Colecta de las muestras biológicas

La colecta de las muestras se llevó a cabo en plantaciones agrícolas de banano de la variedad “Enano Gigante” (genoma AAA) siguiendo el procedimiento descrito por ^{Mahecha-Vásquez et al. (2017)}. Los predios analizados fueron Dos Rositas (18°50´29.68” N, 103°48´47.84” O), La Palma (18°53´35.45” N, 103°51´50” O) y San Jorge (18°58´27.73” N, 103°51’16.81” O), los cuales tienen manejo agrícola convencional y están separados por al menos 10 km de distancia entre cada uno. En cada predio se recolectaron seis plantas en etapa de producción en febrero del 2018 (época de sequía; 1 mm de precipitación) y seis en agosto de ese mismo año (época de lluvias; 160 mm de precipitación) ^{(Servicio Meteorológico Nacional, 2018)} a una distancia de al menos 10 m entre cada vástago abarcando una hectárea; se obtuvo un peso aproximado de 150 g de raíces secundarias de cada vástago. Dichas muestras se conservaron en bolsas de plástico dentro de una hielera y se almacenaron a 4 °C hasta su procesamiento.

Análisis de suelo

Se preparó una muestra compuesta de suelo (1 kg) a partir de las submuestras de suelo rizosférico de cada predio y se analizó en el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), ubicado en la carretera Colima-Manzanillo km 35, Tecomán. Se realizó una réplica del análisis de suelo por predio y temporada del año. De la muestra compuesta se determinó el contenido de materia orgánica (MO) ^{(Walkley y Black, 1934)}, P ^{(Olsen et al., 1954)}, K, Ca, Mg y Na (extracción de con acetato de amonio), Cu, Fe, Zn, Mn, (extracción con ácido dietilentriaminopenta-acético), así como la conductividad eléctrica (CE), pH, capacidad de intercambio catiónico (CIC), carbonatos totales ^{(Horton y Newson, 1953)}, textura del suelo ^{(Bouyocus, 1936)} y contenido de humedad.

Extracción de esporas

La extracción de esporas se realizó de acuerdo con la metodología de decantado y tamizado en húmedo ^{(Gerdemann y Nicolson, 1963)}, con algunas modificaciones. Se pesaron 100 g de suelo rizosférico de cada vástago de los predios analizados, y se colocaron en un vaso de precipitado de 2 L, con 1.5 L de agua corriente; se agitó durante 3 min, se dejó reposar 30 s, y el sobrenadante se decantó usando tamices de 297, 75 y 45 µm. Este proceso se realizó tres veces. El decantado se colocó en un tubo de 50 mL conteniendo 50 % de sacarosa y se centrifugó (3000 rpm, 5 min, 25 °C); se recuperó el sobrenadante, se pasó por un tamiz de 45 µm y se lavó con agua corriente con la finalidad de eliminar el exceso de sacarosa. El retenido se colocó en una caja Petri y se revisó en el microscopio estereoscópico (Olympus, Japón). Esporas íntegras (que no estaban colapsadas con el contenido citoplasmático) se aislaron a partir del color, tamaño y forma con ayuda de una aguja de jeringa de insulina; se cuantificaron con ayuda de un contador manual y se conservaron a 4 °C en tubos Eppendorf con 1.5 mL de agua destilada estéril.

Cultivos trampa

Con el propósito de incrementar el número de esporas se realizó la técnica de cultivo trampa reportada por ^{Bagyaraj y Stürmer (2012)}, en un invernadero tipo túnel a temperatura ambiente. Las muestras de suelo recolectadas en campo se colocaron en macetas de 2 kg previamente desinfectadas con cloro; el suelo se regó diariamente a capacidad de campo y se sembraron semillas de sorgo y frijol en cada maceta. Seis meses después de la siembra se disminuyó el riego para generar estrés en las plantas. Finalmente, las plantas se cortaron al nivel del suelo para inducir la formación de esporas; se extrajo el suelo de las macetas (100 g) y se realizó la caracterización morfológica de las esporas.

Caracterización morfológica de esporas

Las esporas aisladas del cultivo trampa se montaron en portaobjetos siguiendo el procedimiento descrito por ^{Moína-Quimí et al. (2018)}. Para esto, se agregó una gota de alcohol polivínilico lactoglicerol (PVLG) en el extremo de un portaobjetos y en el otro extremo una gota de PVLG+Melzer. En cada gota se colocaron 10 esporas, las cuales se cubrieron con un cubreobjetos y se aplicó una ligera presión con el émbolo de una jeringa de insulina para exponer los estratos de la pared y su reacción con el reactivo de Melzer. Las esporas se observaron en el microscopio óptico a 40X (Axio, E.U.A.) y se tomaron fotos directamente usando una cámara de 13 megapíxeles. Los HMA fueron identificados con ayuda de las descripciones reportadas en la Colección Internacional de Hongos Micorrízicos Arbusculares ^{(Morton, 2019)}.

Tinción de raíces y porcentaje de colonización de HMA

La tinción se llevó a cabo por el método de clareo y tinción ^{(Phillips y Hayman, 1970)}. Se pesaron 2 g de raíces por muestra, se lavaron por separado con agua corriente para retirar el suelo y se sumergieron en etanol 70 % (v/v) para conservarlas. Posteriormente, las raíces fueron clareadas en 10 % KOH por 10 días, cambiando el reactivo cada 24 h. Se enjuagaron con agua corriente y se dejaron en 10 % HCl por 48 h. Se eliminó el exceso de ácido con ayuda de una coladera y toallas de papel. Las raíces fueron teñidas con azul de tripano 0.05 % en lactoglicerol (p/v) por 24 h y colocadas en una caja Petri conteniendo agua destilada. Se obtuvieron 20 segmentos de 1 cm de longitud de raíces, se colocaron en dos portaobjetos por planta, se cubrieron con un cubreobjetos y se adicionó lactoglicerol hasta cubrir las raíces. Finalmente, estas fueron observadas en 120 campos en forma de zigzag en un microscopio óptico a 40X (Motic, E.U.A.). El porcentaje de colonización se determinó usando la siguiente fórmula: colonización (%) = (número de campos colonizados/número total de campos observados) * 100 ^{(Valencia y Zúñiga, 2015)}.

Análisis de datos

Previo al análisis de varianza (ANOVA), se comprobó la normalidad y homogeneidad de la abundancia de esporas, mientras que los porcentajes de colonización micorrízica fueron transformados usando la fórmula arcoseno√porcentaje. La comparación de medias se realizó con la prueba Tukey (α = 0.05). Los morfotipos de HMA identificados en las tres plantaciones se registraron en una matriz de presencia-ausencia. La influencia de las propiedades edáficas sobre la colonización y abundancia de esporas se determinó mediante un análisis de componentes principales usando el programa estadístico Minitab versión 16.1 (Minitab Inc., E.U.A.). Previo al análisis de componentes principales, se realizó un análisis de correlación lineal de Pearson usando el programa excel de Office (Microsoft Corp., E.U.A.) con el fin de seleccionar las variables que tuvieron mayor influencia en la abundancia de esporas en la rizosfera y en colonización de HMA en raíces de banano, a partir de un valor del coeficiente de correlación (r) ≥ 0.70.

Propiedades edáficas de las plantaciones de banano en dos temporadas del año

Las tres plantaciones analizadas presentaron un tipo de suelo distinto. Específicamente, se encontró suelo franco arcillo arenoso (arena: 54.6 %, limo: 20.0 %, arcilla: 25.4 %) en el predio La Palma, franco limoso (arena: 14.6 %, limo: 60.0 %, arcilla: 25.4 %) en Dos Rositas y arcillo limoso (arena: 14.6 %, limo: 40.0 %, arena: 45.5 %) en San Jorge. El pH de las muestras de suelo fue moderadamente alcalino, en un intervalo de 7.8 (San Jorge) a 8.0 (Dos Rositas). En época de lluvias, el predio San Jorge presentó los valores más altos en: MO (3.20 %), P (36.0 ppm), Ca (7024.5 ppm), K (1022.6 ppm), Mg (551.5 ppm), Cu (2.7 ppm), Fe (20.0 ppm), CIC (42.7 meq/100g), humedad (22.5 %) y carbonatos (13.3 %). Mientras que en Dos Rositas el Mn (17.8 ppm) y el limo (60 %) fueron las variables que presentaron los valores más altos. En época de sequía, La Palma presentó los valores más altos en CE (5.0 dS/m), nitratos (69.4 ppm), Na (274.0 ppm) y arena (54.6 %), entretanto el valor más alto de Zn (3.5 ppm) se observó en Dos Rositas.

Estatus de la micorriza arbuscular en cultivo de banano

Se observaron diferencias significativas (P < 0.001) en la abundancia de esporas en los predios La Palma y San Jorge en ambas temporadas, pero no en Dos Rositas (Figura 1 A). El valor más alto en la abundancia de esporas (1700 esporas/100 g de suelo) se encontró en La Palma, durante la época de lluvias. Mientras que, en temporada de sequía, la abundancia obtenida en este predio no presentó diferencias significativas con los valores observados en ambas temporadas en el rancho San Jorge. En este último, el valor más alto de esporas también se encontró en temporada de lluvias (1285 esporas/100 g suelo). Dos Rositas presentó el valor más bajo en la abundancia de esporas en ambas temporadas (581 esporas/100 g de suelo).

Figura 1 Estatus de la micorriza arbuscular en tres plantaciones de banano en Tecomán, Colima. A: abundancia de esporas. B: colonización de HMA. Letras distintas entre las barras indican diferencias significativas (prueba de Tukey, P ≤ 0.05). 

Por otro lado, se observó colonización en raíces de banano de las tres plantaciones analizadas, pero solo se encontraron diferencias significativas (P < 0.001) en temporada de sequía (Figura 1B), siendo el predio San Jorge donde se presentó el porcentaje de colonización más alto (63.3 %), seguido de La Palma (43.2 %) y Dos Rositas (30.8 %); en temporada de lluvias se observó un intervalo de colonización del 52.2 % al 56.0 %.

Se identificaron 23 morfotipos pertenecientes a los géneros Glomus, Acaulospora, Rhizophagus y Gigaspora. En el predio La Palma se identificó el mayor número de morfotipos (22), seguido de San Jorge (19) y Dos Rositas (17). De estos morfotipos se identificaron 8 especies de HMA (Acaulospora scrobiculata [Trappe]; Acaulospora tuberculata [Janos & Trappe]; Claroideoglomus etunicatum [Becker & Gerd.]; Funneliformis geosporum [Nicolson & Gerd.]; Glomus callosum [Sieverd.]; Glomus macrocarpum [Tul. & C. Tul.]; Racocetra aff. verrucosa, Rhizophagus aff. aggregatum) (Figura 2, Tabla 1).

Figura 2 Morfotipos y especies de hongos micorrízicos arbusculares identificados en las plantaciones de banano en Tecomán, Colima. A:Glomus macrocarpum. B: Glomus callosum. C-K: Glomus sp. L: Claroideoglomus etanicatum. M: Acaulospora scrobiculata. N: Acaulospora tuberculata. O-T: Acaulospora. U: Rhizophagus aff. aggregatum. V: Racocetra aff. verrucosa. W: Funneliformis geosporum. 

Influencia de las propiedades edáficas en el estatus de la micorriza arbuscular

En la Tabla 2 se muestran las propiedades edáficas que presentaron mayor correlación con la abundancia de esporas en cada temporada. Se encontró que esta variable es influenciada por un número mayor de factores edáficos en temporada de sequía comparado con la época de lluvias. Los resultados del análisis indican que se requieren dos componentes para explicar el 100 % de la varianza de los datos en cada temporada.

En época de sequía, los coeficientes de las propiedads edáficas presentaron valores similares entre sí en el primer componente, el cual explica el 87.2 % de la variación. En este componente los micronutrientes (Cu, Fe, Mn, Zn), el K y el limo favorecen la abundancia de esporas, mientras que la MO, los NO₃ y la arena la disminuyen (Tabla 2). En el segundo componente (12.8 % de la varianza total) se observó una mayor variación en los valores de los coeficientes, siendo la CE el factor que más favorece la abundancia, entretanto, el Ca, CIC, humedad y carbonatos la reducen de manera más importante (Figura 3A). En época de lluvias, el pH presentó una influencia negativa, mientras que el P, Ca, CIC, K y carbonatos favorecen la abundancia de esporas en el primer componente (85.6 %). En el segundo componente (14.4 %), la MO, Cu, Zn y arcilla tienen un efecto positivo, en tanto que el Mg presentó un efecto negativo (Tabla 2) (Figura 3B). Asimismo, se encontró que la MO, Ca, CIC, K, Cu, Zn y carbonatos son las propiedades que tienen una influencia en la abundancia de esporas en ambas temporadas del año.

Figura 3 Análisis de componentes principales de la influencia de las propiedades edáficas en el estatus de la micorriza arbuscular. A: abundancia de esporas en época de sequía. B: abundancia de esporas en época de lluvias. C: colonización de HMA en época de sequía. D: colonización de HMA en época lluvias. 

Por otro lado, las propiedades edáficas que tienen mayor correlación con la colonización de HMA se muestran en la Tabla 3. En este caso, un mayor número de factores edáficos influyen en la colonización de HMA en temporada de lluvias. En época de sequía el Zn tuvo una influencia negativa en la colonización en el primer componente (85 % de la varianza total), mientras que el pH es el que más la favorece en el segundo componente (15 % de la variación) (Figura 3C). En época de lluvias, los NO₃ y Fe tuvieron una influencia positiva, entretanto, la CE, Na y la arena presentaron un efecto negativo en el primer componente (82 %). En el segundo componente (18 %), el Mn promueve la colonización, mientras que la humedad y la arcilla la disminuyen (Figura 3D).

Los resultados del análisis de componentes principales muestran que el número de propiedades que promueven o disminuyen la colonización es menor si se compara con el número de factores que tiene un efecto en la abundancia de esporas. Aunado a esto, el Ca, CIC, Zn y carbonatos son las propiedades edáficas que influyen tanto en la abundancia de esporas como en la colonización de HMA en época de sequía, mientras que la arcilla es la única propiedad que tiene un efecto en el estatus de la micorriza arbuscular en temporada de lluvias.