro, ya que se recuperó el 100 % de las especies, pero no a los 30 d. A los 22 meses en los tratamientos de T3 y T4, la recuperación de las especies fue del 100 %, mientras que en T1 y T2 del 33.3 %. En T1 se recuperó G. curtisii y G. oerstedii, mientras que en T2, G. curtisii y G. sessile. El porcentaje de viabilidad varió entre los cuatro tratamientos. La pérdida del 66.6 % de las especies en T1, probablemente se debió a que después de 22 meses, la semilla de trigo perdió el cotiledón y la estructura, haciéndose blanda y con alto grado de hidratación.

Para solventar este inconveniente se propone el uso de perlita (^{Sato et al., 2012}; ^{Eichlerová y Homolka, 2014}), material volcánico e inerte formado de aluminosilicatos, que capta y retiene grandes cantidades de agua. Este material protege a la hifa del hongo, durante el proceso de crioconservación. ^{Palacio et al. (2014)} reportaron que a -20 °C sólo recuperaron cepas a los 30 d de almacenamiento, lo cual se debió al daño celular por la cantidad de cristales de hielo formado durante el congelamiento y descongelamiento del micelio de A. blazei, G. lucidum, Grifola frondosa y Pleurotus pulmonarius. En el presente estudio se recuperó el 100 % de las especies evaluadas a los seis y 22 meses de almacenamiento. Esto probablemente se deba a la concentración del citoplasma y composición de la pared celular de Ganoderma, ya que la cantidad de agua libre en la célula y rigidez-elasticidad de la pared celular, la cual está dada por la concentración de quitina y glucanos, permite la adaptación del micelio a la congelación (^{Colauto et al., 2012}).

^{Palacio et al. (2014)} no recuperaron cepas liofilizadas después de 12 meses de almacenamiento. Estos autores citan que la liofilización es una técnica en la que se deben seguir varias condiciones específicas y largos procesos de estandarización, para lograr buenos resultados en la recuperación del micelio y sin efectos colaterales. En el presente estudio se recuperó el 33.3 % de las especies evaluadas después de 22 meses de almacenamiento.

Porcentaje de viabilidad

En la Tabla 2, se puede observar el porcentaje de viabilidad (PV) del micelio. Después de un mes de almacenamiento el PV fue de 100 % en todas las especies en los tratamientos de T4 y T1. En T2 fue de 100 % en G. oerstedii y G. sessile; sin embargo, esta variable se redujo al 12.5 % en G. weberianum y 0 % en el resto de las especies. El tratamiento T3 logró buenos resultados en G. oerstedii y G. sessile, con 100 y 95 % de viabilidad respectivamente; sin embargo, el PV fue bajo en G. weberianum (12.5 %) y G sessiliforme (7.5 %), y nulo en G. curtisii y G. subincrustatum.

Después de seis meses de conservación, el PV no sufrió cambios en ninguna de las especies evaluadas en los tratamientos de T4 y T1, con un 100 %. Para T2, el PV fluctuó entre 20 y 55 % en G. oerstedii y G. subincrustatum respectivamente; sin embargo, se recuperó el 100 % de las especies evaluadas. Estos valores indican el potencial del método para la conservación de estas especies. En T3 se comportaron mejor G. oerstedii y G. sessile, con 100 y 85 % de viabilidad respectivamente, mientras que el resto osciló entre 25 (G. curtisii y G. sessiliforme) y 55.5 % (G. subincrustatum).

A los 22 meses de almacenamiento en T1, el PV se mantuvo en 100 % en las especies G. curtisii y G. oerstedii, mientras que las otras especies perdieron viabilidad. El tratamiento T4 presentó los mejores resultados de PV, con 100 % en G. oerstedii, G. sessile y G. weberianum, 85 % en G. subincrustatum, 70 % en G. sessiliforme y 28.3 % en G. curtisii. En T2, únicamente se recuperaron G. curtisii y G. sessile con 10.7 y 2.5 % de viabilidad respectivamente.

A -20 °C se recuperó el 100 % de las especies; sin embargo, todas presentaron un PV bajo de 6.3 (G. subincrustatum) hasta 40 % (G. oerstedii). No obstante, estos valores son superiores a los reportados por ^{Linde et al. (2018)}, quienes a -20 °C obtuvieron una recuperación baja de los basidiomicetos, con una viabilidad micelial promedio del 7.5 % y concluyeron que la crioconservación a -20 °C, no es una técnica viable para mantener el germoplasma de macromicetos. Varios factores afectan a la criopreservación de los basidiomicetos a esta temperatura como son la especie, la fase de crecimiento, el sustrato, las condiciones de cultivo, el crioprotector, entre otros (^{Linde et al., 2018}).

La liofilización es la manera más utilizada de conservación de hongos después de la criopreservación; sin embargo, no funciona en la mayoría de los basidiomicetos que no esporulan. El micelio constituido básicamente de agua y sensible a las condiciones ambientales, en la mayoría de los casos no sobrevive al proceso de rehidratación (^{Homolka, 2014}). La conservación en aceite mineral se recomienda para especies que resisten la liofilización, lo cual no es viable en la mayoría de los basidiomicetos. La principal desventaja de este método es que el hongo continúa su crecimiento aún bajo condiciones adversas, lo que podría ocasionar mutaciones (^{Homolka, 2014}).

Con respecto a la pérdida de viabilidad a -20 °C en el presente estudio, probablemente se deba a la expansión y ruptura de los organelos durante la formación de cristales de hielo en el proceso de ganancia de calor, al pasar la temperatura de -196 °C en nitrógeno líquido a -20 °C. Al respecto, ^{Homolka (2014)} cita que de manera general la temperatura de conservación de cultivos fúngicos entre -15 y -40 °C, no se recomienda. El análisis de la viabilidad micelial en basidiomicetos crioconservados, continúa siendo la principal y más importante forma de verificar la eficacia de los métodos de preservación.

Velocidad de crecimiento

La velocidad de crecimiento (VC) del micelio estuvo influenciada por las especies y los tratamientos (Tabla 3). En el control, la mayor VC se registró en G. subincrustatum con 11.6 mm d^-1, seguida de G. oerstedii con 9.6 mm d^-1, el resto de las especies mostraron una VC menor y similar entre ellas; G. weberianum, G. curtisii, G. sessile y G. sessiliforme con 8.9, 8.8, 8.6 y 8.4 mm d^-1, respectivamente. Después de un mes de almacenamiento, aunque la mayoría de las especies redujeron su VC, G. curtisii en T1, G. oerstedii a -20 y -80 °C, y G. sessile en T1, -20 y -80 °C, presentaron una VC más alta.

Después de seis meses de almacenamiento disminuyó la VC, según la especie y tratamiento. En T1, la VC se redujo entre 9.1 y 44.7 % en G. subincrustatum y G. curtisii respectivamente, mientras que en T4 entre 1.3 en G. oerstedii y 50 % en G. sessiliforme. La reducción de VC en T2 y T3 no se determinaron debido a que el PV resultó <70 %. Después de 22 meses de almacenamiento en T1, G. curtisii fue la única especie que se recuperó con una VC de 10.5 mm d^-1. En T4 se recuperaron cinco de las seis especies evaluadas (83 %) y de éstas, todas experimentaron una VC mayor a la registrada a los seis meses de almacenamiento. Ganoderma sessiliforme y G. sessile mostraron el mayor incremento en VC con 39.2 y 33.7 %, valores intermedios en G. subincrustatum (26 %) y G. weberianum (20 %), y el menor en G. oerstedii con 12.5 %. ^{Eichlerová y Homolka (2014)}, establecieron que uno de los criterios principales para definir el éxito de un método de conservación en hongos, es la habilidad de mantener el crecimiento micelial original. Estos mismos autores recomendaron para los basidiomicetos, el tratamiento a -80 °C con un precongelado lento.

Después de un año a -80 °C, ^{Eichlerová y Homolka (2014)} obtuvieron crecimientos de 3.6 y 4.6 mm d^-1 para Ganoderma carnosum y G. lucidum respectivamente, al utilizar perlita como inóculo. En el presente estudio se obtuvo una mayor VC comparada con la de estos autores, entre 5.9 y 12.7 mm d^-1 con un congelamiento rápido en nitrógeno líquido. Estas diferencias en la VC, probablemente sean inherentes a la especie, así como a los nutrientes de la semilla de trigo vs. perlita. En general, el crecimiento del micelio es más lento después de la crioconservación (^{Homolka et al., 2010}).

Finalmente, por medio de una resiembra se realizó una reactivación de las especies recuperadas del tratamiento a -80 °C, después de 22 meses en almacenamiento. El micelio se inoculó nuevamente en cajas Petri con EMA y se midió su VC. Contrario a lo esperado, la mayoría de las especies llenaron la caja Petri en menor tiempo vs. testigos; opuestamente, G. sessiliforme y G. subincrustatum requirieron 4.5 y 1.1 d más que sus testigos, respectivamente. ^{Homolka et al. (2010)} observaron también estas diferencias entre los micelios recién descongelados y los reactivados.