El ensilaje constituye entre un 40 a 60 % en la ración de consumo diario en la dieta del ganado productor de carne y leche, la cantidad de ensilaje que recibe el ganado dependerá de la etapa de crecimiento o en la etapa productiva en la que se encuentra este. El ensilaje es forraje verde preservado por fermentación láctica espontánea en condiciones anaeróbicas ^{(Alpízar 2015)}. El propósito principal del ensilaje es maximizar la preservación de nutrientes originales del cultivo forrajero con pérdidas mínimas en la calidad nutricional ^{(Alonso et al. 2013)}. La contaminación por hongos es uno de los riesgos que se pueden presentar en alimentos almacenados, como es el caso del ensilaje ^{(Garon et al. 2006}; ^{Alonso et al. 2013)}. Un incremento fúngico en el ensilaje conduce a la pérdida de nutrientes y de materia seca, disminuyendo la palatabilidad y consumo, lo que genera pérdidas en el rendimiento en ganancia de peso y producción de leche del animal ^{(Alpízar 2015)}. La contaminación del alimento se da desde antes, durante y después de la cosecha, durante el transporte y almacenamiento, ya que los forrajes están en contacto directo con esporas de hongos toxicogénicos ^{(Carrillo 2003)}. Datos reportados por ^{Reyes-Velázquez et al. (2008)}, ^{Keller et al. (2012)} y ^{Alpízar (2015)}, indican que los hongos que se encuentran con mayor frecuencia en los ensilajes de maíz (Zea mays L.) pertenecen a los géneros : Mucor, Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Geotrichum. Otros autores como ^{Baliukoniene et al. (2012)} y ^{Keller et al. (2012)} reportan la presencia de los géneros de Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, en ensilaje de trébol (Trifolium repens L.), ryegrass (Lolium perenne L.), sorgo (Sorghum bicolor L.), triticale (Triticum aestivum L.), avena (Avena sativa L.) y mezcla de pastos en los países de Lituania y Brasil. En estudios realizados en ensilaje de Maíz y alfalfa (Medicago sativa L.) por ^{Bočarov-Stančić et al. (2014)} en Serbia, reportan la presencia de Penicillium spp., Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride, Geotrichum candidum, Paecilomyces variotii y Monascus ruber.

Monascus ruber Tiegh es un Ascomiceto, que se ha encontrado principalmente en cereales como trigo, avena, avena, cebada, maíz, centeno y arroz aunque también se ha reportado en aceituna (Olea europea L.); crece a una temperatura de 30-35 °C, con un pH de 3.7 a 7 ^{(Panagou et al. 2002}; ^{Iriart et al. 2010}; ^{Pascual et al. 2014)}. Las ascosporas de M. ruber pueden sobrevivir al proceso de pasteurización comercial y son tolerantes al cloruro de sodio ^{(Panagou et al. 2002}; ^{Iriart et al. 2010)}. Existen reportes médicos que señalan a M. ruber como agente causal de onicomicosis en pacientes geriátricos de la India y Marruecos ^{(Bouksir et al. 2018)}. Otro caso fue en la Guayana Francesa, un paciente de 66 años padeció una infección gástrica asociada al consumo de pescado seco y salado contaminado por el conservador a base de M. ruber ^{(Iriart et al. 2010)}; en otro caso, un paciente de EE.UU. de 70 años fue intervenido quirúrgicamente a cusa de cálculos renales y se describió que la afección renal fue ocasionada por M. ruber ^{(Bouksir et al. 2018)}.

Monascus ruber es utilizado en la cultura china como un colorante natural, en productos alimenticios como saborizante, aditivo para la preservación de carne, vino, queso y pescado y en la industria farmacéutica ^{(Wang y Lin 2007)}. Por otra parte, ^{Wang et al. (2017)} hacen referencia que M. ruber es capaz de producir una micotoxina llamada citrinina que ataca principalmente el riñón, causando nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, teratogenicidad y puede, además, causar mutaciones provocando tumores y muerte tanto en humanos como en animales; en este mismo estudio los autores determinaron que la dosis letal media (LD50) en ratones es de 110 mg/kg pv y que la toxicidad de citrinina está al mismo nivel que la aflatoxina B1. En esta investigación tuvo como objetivo reportar por primera vez en México la presencia de Monascus ruber en ensilaje de maíz y alfalfa.

Las cepas se obtuvieron a partir de 16 muestreos de ensilaje de maíz (12 muestras) y alfalfa (4 muestras) en los estados de Aguascalientes, Zacatecas, Guanajuato y Jalisco. El muestreo se realizó entre noviembre-diciembre del 2017 y abril-mayo del 2018, utilizando la tecnica “W”, tomando submuestras en cinco puntos diferentes del ensilaje de un peso promedio de 1 kg. El sustrato se homogenizó y se extrajo una sola muesta de los cinco puntos de acuerdo al método de ^{Bautista y Santos (2004)}. Se realizaron aislamientos de cada una de las muestras del ensilaje de maíz y alfalfa; estos fueron identificados morfologicamente y molecularmente. Para la identificación morfológica las muestras se desinfectaron con hipoclorito sodio al 3 % durante 1 minuto, se enjuagaron en tres ocasiones con agua destilada estéril e inocularon en placas de Petri con medio de papa dextrosa agar (PDA) acidificado (200 μL de ácido láctico al 85 %), se incubaron a 27 ºC ± 2 por 7 días. Con la finalidad de obtener un cultivo puro, se tomaron explantes del borde de los distintos tipos y coloraciones de micelio de los diferentes hongos generados, se inocularon en placas petri con medio PDA acidificado y se incubaron por 12 a 24 horas a 27 °C, para después purificar los hongos por la técnica de punta de hifa. Se incubaron a 27 °C durante el tiempo en que tardó en desarrollar las estructuras reproductivas necesarias para la identificación del hongo. En los cultivos puros, se realizaron tinciones miceliales con azul de lactofenol, tomando porciones de micelio con esporas, las cuales se observaron al microscopio con el aumento 10x y 40x y fueron identificados con base en las claves de ^{Barnett y Hunter (1998)} (Figura 1).

Figura 1 Características morfológicas de Monascus ruber. a: coloración rojiza y apelmazamiento del hongo, observada en la muestra de ensilaje de maíz. b: muestra del ensilaje de alfalfa donde se aprecia el apelmazamiento y tonalidad rojiza característica de M. ruber. c: crecimiento del hongo en agar PDA. d: cadenas de conidios (objetivo 40x). e: ascomatas (objetivo 40x). f: ascospora (objetivo 100x). 

Para la identificación molecular, mediante la técnica PCR, se relizó una extracción de ADN de las cepas aisladas mediante el método de ^{Doyle y Doyle (1990)}. La concentración y la pureza fueron determinadas por espectrofotometría y electroforesis. Posteriormente se desarrolló el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las regiones internas transcritas ITS1 e ITS4 entre los genes ribosomales (rDNA) 18S - 5.8S y 5.8S - 28S utilizando el par de iniciadores de secuencia ITS1 (5´- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´). En la reacción se utilizó Taq&GO Mastermix (1.5 mM MgCl₂, 200 µM DN-TP´s) siguiendo recomendaciones del fabricante (MP^®); 0.5 µL de ITS1 a 20 µM; 0.5 µL de ITS4 a 20 µM; 1 µL de DNA problema ajustado a 100 ng y agua bidestilada estéril para aforar a 15 μL. Las condiciones de la reacción de PCR fueron: 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 10 segundos, 30 ciclos de alineamiento a 57 °C por 30 segundos, 30 ciclos de extensión a 72 °C por 2 min. y 1 ciclo de extensión final a 72 °C por 5 min. La amplificación se visualizó en un gel de agarosa al 1 % mediante electroforesis (Figura 2)

Figura 2 Amplificación ITS1-ITS4, visualización en gel de agarosa 1 %. (MrA) M. ruber en de ensilaje de alfalfa (1), M. ruber en muestras de ensilaje de maíz (2, 3 ,4 y 5). 

El producto de PCR se envió a secuenciar a Macrogen Maryland EUA. Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias reportadas en la base de datos del banco de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information) de EUA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), mediante el uso del programa BLAST; dando como resultado de un 95 % a un 97 % de similaridad con Monascus ruber (Tabla 1).

Con todo lo anterior se realizó búsqueda exhaustiva para tener referencia de este hongo en México y no se encontró más que para la industria alimenticia, debido a que este hongo es utilizado como colorante y se hallaron reportes de países asiáticos, donde varias especies de Monascus son utilizadas desde hace mil años en China ^{(Wang et al., 2017)}. Estos resultados también coinciden con ^{Garon et al. (2006)}, en estudio realizado en ensilaje de maíz en Francia, otros países que lo reportan son Japón, Estados Unidos, Serbia y Malaysia ^{(Wang et al., 2017)}. Cabe señalar que ^{Bočarov, et al. (2014)} realizaron estudios en Serbia en ensilaje de maíz y alfalfa donde se encontró la presencia de Monascus spp. Con base a la búsqueda que se realizó y con respecto a los reportes señalados, este es el primer reporte de Monascus ruber en ensilaje de maíz y de alfalfa, que se hace en la República Mexicana.