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Introducción
Los hongos comestibles se consideran alimentos funcionales ya que en su estructura contienen sustancias bioactivas como los β-glucanos (Wasser 2002), los cuales son considerados responsables de actividades biológicas benéficas para la salud humana como inmunomoduladores, anticancerígenos, antitumorales, entre otros (Reis et al. 2017). Debido a estos compuestos bioactivos, los hongos comestibles y medicinales se consideran una alternativa para el tratamiento de diversas enfermedades (Sari et al. 2017).
Los β-glucanos se encuentran en la pared celular de los hongos (Basidiomycetes) (Khan et al. 2018), ya sea de los esporomas o del micelio (Arango y Nieto 2013). Los β-glucanos son polímeros compuestos de unida-des de glucosa unidas por enlaces glicosídicos de tipo β (1 → 3) y ramificaciones laterales unidas por enlaces β(1 → 6) (Pizarro et al. 2014). A pesar de presentar una composición simple de monosacáridos, los β-glucanos muestran una gran variabilidad estructural (Synytsya y Novak 2014). Esta variabilidad estructural les confiere diferentes propiedades fisicoquímicas como: masa molecular, longitud de sus cadenas (Wasser 2002), solubilidad (Xiao et al. 2004), frecuencia de ramificación (Miyazaki et al. 1979), estructuras y conformación en solución (Khan et al. 2018), que son los responsables de la actividad biológica y, por tanto, de su efecto sobre la salud humana.
El cultivo in vitro para producir el micelio, es una alternativa versátil y confiable para la obtención de biomasa mediante la recolección de esporomas de su entorno natural, ya que estas técnicas requieren menos espacio y tiempo de crecimiento, se reducen las posibilidades de contaminación (Bae et al. 2000; Abdullah et al. 2013) y se facilita la manipulación de las variables que afectan la producción, composición, calidad y eficiencia de la biomasa (Arango y Nieto 2013; Chegwin-Angarita y Nieto-Ramírez 2014).
Lycoperdon perlatum (Pers) 1796 (Lycoperdaceae) es un hongo comestible, valorado culturalmente como alimento de importancia nutricional en México (Burrola-Aguilar et al. 2012). Asimismo, en la medicina tradicional se le atribuyen propiedades curativas (Guzmán 1994) y se utiliza para tratar heridas, quemaduras, verrugas, picaduras de avispas o abejas (Guzmán 2008). Estudios científicos han demostrado que la actividad enzimática esterolítica de los esporomas silvestres de L. perlatum tiene aplicaciones en la síntesis de productos químicos para la industria farmacéutica (Colak et al. 2009), así como la actividad antioxidante y antimicrobiana de extractos de metanol (Ramesh y Pattar 2010) y actividad antiproliferativa en una línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 de extractos acuosos, etanólicos y hexánicos (Novaković et al. 2015). Sin embargo, existen pocos estudios relacionados con el cultivo in vitro y la bioactividad de los β-glucanos de L. perlatum. Debido al potencial biotecnológico que presenta L. perlatum y a los escasos estudios sobre la bioactividad de los compuestos presentes en esta especie, este trabajo tiene el objetivo de evaluar la producción de fracciones acuosas y alcalinas de β-glucanos a partir de micelio cultivado in vitro y en esporomas silvestres de L. perlatum.
Materiales y métodos
Obtención de biomasa
Material biológico. El micelio de L. perlatum se obtuvo a partir de la cepa IE987 depositada en el Instituto de Ecología A.C. Además, se utilizaron esporomas silvestres de L. perlatum, recolectados de bosques de Abies-Pinus a 3100-3400 msnm, en junio-agosto de 2019 en un bosque de alta montaña del Área de Protección de Flora y Fauna Nevado de Toluca (APFFNT), México.
Cultivo in vitro. Se inocularon discos impregnados con micelio de la cepa IE987 de L. perlatum (Díaz-Talamantes et al. 2017) en matraces de 500 mL con 300 mL de caldo de cultivo de maíz (formulado con 15 g L-1 de harina de maíz, 2 g L-1 de extracto de levadura y 1 g L-1 de peptona gelatina). Posteriormente, los matraces se incubaron durante 28 días bajo un fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, pH 6.4, agitación orbital a 150 rpm y una temperatura de 20 °C. Una vez finalizado el periodo de incubación, se filtró el micelio del caldo de cultivo, se lavó con agua destilada y se secó en un horno a 30 °C durante 48 horas. Se calculó la tasa de producción de biomasa (TPB, ecuación 1) y el contenido de agua (% de agua, ecuación 2). Finalmente, se utilizó la biomasa seca (BS) para la extracción de β-glucanos.
Esporomas. Los esporomas frescos (38.72 g) se caracterizaron e identificaron taxonómicamente de acuerdo a Franco-Maass et al. (2012). Posteriormente, se secaron en una estufa a 30 °C durante 48 horas, se calculó el contenido de agua (ecuación 2) y se molieron para obtener un polvo, que se utilizó para la extracción de β-glucanos.
Extracción y purificación de β-glucanos
Macerado de biomasa. La biomasa seca del micelio (1.70 g) y de los esporomas (5.82 g) se colocaron independientemente en un recipiente con 10 volúmenes de etanol al 70 % durante 24 horas; este procedimiento se realizó dos veces (Carbonero et al. 2006). Posteriormente, se eliminó el etanol mediante un filtro de papel de poro grueso y se recuperó la biomasa.
Extracción acuosa. La biomasa recuperada (micelio y esporomas) de la maceración se colocó en 10 volúmenes de agua destilada y la extracción se realizó en autoclave a 121 °C durante 60 min (Klaus et al. 2011). El extracto resultante se colocó en una parrilla a 100 °C durante una hora para disminuir el volumen de agua (Smiderle et al. 2013). Posteriormente, la biomasa se filtró sobre un papel de filtro con un poro de 125 µm, obteniendo una fracción acuosa en el filtrado y la biomasa sobrante en el residuo.
Extracción alcalina. La biomasa recuperada (micelio y esporomas) de la extracción acuosa se colocó en un recipiente con 10 volúmenes de una solución alcalina de NaOH al 2 % (p/v) con 0.1 % de NaBH4; la solución con la biomasa se calentó a 80 °C durante 4 horas. Posteriormente se agregó ácido acético al 99.9 % gota a gota hasta obtener un pH neutro (Klaus et al. 2011). La biomasa se filtró sobre un papel filtro de poros de 125 µm. Con esto se obtuvo una fracción alcalina en el filtrado (Mizuno et al. 1992) y se descartó el residuo de biomasa.
Precipitación de fracciones con etanol y congelación-descongelación. La fracción acuosa y la fracción alcalina se colocaron individualmente en un recipiente con 3 volúmenes de etanol frío (Smiderle et al. 2013) para deshidratar los polisacáridos y generar un precipitado, el cual fue recuperado (Mizuno et al. 1992; Carbonero et al. 2006). El precipitado obtenido de cada fracción contenía una cantidad significativa de residuos del proceso de extracción (agua y NaOH), por lo que se congeló y descongeló lentamente a temperatura ambiente; este proceso se repitió varias veces hasta que no hubo precipitado del sobrenadante. El precipitado se recuperó y se centrifugó a 8000 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 15 °C (Smiderle et al. 2013). El precipitado de la centrifugación se filtró sobre una membrana de acetato de celulosa con un poro de 0.2 µm. Finalmente, se obtuvieron cuatro precipitados: fracción acuosa de micelio (FAqM), fracción alcalina de micelio (FAkM), fracción acuosa de esporomas (FAqBF) y fracción alcalina de esporomas (FAkBF). Estos precipitados se utilizaron para su identificación.
Identificación de fracciones. Una muestra de cada fracción (0.1 g) se secó en estufa a 30 °C durante 48 horas hasta obtener cristales, los cuales se caracterizaron por FTIR bajo una absorbancia en el rango de 400- 4000 cm-1 mediante la técnica de disco KBr (Mizuno et al. 1992; Klaus et al. 2011) para identificar la presencia de enlaces característicos de los β-glucanos correspondientes a OH en 3200 cm-1, CH en 2922 cm-1, CO en 1644 cm-1(Alzorqi et al. 2017), además de las regiones asociadas a azúcares en un intervalo de 1200 cm-1 a 950 cm-1 y la región anomérica que va de 950 cm-1 a 750 cm-1(Synytsya y Novak 2014).
Resultados
Obtención de biomasa
El cultivo de micelio in vitro presentó un peso fresco de 40.87 g con 96.5 % de contenido de agua y BPR de 0.04 g L-1 día-1. Los esporomas de L. perlatum son pseudoestipitados redondos, de 3.5-7.5 cm de largo, de color blanco y crema, su hábitat suele ser terrícola o humícola, crece en bosques de Abies-Pinus a altitudes de 3100-3400 metros. Los esporomas presentaron un peso fresco de 38.72 g con 84.89 % de contenido de agua. Microscópicamente presentan basidiosporas de (3.0-) 3.77 (-4.0) μm, redondas y ligeramente espinuladas, correspondientes a las características de la especie (Franco-Maass et al. 2012).
Extracción y purificación de β-glucanos
El contenido total de β-glucanos presentes en el micelio fue de 11.50 g de β-glucanos por 100 g de biomasa seca, de los cuales 1.40 g de β-glucanos por 100 g de biomasa seca corresponden a FrAqM y 10.11 g de β-glucanos por 100 g de biomasa seca corresponden a FrAkM. En cuanto a los esporomas, se obtuvieron 13.80 g de β-glucanos totales por 100 g de biomasa seca, de los cuales, 2.36 g de β-glucanos por 100 g de biomasa seca corresponden a FrAqBF y 11.58 g de β-glucanos por 100 g de biomasa seca corresponde a FrAkBF.
Identificación de fracciones
Los espectros FTIR obtenidos de las fracciones correspondientes a FrAqM, FrAkM (Figura 1), FrAqBF y FrAkBF (Figura 2) concuerdan con el espectro de un β-glucano (Movasaghi et al. 2008), debido a que se observan las bandas características: una banda a 3200 cm-1 correspondiente a la región de las vibraciones de los enlaces OH, una banda correspondiente a 2922 cm-1 que se atribuye a la presencia de enlaces CH saturados (Figuras 1 y 2) (Šandula et al. 1999). El espectro de FrAqBF, FrAkBF (Figura 2) y FrAkM (Figura 1) mostró una señal de absorción a 1644 cm-1, que está relacionada con las vibraciones de estiramiento del enlace CO (carbonilo) de un complejo polisacárido-proteína (Alzorqi et al. 2017), debido a esto, los β-glucanos de estas fracciones podrían acoplarse a una proteína. De esta manera, las cuatro fracciones (Figuras 1 y 2) presentan las dos regiones fundamentales de los β-glucanos, la “región de azúcar” que va desde 1.200 cm-1 a 950 cm-1 y la “región anomérica” que va desde 950 cm-1 a los 750 cm-1 (Synytsya y Novak 2014). En estas regiones, se observan las bandas características de los enlaces carbono-glucósido del β-glucano correspondientes a 1160, 1080, 1040, 970 y 890 cm-1(Alzorqi et al. 2017). Por otro lado, en los espectros de las cuatro fracciones se observa una señal que va de 1160 a 1147 cm-1. Münzberg et al. (1995) menciona que esta señal representa el estiramiento del enlace glucosídico COC, donde la señal en 1040 cm-1 corresponde al estiramiento de CO. También menciona que la disminución de la señal de absorción a 1080 cm-1 y la desaparición de la señal a 890 cm-1 en las fracciones alcalinas FrAkM (Figura 1) y FrAkBF (Figura 2) debe ser una degradación del polisacárido en la base cadena.
Figura 1 Espectro FTIR de la fracción acuosa de micelio (FrAqM) y fracción alcalina del micelio (FrAkM) de L. perlatum.
Figura 2 Espectro FTIR de la fracción acuosa de esporomas (FrAqFB) y fracción alcalina de esporomas (FrAkFB) de L. perlatum.
La producción de β-glucanos en las fracciones obtenidas es similar entre el micelio y los esporomas. Sin embargo, se observa una mayor producción de β-glucanos en el FrAkM y FrAkBF correspondientes a la fracción alcalina.
Discusión
Actualmente existe una demanda creciente de hongos comestibles silvestres que brindan beneficios a la salud humana (Wasser 2002) como es el caso de L. perlatum. Además, es relevante destacar que existen pocos estudios relacionados con el cultivo in vitro de esta especie y en general de la familia Lycoperdaceae. Por tanto, es de gran importancia realizar más estudios biotecnológicos para la selección de cepas y optimización de las condiciones de cultivo in vitro (Song et al. 1998).
La producción in vitro de micelio de L. perlatum se vio afectada por diferentes factores como: el medio de cultivo utilizado a base de harina de maíz. Según Chegwin-Angarita y Nieto-Ramírez (2014) las fuentes de carbono no convencionales como las harinas de cereales tienden a incrementar la producción de biomasa. Wang et al. (2005) menciona que la relación carbono-nitrógeno para mejorar la producción de biomasa de hongos oscila entre 40:1; similar al que presenta un medio a base de harina de maíz (Chegwin-Angarita y Nieto-Ramírez 2014). Por ello, la relación carbono-nitrógeno proporcionada por el medio de cultivo utilizado podría ayudar a maximizar la producción de biomasa. Otros factores de importancia para el cultivo in vitro de L. perlatum son la temperatura entre 18 y 25 °C, y el pH mayor a 5.8 (Díaz-Talamantes et al. 2017). En este estudio, el crecimiento micelial mantuvo las condiciones óptimas para la producción de biomasa, la temperatura fue de 20 °C y el pH disminuyó de 6.4 a 6.1.
El contenido de agua es una variable primordial en la producción de metabolitos estructurales, ya que está directamente relacionado con el contenido de biomasa seca (Arango y Nieto 2013). Según Rathore et al. (2017) aproximadamente la mitad de la biomasa en peso seco de la pared celular de los basidiomicetos está constituida por metabolitos estructurales entre ellos β-glucanos. En este estudio, el micelio presentó 96.5 % de contenido de agua y los esporomas un 84.89 %, por lo que, los esporomas presentaron una mayor concentración de β-glucanos en la biomasa seca.
La producción de β-glucanos totales presentes en las fracciones de micelio (11.50 g de β-glucanos por 100 g de BS) y esporomas (13.80 g de β-glucanos por 100 g de BS) se encuentran en el rango reportado, como lo sugiere Sari et al. (2017), donde el contenido de β-glucanos en esporomas silvestres de L. perlatum fue de 15.48-19.749 g de β-glucanos por 100 g de BS.
Además, la concentración de β-glucanos presentes en las fracciones alcalinas FrAkM y FrAkBF fue mayor que la fracción acuosa FrAqM y FrAqBF. Según Tseng et al. (2008) esto se debe a que en el proceso de extracción las paredes celulares se degradan y los compuestos insolubles en agua se transforman en componentes solubles. Sin embargo, es importante mencionar que la fracción acuosa de β-glucanos normalmente tiene mayor bioactividad que las insolubles (Xiao et al. 2004).
Existen otros factores que pueden afectar la producción de biomasa y β-glucanos presentes en esporomas y micelio in vitro. De acuerdo a Papaspyridi et al. (2010) el micelio representa la fase vegetativa del hongo, mientras que los esporomas la fase reproductiva, y la función estructural de los β-glucanos en la pared celular varía en cada fase. De la misma manera, la producción de biomasa y la bioactividad de los β-glucanos también se ven afectada por la fuente de nutrientes. Según Ooi y Liu (2000) el sustrato natural donde se desarrollan los esporomas silvestres puede contener compuestos polifenólicos que inducen la síntesis de β-1,3-glucano sintasa, aumentando la producción de β-glucanos.
Reis et al. (2017) mencionan que los esporomas normalmente presentan mayor bioactividad que los sistemas in vitro, debido a que la composición química varía en relación a los nutrientes del sustrato.
Lycoperdon perlatum es un hongo saprobio (Rinaldi et al. 2008) tradicionalmente valorado como hongo medicinal (Guzmán 2008), se ha demostrado que es una especie viable para el cultivo in vitro (Díaz-Talamantes et al. 2017). Es importante desarrollar más estudios para conocer las variables que permitan maximizar la producción de biomasa y β-glucanos. Como por ejemplo el medio de cultivo, fuente de carbono, pH, temperatura y disponibilidad de oxígeno; además de la bioactividad de los β-glucanos y posibles aplicaciones medicinales, farmacéuticas y nutricionales; y conservación y manejo del recurso en su hábitat natural. Asimismo, es importante resaltar que existe una gran variabilidad en la estructura de β-glucanos presentes en hongos (Synytsya y Novak 2014), debido a esto, los β-glucanos de algunas especies presentan mayor bioactividad, especialmente aquellas especies con propiedades medicinales como L. perlatum.
Conclusiones
El cultivo in vitro de Lycoperdon perlatum es una alternativa viable para la producción de metabolitos de interés biotecnológico como los β-glucanos, debido a que la producción de biomasa en fermentación en estado líquido presenta una concentración de β-glucanos similar a la de los esporomas. Además, en el cultivo in vitro es posible controlar factores y variables que afectan la producción y calidad de biomasa y de β-glucanos, así como contar con el material biológico sin depender de su recolección, ayudando al manejo y conservación de este recurso en los bosques.
Por otro lado, la presencia de β-glucanos obtenidos tanto en el micelio in vitro como en los esporomas, son mayores en la fracción alcalina, esto debido a que el proceso de extracción se realiza con una solución salina que es más agresiva con la pared celular facilitando así su extracción.
Estos compuestos bioactivos son de gran importancia para futuras investigaciones médicas como inmunomoduladores, tratamiento contra diferentes tipos de cáncer y tumores, además de su aplicación como nutracéuticos en la industria alimentaria.
